鐵死亡相關(guān)基因DPP4與腫瘤免疫及預(yù)后的生物信息學(xué)研究①

陳 靜 張尚暖（山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250117）

鐵死亡是近年發(fā)現(xiàn)與鐵依賴性相關(guān)的以細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積為特征的細(xì)胞死亡形式，不屬于細(xì)胞凋亡范疇［1］。鐵死亡在很多病理過程中作為應(yīng)激反應(yīng)對(duì)很多腫瘤抑制因子發(fā)揮促進(jìn)作用，可能用于腫瘤臨床治療［2-3］。研究證實(shí)，部分已發(fā)生耐藥的腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡仍有高度敏感性，對(duì)腫瘤治療有重要作用［4-5］。DPP4（dipeptidyl peptidase-4）又稱為T 細(xì)胞表面抗原CD26，DPP4-NOX 結(jié)合是鐵死亡中脂質(zhì)過氧化作用必需的關(guān)鍵因子，其異常表達(dá)與腫瘤形成發(fā)展密切相關(guān)［6］。泛癌分析可通過整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對(duì)腫瘤進(jìn)行綜合分析，尋找目的基因組在不同腫瘤的表達(dá)相關(guān)性。盡管目前已對(duì)DDP4 進(jìn)行了某些腫瘤相關(guān)研究，但對(duì)其在不同腫瘤之間的研究尚缺乏全面分析?？紤]到鐵死亡相關(guān)基因DPP4 與腫瘤存在相關(guān)性，本研究擬對(duì)鐵死亡相關(guān)基因DPP4進(jìn)行泛癌分析，探討其在不同腫瘤中的表達(dá)情況，并進(jìn)行生存預(yù)后分析，重點(diǎn)分析其在腫瘤免疫方面的功能，以期為臨床腫瘤診斷、治療及預(yù)后提供靶向生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與預(yù)處理 從GTEx 數(shù)據(jù)庫下載31 個(gè)正常組織轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)作為研究對(duì)照組；從CCLE 數(shù)據(jù)庫下載21 個(gè)腫瘤細(xì)胞系數(shù)據(jù)，從TCGA數(shù)據(jù)庫下載33種腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時(shí)下載相應(yīng)患者的臨床信息、腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等信息。TCGA中全部腫瘤類型縮寫見表1。

表1 TCGA中全部腫瘤類型縮寫Tab.1 Abbreviation for all tumor types in TCGA

1.2 DPP4 表達(dá)分析 采用R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，提取CCLE 數(shù)據(jù)庫和TCGA 數(shù)據(jù)庫中DPP4 表達(dá)數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)比較不同細(xì)胞系中DPP4 表達(dá)；采用Wilcoxon 檢驗(yàn)比較TCGA 數(shù)據(jù)庫中正常組和腫瘤組DPP4表達(dá)差異。

1.3 生存分析 采用單因素Cox 回歸分析評(píng)估TCGA 數(shù)據(jù)庫不同腫瘤中DPP4 基因表達(dá)與患者生存期的相關(guān)性；根據(jù)DPP4 基因表達(dá)中位值將患者分為DPP4高表達(dá)組與DPP4低表達(dá)組，Kaplan-Meier繪制每種腫瘤患者的生存曲線，log-rank檢驗(yàn)分析生存狀況。

1.4 免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和綜合評(píng)分生成 使用“CIBERSORT”算法計(jì)算TIMER 數(shù)據(jù)庫中每種腫瘤免疫細(xì)胞浸潤情況。使用“ESTIMATE”軟件包計(jì)算基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分及總評(píng)分評(píng)估患者腫瘤微環(huán)境。使用Spearman 檢驗(yàn)從基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分、免疫新抗原、腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等方面評(píng)估DPP4基因表達(dá)與不同指標(biāo)的相關(guān)性。

1.5 功能和通路富集分析 利用GSEA 軟件分析DPP4 基因表達(dá)與信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)性，從MSigDB 數(shù)據(jù)庫已知數(shù)據(jù)集中選擇HALLMARK（特征基因集合，共50 組）及C2（curated gene sets，專家共識(shí)基因集合中KEGG）進(jìn)行分析，一般認(rèn)為|NES|>1，NOMP<0.05，F(xiàn)DRq<0.25 的通路顯著富集，對(duì)應(yīng)其峰值右側(cè)的基因?yàn)樵摶蚣暮诵幕颉?/p>

1.6 DPP4表達(dá)驗(yàn)證 通過人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫中GSE12771、GSE109169、GSE103512數(shù)據(jù)集對(duì)DPP4表達(dá)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPP4 在腫瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá) DPP4基因在21類細(xì)胞系中均檢測到表達(dá)，其中在腎臟腫瘤、腸道腫瘤、胸膜腫瘤等13類細(xì)胞系中表達(dá)較高，在骨腫瘤、乳腺腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等8 類細(xì)胞系中表達(dá)較低（圖1A）。與正常組織相比，BRCA、COAD 及UCEC 等22 種腫瘤中DPP4 表達(dá)差異顯著（P<0.001），KIRP 中表達(dá)存在一定差異（P<0.05），在BLCA、HNSC、CESC及OV 4種腫瘤中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；其中，在表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的23 種腫瘤中，DPP4 在ESCA、LUAD 等16 種腫瘤中呈高表達(dá)，在KICH、SKCM等7種腫瘤中呈低表達(dá)（圖1B）。

圖1 DPP4在腫瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of DPP4 in tumor cell lines and tissues

2.2 DPP4表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系 單因素生存分析結(jié)果顯示：DPP4 表達(dá)升高在PCPG（HR=0.61，P<0.001）、THYM（HR=0.92，P<0.001）中可作為顯著的保護(hù)因素，對(duì)腫瘤預(yù)后有正向作用（圖2A）。10種差異顯著的腫瘤預(yù)后Kaplan-Meier 曲線中，DPP4 基因高表達(dá)在ACC、DLBC、LGG、BRCA、LAML、PRAD中與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，表明DPP4 高表達(dá)與ACC、DLBC、LGG、BRCA、LAML、PRAD 6 種腫瘤的不良OS 相關(guān)，且可降低腫瘤患者生存率；而在KIRP、THCA、KIRC、THYM 中DPP4 高表達(dá)與生存時(shí)間呈正相關(guān)，且可提高腫瘤患者生存率（圖2B～K）。

圖2 DPP4 在33 種腫瘤中表達(dá)與總體生存期關(guān)系的Kaplan-Meier圖及單因素生存分析森林圖Fig.2 Kaplan-Meier plot and univariate survival analysis forest plot of relationship between DPP4 expression and overall survival in 33 tumors

2.3 DPP4 基因在腫瘤中的表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系 BLCA、BRCA、CESC 與6 種免疫細(xì)胞（B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞）浸潤密切相關(guān)（圖3A），說明DPP4基因表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤關(guān)系密切；此外，結(jié)果顯示DPP4 在BLCA、BRCA、PCPG 3 種腫瘤中評(píng)分最高，且呈正相關(guān)（圖3B）。同時(shí)收集常見的40 多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因，Spearman 相關(guān)性分析研究DPP4基因表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)關(guān)系，分別提取這些免疫檢查點(diǎn)基因，計(jì)算與目標(biāo)基因表達(dá)的相關(guān)性（圖3C），DPP4 基因表達(dá)與NRP1、HAVCR2、CD86等多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因高度相關(guān)（P<0.01）。

2.4 DPP4基因表達(dá)與免疫新抗原、腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系 DPP4 在GBM、BRCA、KIRP、CESC 中與腫瘤新生抗原個(gè)數(shù)相關(guān)（P<0.05，圖4），增加了腫瘤的免疫原性；DPP4 表達(dá)與UCEC、THYM、SARC、PRAD、OV、LUSC、LAVL、KIRP、ESCA、COAD 10 種腫瘤突變存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P<0.05，圖5A），在ESCA 中呈顯著正相關(guān)（P<0.001），在THYM 中呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.001）；DPP4 表達(dá)與UCS、TGCT、SKCM、PRAD、LUSC、LUAD、KIRC、HNSC、ESCA、DLBC、COAD 11種腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)，與COAD 呈顯著正相關(guān)（P<0.001），與DLBC呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.001，圖5B）。

2.5 DPP4 高低表達(dá)組GSEA 分析 GSEA 分析顯示，KEGG分析中，病毒性心肌炎、哮喘及FcεRⅠ信號(hào)通路3 者基因集顯著聚集于高表達(dá)組，維生素A代謝、苯基丙氨酸代謝、酪氨酸代謝及細(xì)胞色素P450 對(duì)異生物質(zhì)代謝等通路富集于低表達(dá)組（P<0.05，圖6）。HALLMARK 通路分析中，炎癥反應(yīng)、干擾素α 反應(yīng)及IL6-JAK-STAT3 通路基因富集于DPP4 高表達(dá)組；而G2M 檢查點(diǎn)、雌激素反應(yīng)性晚期、E2F 靶點(diǎn)及活性氧通路4 個(gè)通路基因集于DPP4低表達(dá)組富集。

圖6 DPP4差異表達(dá)組KEGG 和HALLMARK 通路GSEA富集Fig.6 GSEA enrichment of KEGG and HALLMARK pathways in DPP4 differential expression groups

2.6 免疫組化和測序數(shù)據(jù)證實(shí)DPP4 在肺癌、乳腺癌、直腸癌和前列腺癌中表達(dá)存在差異 通過檢索人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫分析正常組織和癌組織中DPP4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和直腸癌中，DPP4 呈顯著高表達(dá)；通過檢索TCGA 數(shù)據(jù)庫和GEO 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)腫瘤測序結(jié)果，對(duì)DPP4 基因表達(dá)量進(jìn)行比較，肺癌、前列腺癌、直腸癌中DPP4 呈顯著高表達(dá)，而在乳腺癌中表達(dá)降低（圖7）。

圖7 DPP4 在肺癌（A）、乳腺癌（B）、直腸癌（C）及前列腺癌（D）中差異表達(dá)Fig.7 Differential expression of DPP4 in lung cancer（A），breast cancer（B），rectal cancer（C）and prostate cancer（D）

3 討論

目前鮮有關(guān)于DPP4 作為腫瘤標(biāo)志物的研究，已有研究證實(shí)腫瘤與鐵死亡關(guān)系密切，且鐵死亡在腫瘤侵襲中的作用已成為研究熱點(diǎn)之一［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因P53 可通過促進(jìn)DPP4 進(jìn)入細(xì)胞核并形成DPP4-P53 復(fù)合物抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡［9］。抑制DPP4表達(dá)可顯著抑制鐵死亡，尤其在P53敲除的細(xì)胞中［10］。DPP4 與T 細(xì)胞密切相關(guān)［11］?；阼F死亡在腫瘤診斷治療方面的優(yōu)勢，鐵死亡相關(guān)的DPP4 基因可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為一種潛在的泛癌生物標(biāo)志物。

基于生物信息學(xué)分析，DPP4在不同腫瘤細(xì)胞系中存在差異表達(dá)；除BLCA、HNSC、CESC 及OV 4 種腫瘤外，其他腫瘤組織中均存在差異表達(dá)，與DPP4蛋白作用密切相關(guān)。研究表明DPP4 在T 細(xì)胞活化中起作用，且與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡有關(guān)，參與腫瘤生物學(xué)過程，至少有63 種底物能與DPP4 酶特異結(jié)合，包括生長因子、趨化因子、神經(jīng)肽等［12］。此外，DPP4通過切割腸促胰島素樣多肽和胰高血糖素樣肽-1 等腸促胰島素在葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用。將DPP4 作為主要統(tǒng)計(jì)因素，其在不同腫瘤中總體生存率存在較大差異，表明DPP4 可用于腫瘤預(yù)后評(píng)估，具有作為泛癌標(biāo)志物的潛力。

為探究DPP4 如何在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，本研究從腫瘤免疫、腫瘤突變及相關(guān)信號(hào)通路3 方面進(jìn)行DPP4 生物功能分析，在腫瘤免疫方面，DPP4 參與BLCA、BRCA、CESC 3 種腫瘤免疫調(diào)節(jié)。免疫評(píng)分作為標(biāo)志物對(duì)腫瘤患者治療及預(yù)后可提供有價(jià)值的預(yù)測已越來越受關(guān)注［13］。本研究證實(shí)在BLCA、BRCA、PCPG 中DPP4 與免疫微環(huán)境呈正相關(guān)。DPP4 基因表達(dá)可能參與腫瘤多種免疫細(xì)胞浸潤，且與腫瘤免疫成分、基質(zhì)成分密切相關(guān)，Spearman 相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí)DPP4 與多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因高度相關(guān)，提示DPP4 可能是多數(shù)腫瘤中調(diào)節(jié)免疫成分的潛在指標(biāo)，在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用為尋找更有效的腫瘤免疫治療方案提供了新觀點(diǎn)。腫瘤突變方面，DPP4在GBM、BRCA、KIRP、CESC 中與腫瘤新生抗原個(gè)數(shù)相關(guān)，增加了腫瘤的免疫原性，與DPP4 在免疫微環(huán)境中的作用非常相似，說明DPP4可作為很好的免疫治療靶點(diǎn)；另外發(fā)現(xiàn)DPP4 在UCEC、THYM、SARC、PRAD、OV、LUSC、LAVL、KIRP、ESCA、COAD 10 種腫瘤中明顯突變，與腫瘤突變負(fù)荷明顯相關(guān)；在UCS、TGCT、SKCM、PRAD、LUSC、LUAD、KIRC、HNSC、ESCA、DLBC、COAD 中與微衛(wèi)星不穩(wěn)定顯著相關(guān)。已證實(shí)腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定可預(yù)測患者多種藥物反應(yīng)，尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑［14-16］。研究表明，高腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定與良好的免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物反應(yīng)相關(guān)［17-19］。提示DPP4 也可用于預(yù)測腫瘤免疫治療應(yīng)答，可作為藥物治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。為進(jìn)一步研究DPP4 在腫瘤中高低表達(dá)與信號(hào)通路的相關(guān)性，GSEA 富集分析結(jié)果表明DPP4 高低表達(dá)組KEGG 通路主要集中于維生素A、酪氨酸等物質(zhì)代謝通路，HALLMARK 通路主要富集于炎癥反應(yīng)通路，而這些通路中有些已證實(shí)與鐵死亡通路密切相關(guān)［20］。為證實(shí)上述結(jié)果的可靠性，經(jīng)人類蛋白質(zhì)圖譜檢索結(jié)果得出肺癌、乳腺癌、前列腺癌和直腸癌中DPP4 表達(dá)具有顯著差異，且TCGA 和GEO 中的測序結(jié)果也與其相互印證，雖然目前圖譜中涉及的DPP4 癌組織僅有4 種，但為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DPP4 的泛癌標(biāo)志物作用指明了方向。

綜上，鐵死亡相關(guān)基因DPP4 具有潛在的免疫調(diào)節(jié)能力，可通過物質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等相關(guān)通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可作為潛在的泛癌生物標(biāo)志物用于腫瘤免疫輔助治療及預(yù)后評(píng)估。