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      人參皂苷衍生物AD-1 通過抑制NLRP3 炎癥小體活化改善TNBS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD①

      2023-11-30 02:08:46李佳威黃勝男韓園園姜天意朱婧堯李芳芳
      中國免疫學(xué)雜志 2023年11期
      關(guān)鍵詞:皂苷人參結(jié)腸

      蘇 超 包 闊 李佳威 黃勝男 韓園園 姜天意 朱婧堯 李芳芳 金 丹

      (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,延吉 133002)

      炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩?。–rohn′s disease,CD),是腸道的慢性炎癥性疾病,其發(fā)病率呈上升趨勢(shì),病因尚不明確,但一般認(rèn)為其是遺傳、環(huán)境、腸道微生物群和免疫異常引起的多因素疾?。?-2]。如果控制不好,隨著時(shí)間的推移,復(fù)發(fā)的炎癥可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果,如組織纖維化、瘺管甚至癌變[3-4]。用于治療IBD 的藥物主要有5-氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑等,盡管種類繁多,但副作用明顯、不能長期使用等問題限制了其應(yīng)用[5-6]。

      人參作為一種傳統(tǒng)的中草藥,已被廣泛用于保健和治療某些慢性病[7]。人參皂苷為人參的主要活性成分,具有降血糖、抗癌、抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)活性的作用[8]。AD-1[20(R)-25-甲氧基-達(dá)瑪烷-3β,12β,20-三醇]是從人參果實(shí)中提取的新型人參皂苷衍生物。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)AD-1 有減輕葡聚糖硫酸鈉(dextra sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的慢性IBD小鼠腸道炎癥的作用,但對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性IBD模型的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。關(guān)于人參抗炎機(jī)制方面,有研究表明人參皂苷Rk3 通過保護(hù)結(jié)腸屏障和抑制NLRP3 炎癥小體通路減輕小鼠IBD[9]。人參皂苷Rd 通過抑制NLRP3 炎癥小體活化改善IBD[10]。基于以上研究背景,探討AD-1 是否對(duì)急性IBD 具有治療作用,以及改善小鼠結(jié)腸炎癥程度的可能機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8 周齡的雄性C57BL/6 小鼠(合格證號(hào):202200042522)購于延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,在恒溫20~25 ℃條件下飼養(yǎng),光/暗周期為12 h。該實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)通過延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查(YD20230912001)。

      1.1.2 主要試劑 AD-1由沈陽藥科大學(xué)趙余慶教授饋贈(zèng);TNBS(P2297)購于美國Sigma 公司;Oligo(dT)(C1101)購于美國Promega 公 司;rTaq 酶(R500Z)購于日本TaKaRa 公司;PCR 引物由Invitrogen 公司合成;Caspase-1(ab179515)、NLRP3(ab214185)、IL-18(ab207323)、ZO-1(ab276131)、Occludin(ab216327)等一抗購于美國Abcam 公司;ASC(67824S)、IL-1β(12703S)、IL-6(12912S)、TNF-α(11948S)、β-actin(8457S)等一抗購于美國CST公司;HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗(ZB-2301)購于中國中杉金橋公司;羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose,CMC)購于上海麥克林生化科技股份有限公司(C798844);ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)公司。

      1.2 方法

      1.2.1 小鼠急性IBD 模型的建立 6~8 周齡的雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control)、乙醇對(duì)照組(Alcohol)、模型組(TNBS)、治療組(TWBS+AD-1)和陽性對(duì)照組(TNBS+5-ASA),每組10只,后3組于造模前7 d采用1%TNBS 乙醇溶液涂抹皮膚進(jìn)行預(yù)敏化處理,即先將小鼠進(jìn)行剃毛處理,暴露出皮膚,每日在皮膚同一區(qū)域上進(jìn)行涂藥,每只小鼠涂抹0.1 ml。造模日于禁食12 h 后采用2.5%TNBS 乙醇溶液灌腸給藥建立急性IBD 模型,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)報(bào)道的方案進(jìn)行了一些修改[11-13],并通過課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的摸索來制定此造模方案。灌腸前用乙醚進(jìn)行麻醉,然后將一根柔性導(dǎo)管插入肛門到達(dá)結(jié)腸部位,每只小鼠注入100 μl,正常對(duì)照組和乙醇對(duì)照組采用上述同樣的方法,灌入相同體積的生理鹽水和25%乙醇溶液,全程進(jìn)行1 次灌腸操作處理。治療藥AD-1(10 mg/kg)和陽性對(duì)照藥物5-ASA(30 mg/kg)分別溶于0.5%CMC 中,于灌腸造模后的第2天進(jìn)行灌胃給藥,正常對(duì)照組和乙醇對(duì)照組分別灌胃CMC,每只小鼠灌胃200 μl,灌胃時(shí)間為連續(xù)4 d,第6天處死小鼠。

      1.2.2 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)[14]對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀及血便情況進(jìn)行觀察并記錄,糞便正常計(jì)0分,糞便軟并帶有潛血計(jì)1 分,糞便松散并帶血計(jì)2 分,腹瀉并便血計(jì)3 分。體質(zhì)量不下降計(jì)0 分,體質(zhì)量下降1%~5%計(jì)1分,體質(zhì)量下降5%~10%計(jì)2分,體質(zhì)量下降10%~15%計(jì)3 分(DAI=體質(zhì)量變化評(píng)分+糞便形狀及血便評(píng)分)。

      1.2.3 蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織的病理變化 第6天脫頸處死小鼠,取小鼠結(jié)腸組織采用10%甲醛固定24 h,石蠟包埋,切片厚度為4 μm,HE 染色后,顯微鏡觀察小鼠結(jié)腸組織病理的變化。

      1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)結(jié)腸組織炎癥因子基因的表達(dá) 采用TRIzol裂解液裂解結(jié)腸組織提取總RNA,合成cDNA,按照95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s;58 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s;72 ℃ 5 min;35個(gè)循環(huán)的程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增,配制1.5%瓊脂糖凝膠,電泳,全自動(dòng)成像儀顯影,采用Image J 軟件分析條帶密度。引物序列見表1。

      表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

      1.2.5 Western blot 法檢測(cè)結(jié)腸組織相關(guān)蛋白表達(dá) 采用RIPA 裂解液裂解結(jié)腸組織提取總蛋白,BCA 法檢測(cè)蛋白濃度,10%SDS-PAGE 凝膠電泳下分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,室溫下于5%脫脂牛奶中封閉1 h,在4 ℃下與一抗孵育過夜,然后用1×TBST 洗膜4 次。室溫下與二抗孵育1 h,1×TBST洗膜4 次,凝膠成像儀顯影拍照。Image J 軟件分析條帶密度。

      1.2.6 ELISA 檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子的含量

      第6天脫頸處死小鼠前取小鼠眼球血并分離出血清,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入96 孔板,加入酶標(biāo)記抗體工作液,37 ℃孵育1 h,然后棄去液體,洗板5次,加入顯色劑15 min 后,加入終止液,用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測(cè)量各孔的OD值,最后計(jì)算出樣品的濃度。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad prism7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以表示,組間均數(shù)差異比較采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠DAI 評(píng)分和結(jié)腸長度的影響 在實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠DAI評(píng)分,與TNBS 組[(5.84±0.06)分]比較,TNBS+AD-1 組[(3.84±0.05)分]和TNBS+5-ASA 組[(4.3±0.08)分]小鼠在第4 天DAI 評(píng)分顯著降低(P<0.01)。AD-1 可以減輕TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠腹瀉、血便情況(圖1A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集小鼠的結(jié)腸測(cè)量結(jié)腸長度,Control 組平均結(jié)腸長度為(7.57±0.05)cm,Alcohol 組平均結(jié)腸長度為(7.47±0.05)cm,TNBS組平均結(jié)腸長度為(5.67±0.12)cm,TNBS+AD-1 組平均結(jié)腸長度為(6.77±0.12)cm,TNBS+5-ASA 組平均結(jié)腸長度為(6.64±0.09)cm。與Control組和Alcohol組相比,模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短(P<0.001);與模型組相比,AD-1+TNBS組和5-ASA+TNBS 組小鼠結(jié)腸長度增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AD-1 可以改善TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD小鼠結(jié)腸長度縮短的情況(圖1B)。

      圖1 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠DAI 評(píng)分和結(jié)腸長度的影響Fig.1 Effects of AD-1 on DAI score and colon length in TNBS-induced acute IBD mice

      2.2 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織炎癥病理影響 HE 染色生物光學(xué)顯微鏡,與正常組和乙醇對(duì)照組相比,模型組炎癥細(xì)胞浸潤增加,上皮缺失、隱窩結(jié)構(gòu)破壞增加以及杯狀細(xì)胞減少;與模型組相比,AD-1治療組和陽性對(duì)照組小鼠結(jié)腸炎癥病理有較好的改善(圖2)。

      圖2 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織炎癥的病理影響Fig.2 Effect of AD-1 on inflammatory pathology of colon tissue in TNBS-induced acute IBD mice

      2.3 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的影響 與正常組和乙醇對(duì)照組相比,模型組結(jié)腸組織IL-6、TNF-α 表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與模型組相比,治療組和陽性對(duì)照組的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α 表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。AD-1 可下調(diào)促炎因子的表達(dá),改善TNBS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD(圖3)。

      圖3 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effects of AD-1 on tissue proinflammatory cyto kines in colon of TNBS-induced acute IBD mice

      2.4 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)的影響 與正常組和乙醇對(duì)照組比較,模型組ZO-1 和Occludin 表達(dá)明顯降低(P<0.001);與模型組相比,治療組ZO-1 和Occludin 的表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);陽性對(duì)照組ZO-1 與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如圖4。提示AD-1 具有促進(jìn)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 蛋白恢復(fù)的作用。

      圖4 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of AD-1 on expressions of ZO-1 and Occludin proteins in colon tissue of TNBS-induced acute IBD mice

      2.5 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織NLRP3 炎癥小體以及IL-1β、IL-18 表達(dá)的影響 與正常組和乙醇對(duì)照組比較,模型組ASC、Caspase-1、NLRP3 的表達(dá)水平明顯升高(P<0.001);與模型組相比,治療組和陽性對(duì)照組的表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明AD-1 可抑制NLRP3炎癥小體的激活(圖5A、B)。與正常組和乙醇對(duì)照組相比,模型組IL-1β、IL-18 的表達(dá)水平顯著升高(P<0.001);與模型組相比,治療組和陽性對(duì)照組IL-1β、IL-18 的表達(dá)水平降低,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AD-1 可能通過抑制NLRP3 炎癥小體進(jìn)而下調(diào)下游炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平(圖5C、D)。

      2.6 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠血清中IL-1β 和IL-18 的影響 模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18 含量高于正常組和乙醇對(duì)照組(P<0.01,P<0.05);治療組和陽性對(duì)照組小鼠血清中IL-1β、IL-18表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AD-1 可能通過降低TNBS誘導(dǎo)的急性IBD小鼠血清中IL-1β和IL-18水平,改善小鼠的急性炎癥(圖6)。

      3 討論

      IBD 是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚的慢性非特異性腸道疾病,其特點(diǎn)是炎癥無法消退,可導(dǎo)致腸道纖維化、狹窄甚至梗阻[15]。IBD 在工業(yè)化國家的發(fā)病率正在穩(wěn)步上升,而發(fā)展中國家的發(fā)病率在過去幾十年里迅速上升[16]。該病發(fā)病機(jī)制與腸道中上皮屏障、共生菌群、抗原識(shí)別、免疫反應(yīng)失調(diào)、白細(xì)胞募集和遺傳等因素相關(guān)[17]。通過將化學(xué)物質(zhì)TNBS 輸送到小鼠體內(nèi)所建立的結(jié)腸炎癥模型,其臨床表現(xiàn)與人類的IBD相似,如進(jìn)行性體重減輕、腹瀉、便血、腸道破壞,腸壁增厚、彌漫性壞死和腸道中性粒細(xì)胞浸潤等[18]。

      人參皂苷是人參的主要成分之一,已被證實(shí)具有良好的抗炎和抗腫瘤作用[19-20]。人參皂苷在治療IBD 方面已有較多的研究報(bào)道,如人參皂苷Rd 通過NF-κB 通路抑制小鼠促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,減輕DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD[21]。人參皂苷Rh2 通過調(diào)節(jié)STAT3/miR-214 通路緩解DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD[22]。人參皂苷Rg1 通過調(diào)節(jié)Tfh/Treg 細(xì)胞的平衡緩解TNBS 誘導(dǎo)的小鼠IBD[23]。人參皂苷Rb1 通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的E3 泛素連接酶Hrd1 信號(hào)通路減輕TNBS 誘導(dǎo)的小鼠IBD[24]。課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)AD-1 對(duì)DSS 誘導(dǎo)的慢性IBD 小鼠有減輕腸道炎癥作用,但對(duì)于TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性IBD模型的相關(guān)研究尚未見報(bào)道,因此建立TNBS誘導(dǎo)的急性IBD小鼠模型,探討AD-1對(duì)其的影響及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示,模型組小鼠的DAI評(píng)分明顯增加,包括小鼠體質(zhì)量減輕、腹瀉及便血情況;模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短,結(jié)腸黏膜嚴(yán)重的水腫、壞死、杯狀細(xì)胞減少以及炎癥細(xì)胞浸潤。而AD-1 和5-ASA 處理的小鼠體質(zhì)量上升,腸道內(nèi)容物檢查所見,糞便顆粒結(jié)構(gòu)良好,結(jié)腸長度明顯增加,結(jié)腸組織病理得到較好的改善。以上結(jié)果證明人參皂苷AD-1可改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的臨床表現(xiàn),包括體質(zhì)量減輕、腹瀉、結(jié)腸縮短和組織病理學(xué)損傷。

      TNF-α 和IL-6 在IBD 的病理生理過程中起重要作用[25]??烧{(diào)節(jié)黏膜免疫系統(tǒng),改變上皮完整性,協(xié)調(diào)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤和激活,從而導(dǎo)致結(jié)腸損傷。有研究報(bào)告,TNF-α 和IL-6 高表達(dá)可能導(dǎo)致UC 患者黏膜屏障功能缺陷,從而加劇組織炎癥。同時(shí)觀察到UC患者血清中,TNF-α和IL-6水平也明顯升高[26]。GUPTA 等[27]研究表明使用IL-6單克隆抗體(mAb)或TNF-α mAb 可顯著降低腸道通透性,改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,與模型組相比,治療組IL-6和TNF-α表達(dá)水平降低,提示AD-1可通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá),改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性IBD的炎癥反應(yīng)。

      腸上皮屏障將內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境隔離,在腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用。腸道炎癥與腸屏障損傷引起的腸黏膜通透性增加有關(guān)[28]。Occludin和ZO-1是腸道重要的緊密連接蛋白,參與腸上皮細(xì)胞的增殖和分化等過程[29]。由于氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)的增加,導(dǎo)致腸道通透性增加和腸道屏障被破壞,這是IBD的重要致病因素[30]。本次研究結(jié)果觀察到模型組小鼠結(jié)腸組織Occludin 和ZO-1 表達(dá)明顯降低,治療組Occludin 和ZO-1 表達(dá)升高,提示AD-1 對(duì)腸道屏障的損傷具有保護(hù)作用。

      NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)組成炎癥小體復(fù)合物。NLRP3受到活化信號(hào)后,pro-caspase-1 水解為酶活性的Caspase-1,Caspase-1 切 割pro-IL-1β 和pro-IL-18 使其成為活化狀態(tài)的IL-1β 和IL-18 進(jìn)而引發(fā)系列炎癥反應(yīng)[31]。人類標(biāo)本和小鼠結(jié)腸炎模型的數(shù)據(jù)表明,IL-1β 和IL-18 過度表達(dá)在IBD 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[32]。因此,抑制NLRP3 炎癥小體的活性可以有效地抑制炎癥發(fā)展,緩解IBD 的炎癥反應(yīng)[33]。同樣,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組結(jié)腸組織中NLRP3 炎癥小體、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)明顯升高,血清中IL-1β、IL-18 高表達(dá),而治療組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3 炎癥小體、促炎細(xì)胞因子以及血清中IL-1β、IL-18表達(dá)顯著下降,小鼠急性IBD 得到緩解。表明AD-1可通過抑制NLRP3 炎癥小體的活化進(jìn)而下調(diào)下游細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 表達(dá),改善TNBS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD。

      綜上所述,AD-1 可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體活化,緩解TNBS誘導(dǎo)的IBD模型小鼠炎癥反應(yīng)作用。提示AD-1 治療IBD 控制其急性炎癥作用值得進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果將會(huì)為研發(fā)新的治療IBD 藥物方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為研究人參皂苷應(yīng)用于炎癥性疾病的治療提供新的思路。

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