人參皂苷衍生物AD-1 通過抑制NLRP3 炎癥小體活化改善TNBS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD①

蘇 超 包 闊 李佳威 黃勝男 韓園園 姜天意 朱婧堯 李芳芳 金 丹

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，延吉 133002）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD），是腸道的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，病因尚不明確，但一般認(rèn)為其是遺傳、環(huán)境、腸道微生物群和免疫異常引起的多因素疾?。?-2］。如果控制不好，隨著時(shí)間的推移，復(fù)發(fā)的炎癥可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，如組織纖維化、瘺管甚至癌變［3-4］。用于治療IBD 的藥物主要有5-氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑等，盡管種類繁多，但副作用明顯、不能長期使用等問題限制了其應(yīng)用［5-6］。

人參作為一種傳統(tǒng)的中草藥，已被廣泛用于保健和治療某些慢性病［7］。人參皂苷為人參的主要活性成分，具有降血糖、抗癌、抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)活性的作用［8］。AD-1［20（R）-25-甲氧基-達(dá)瑪烷-3β，12β，20-三醇］是從人參果實(shí)中提取的新型人參皂苷衍生物。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)AD-1 有減輕葡聚糖硫酸鈉（dextra sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的慢性IBD小鼠腸道炎癥的作用，但對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性IBD模型的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。關(guān)于人參抗炎機(jī)制方面，有研究表明人參皂苷Rk3 通過保護(hù)結(jié)腸屏障和抑制NLRP3 炎癥小體通路減輕小鼠IBD［9］。人參皂苷Rd 通過抑制NLRP3 炎癥小體活化改善IBD［10］。基于以上研究背景，探討AD-1 是否對(duì)急性IBD 具有治療作用，以及改善小鼠結(jié)腸炎癥程度的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡的雄性C57BL/6 小鼠（合格證號(hào)：202200042522）購于延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，在恒溫20～25 ℃條件下飼養(yǎng)，光/暗周期為12 h。該實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)通過延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查（YD20230912001）。

1.1.2 主要試劑 AD-1由沈陽藥科大學(xué)趙余慶教授饋贈(zèng)；TNBS（P2297）購于美國Sigma 公司；Oligo（dT）（C1101）購于美國Promega 公 司；rTaq 酶（R500Z）購于日本TaKaRa 公司；PCR 引物由Invitrogen 公司合成；Caspase-1（ab179515）、NLRP3（ab214185）、IL-18（ab207323）、ZO-1（ab276131）、Occludin（ab216327）等一抗購于美國Abcam 公司；ASC（67824S）、IL-1β（12703S）、IL-6（12912S）、TNF-α（11948S）、β-actin（8457S）等一抗購于美國CST公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（ZB-2301）購于中國中杉金橋公司；羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）購于上海麥克林生化科技股份有限公司（C798844）；ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性IBD 模型的建立 6～8 周齡的雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control）、乙醇對(duì)照組（Alcohol）、模型組（TNBS）、治療組（TWBS+AD-1）和陽性對(duì)照組（TNBS+5-ASA），每組10只，后3組于造模前7 d采用1%TNBS 乙醇溶液涂抹皮膚進(jìn)行預(yù)敏化處理，即先將小鼠進(jìn)行剃毛處理，暴露出皮膚，每日在皮膚同一區(qū)域上進(jìn)行涂藥，每只小鼠涂抹0.1 ml。造模日于禁食12 h 后采用2.5%TNBS 乙醇溶液灌腸給藥建立急性IBD 模型，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）報(bào)道的方案進(jìn)行了一些修改［11-13］，并通過課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的摸索來制定此造模方案。灌腸前用乙醚進(jìn)行麻醉，然后將一根柔性導(dǎo)管插入肛門到達(dá)結(jié)腸部位，每只小鼠注入100 μl，正常對(duì)照組和乙醇對(duì)照組采用上述同樣的方法，灌入相同體積的生理鹽水和25%乙醇溶液，全程進(jìn)行1 次灌腸操作處理。治療藥AD-1（10 mg/kg）和陽性對(duì)照藥物5-ASA（30 mg/kg）分別溶于0.5%CMC 中，于灌腸造模后的第2天進(jìn)行灌胃給藥，正常對(duì)照組和乙醇對(duì)照組分別灌胃CMC，每只小鼠灌胃200 μl，灌胃時(shí)間為連續(xù)4 d，第6天處死小鼠。

1.2.2 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）［14］對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀及血便情況進(jìn)行觀察并記錄，糞便正常計(jì)0分，糞便軟并帶有潛血計(jì)1 分，糞便松散并帶血計(jì)2 分，腹瀉并便血計(jì)3 分。體質(zhì)量不下降計(jì)0 分，體質(zhì)量下降1%～5%計(jì)1分，體質(zhì)量下降5%～10%計(jì)2分，體質(zhì)量下降10%～15%計(jì)3 分（DAI=體質(zhì)量變化評(píng)分+糞便形狀及血便評(píng)分）。

1.2.3 蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織的病理變化 第6天脫頸處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織采用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，HE 染色后，顯微鏡觀察小鼠結(jié)腸組織病理的變化。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)結(jié)腸組織炎癥因子基因的表達(dá) 采用TRIzol裂解液裂解結(jié)腸組織提取總RNA，合成cDNA，按照95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 5 min；35個(gè)循環(huán)的程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增，配制1.5%瓊脂糖凝膠，電泳，全自動(dòng)成像儀顯影，采用Image J 軟件分析條帶密度。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)結(jié)腸組織相關(guān)蛋白表達(dá) 采用RIPA 裂解液裂解結(jié)腸組織提取總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，10%SDS-PAGE 凝膠電泳下分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，室溫下于5%脫脂牛奶中封閉1 h，在4 ℃下與一抗孵育過夜，然后用1×TBST 洗膜4 次。室溫下與二抗孵育1 h，1×TBST洗膜4 次，凝膠成像儀顯影拍照。Image J 軟件分析條帶密度。

1.2.6 ELISA 檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子的含量

第6天脫頸處死小鼠前取小鼠眼球血并分離出血清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入96 孔板，加入酶標(biāo)記抗體工作液，37 ℃孵育1 h，然后棄去液體，洗板5次，加入顯色劑15 min 后，加入終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測(cè)量各孔的OD值，最后計(jì)算出樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad prism7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以表示，組間均數(shù)差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠DAI 評(píng)分和結(jié)腸長度的影響 在實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠DAI評(píng)分，與TNBS 組［（5.84±0.06）分］比較，TNBS+AD-1 組［（3.84±0.05）分］和TNBS+5-ASA 組［（4.3±0.08）分］小鼠在第4 天DAI 評(píng)分顯著降低（P<0.01）。AD-1 可以減輕TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠腹瀉、血便情況（圖1A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集小鼠的結(jié)腸測(cè)量結(jié)腸長度，Control 組平均結(jié)腸長度為（7.57±0.05）cm，Alcohol 組平均結(jié)腸長度為（7.47±0.05）cm，TNBS組平均結(jié)腸長度為（5.67±0.12）cm，TNBS+AD-1 組平均結(jié)腸長度為（6.77±0.12）cm，TNBS+5-ASA 組平均結(jié)腸長度為（6.64±0.09）cm。與Control組和Alcohol組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短（P<0.001）；與模型組相比，AD-1+TNBS組和5-ASA+TNBS 組小鼠結(jié)腸長度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AD-1 可以改善TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD小鼠結(jié)腸長度縮短的情況（圖1B）。

圖1 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠DAI 評(píng)分和結(jié)腸長度的影響Fig.1 Effects of AD-1 on DAI score and colon length in TNBS-induced acute IBD mice

2.2 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織炎癥病理影響 HE 染色生物光學(xué)顯微鏡，與正常組和乙醇對(duì)照組相比，模型組炎癥細(xì)胞浸潤增加，上皮缺失、隱窩結(jié)構(gòu)破壞增加以及杯狀細(xì)胞減少；與模型組相比，AD-1治療組和陽性對(duì)照組小鼠結(jié)腸炎癥病理有較好的改善（圖2）。

圖2 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織炎癥的病理影響Fig.2 Effect of AD-1 on inflammatory pathology of colon tissue in TNBS-induced acute IBD mice

2.3 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的影響 與正常組和乙醇對(duì)照組相比，模型組結(jié)腸組織IL-6、TNF-α 表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；與模型組相比，治療組和陽性對(duì)照組的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。AD-1 可下調(diào)促炎因子的表達(dá)，改善TNBS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD（圖3）。

圖3 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effects of AD-1 on tissue proinflammatory cyto kines in colon of TNBS-induced acute IBD mice

2.4 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)的影響 與正常組和乙醇對(duì)照組比較，模型組ZO-1 和Occludin 表達(dá)明顯降低（P<0.001）；與模型組相比，治療組ZO-1 和Occludin 的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；陽性對(duì)照組ZO-1 與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。如圖4。提示AD-1 具有促進(jìn)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 和Occludin 蛋白恢復(fù)的作用。

圖4 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of AD-1 on expressions of ZO-1 and Occludin proteins in colon tissue of TNBS-induced acute IBD mice

2.5 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠結(jié)腸組織NLRP3 炎癥小體以及IL-1β、IL-18 表達(dá)的影響 與正常組和乙醇對(duì)照組比較，模型組ASC、Caspase-1、NLRP3 的表達(dá)水平明顯升高（P<0.001）；與模型組相比，治療組和陽性對(duì)照組的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明AD-1 可抑制NLRP3炎癥小體的激活（圖5A、B）。與正常組和乙醇對(duì)照組相比，模型組IL-1β、IL-18 的表達(dá)水平顯著升高（P<0.001）；與模型組相比，治療組和陽性對(duì)照組IL-1β、IL-18 的表達(dá)水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AD-1 可能通過抑制NLRP3 炎癥小體進(jìn)而下調(diào)下游炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平（圖5C、D）。

2.6 AD-1 對(duì)TNBS 誘導(dǎo)的急性IBD 小鼠血清中IL-1β 和IL-18 的影響 模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18 含量高于正常組和乙醇對(duì)照組（P<0.01，P<0.05）；治療組和陽性對(duì)照組小鼠血清中IL-1β、IL-18表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AD-1 可能通過降低TNBS誘導(dǎo)的急性IBD小鼠血清中IL-1β和IL-18水平，改善小鼠的急性炎癥（圖6）。

3 討論

IBD 是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚的慢性非特異性腸道疾病，其特點(diǎn)是炎癥無法消退，可導(dǎo)致腸道纖維化、狹窄甚至梗阻［15］。IBD 在工業(yè)化國家的發(fā)病率正在穩(wěn)步上升，而發(fā)展中國家的發(fā)病率在過去幾十年里迅速上升［16］。該病發(fā)病機(jī)制與腸道中上皮屏障、共生菌群、抗原識(shí)別、免疫反應(yīng)失調(diào)、白細(xì)胞募集和遺傳等因素相關(guān)［17］。通過將化學(xué)物質(zhì)TNBS 輸送到小鼠體內(nèi)所建立的結(jié)腸炎癥模型，其臨床表現(xiàn)與人類的IBD相似，如進(jìn)行性體重減輕、腹瀉、便血、腸道破壞，腸壁增厚、彌漫性壞死和腸道中性粒細(xì)胞浸潤等［18］。

人參皂苷是人參的主要成分之一，已被證實(shí)具有良好的抗炎和抗腫瘤作用［19-20］。人參皂苷在治療IBD 方面已有較多的研究報(bào)道，如人參皂苷Rd 通過NF-κB 通路抑制小鼠促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD［21］。人參皂苷Rh2 通過調(diào)節(jié)STAT3/miR-214 通路緩解DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD［22］。人參皂苷Rg1 通過調(diào)節(jié)Tfh/Treg 細(xì)胞的平衡緩解TNBS 誘導(dǎo)的小鼠IBD［23］。人參皂苷Rb1 通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的E3 泛素連接酶Hrd1 信號(hào)通路減輕TNBS 誘導(dǎo)的小鼠IBD［24］。課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)AD-1 對(duì)DSS 誘導(dǎo)的慢性IBD 小鼠有減輕腸道炎癥作用，但對(duì)于TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性IBD模型的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，因此建立TNBS誘導(dǎo)的急性IBD小鼠模型，探討AD-1對(duì)其的影響及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示，模型組小鼠的DAI評(píng)分明顯增加，包括小鼠體質(zhì)量減輕、腹瀉及便血情況；模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短，結(jié)腸黏膜嚴(yán)重的水腫、壞死、杯狀細(xì)胞減少以及炎癥細(xì)胞浸潤。而AD-1 和5-ASA 處理的小鼠體質(zhì)量上升，腸道內(nèi)容物檢查所見，糞便顆粒結(jié)構(gòu)良好，結(jié)腸長度明顯增加，結(jié)腸組織病理得到較好的改善。以上結(jié)果證明人參皂苷AD-1可改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的臨床表現(xiàn)，包括體質(zhì)量減輕、腹瀉、結(jié)腸縮短和組織病理學(xué)損傷。

TNF-α 和IL-6 在IBD 的病理生理過程中起重要作用［25］?？烧{(diào)節(jié)黏膜免疫系統(tǒng)，改變上皮完整性，協(xié)調(diào)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤和激活，從而導(dǎo)致結(jié)腸損傷。有研究報(bào)告，TNF-α 和IL-6 高表達(dá)可能導(dǎo)致UC 患者黏膜屏障功能缺陷，從而加劇組織炎癥。同時(shí)觀察到UC患者血清中，TNF-α和IL-6水平也明顯升高［26］。GUPTA 等［27］研究表明使用IL-6單克隆抗體（mAb）或TNF-α mAb 可顯著降低腸道通透性，改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與模型組相比，治療組IL-6和TNF-α表達(dá)水平降低，提示AD-1可通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性IBD的炎癥反應(yīng)。

腸上皮屏障將內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境隔離，在腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用。腸道炎癥與腸屏障損傷引起的腸黏膜通透性增加有關(guān)［28］。Occludin和ZO-1是腸道重要的緊密連接蛋白，參與腸上皮細(xì)胞的增殖和分化等過程［29］。由于氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)的增加，導(dǎo)致腸道通透性增加和腸道屏障被破壞，這是IBD的重要致病因素［30］。本次研究結(jié)果觀察到模型組小鼠結(jié)腸組織Occludin 和ZO-1 表達(dá)明顯降低，治療組Occludin 和ZO-1 表達(dá)升高，提示AD-1 對(duì)腸道屏障的損傷具有保護(hù)作用。

NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）組成炎癥小體復(fù)合物。NLRP3受到活化信號(hào)后，pro-caspase-1 水解為酶活性的Caspase-1，Caspase-1 切 割pro-IL-1β 和pro-IL-18 使其成為活化狀態(tài)的IL-1β 和IL-18 進(jìn)而引發(fā)系列炎癥反應(yīng)［31］。人類標(biāo)本和小鼠結(jié)腸炎模型的數(shù)據(jù)表明，IL-1β 和IL-18 過度表達(dá)在IBD 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［32］。因此，抑制NLRP3 炎癥小體的活性可以有效地抑制炎癥發(fā)展，緩解IBD 的炎癥反應(yīng)［33］。同樣，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸組織中NLRP3 炎癥小體、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)明顯升高，血清中IL-1β、IL-18 高表達(dá)，而治療組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3 炎癥小體、促炎細(xì)胞因子以及血清中IL-1β、IL-18表達(dá)顯著下降，小鼠急性IBD 得到緩解。表明AD-1可通過抑制NLRP3 炎癥小體的活化進(jìn)而下調(diào)下游細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 表達(dá)，改善TNBS 誘導(dǎo)的小鼠急性IBD。

綜上所述，AD-1 可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體活化，緩解TNBS誘導(dǎo)的IBD模型小鼠炎癥反應(yīng)作用。提示AD-1 治療IBD 控制其急性炎癥作用值得進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果將會(huì)為研發(fā)新的治療IBD 藥物方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為研究人參皂苷應(yīng)用于炎癥性疾病的治療提供新的思路。