宏基因組測(cè)序應(yīng)用于SPF動(dòng)物的研究進(jìn)展

程文杰,謝宇瀟,魏紅江,趙素梅

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指經(jīng)人工飼育,對(duì)其攜帶的微生物實(shí)行控制,遺傳背景明確或者來(lái)源清楚的,用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定以及其他學(xué)科實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物[1]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按微生物學(xué)等級(jí)可分為普通級(jí)動(dòng)物、清潔級(jí)動(dòng)物、無(wú)特定病原體動(dòng)物、無(wú)菌級(jí)動(dòng)物。其中無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)動(dòng)物,是指除清潔級(jí)動(dòng)物應(yīng)排除的病原外,不攜帶主要潛在感染或條件致病及對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[2]。隨著科學(xué)研究的不斷發(fā)展,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求也越來(lái)越高,SPF動(dòng)物和無(wú)菌動(dòng)物均能滿足保證實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可重復(fù)性的要求,但SPF動(dòng)物飼養(yǎng)管理成本低于無(wú)菌動(dòng)物,因此,SPF動(dòng)物得到更廣泛的應(yīng)用。常見的SPF動(dòng)物有豬、猴、鼠以及蝦、斑馬魚等[3]。

宏基因組學(xué)(Metagenomics)又稱元基因組學(xué)、環(huán)境基因組學(xué),最早在1998年由Handelsman J[4]提出,宏基因組學(xué)的研究對(duì)象包括環(huán)境中存在的所有微生物。傳統(tǒng)的微生物研究需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng),但環(huán)境中絕大部分微生物因?yàn)闂l件的限制無(wú)法通過分離培養(yǎng)獲得[5]。宏基因組學(xué)則是以樣品中全部的DNA為研究對(duì)象,是認(rèn)識(shí)微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)和功能以及微生物與環(huán)境、疾病關(guān)系的現(xiàn)代技術(shù)手段。目前宏基因組學(xué)研究技術(shù)主要包括擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序[6]。與擴(kuò)增子測(cè)序相比,宏基因組測(cè)序靈敏度更高,在門、綱、目、科、屬水平上鑒定分類群的優(yōu)勢(shì)明顯,從而可以更好的描述微生物群落的復(fù)雜性[7]。宏基因組測(cè)序已應(yīng)用于土壤、海洋、腸道微生物、臨床疾病診斷等研究領(lǐng)域。論文就宏基因組測(cè)序應(yīng)用于SPF動(dòng)物,對(duì)腸道微生物多樣性、病原體檢測(cè)、藥物作用機(jī)制及微生物與健康的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 腸道微生物多樣性

宏基因組可注釋樣品中包含的所有微生物序列,進(jìn)而可以了解微生物的種類和組成。管志偉[8]通過宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)SPF級(jí)SD大鼠腸道微生物群在界水平上主要由細(xì)菌界組成,約占90%;在門水平,SD大鼠腸道微生物菌群主要由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和疣微菌門組成;在綱水平上,以擬桿菌綱和梭菌綱為主。Hughes E R等[9]發(fā)現(xiàn)SPF級(jí)C57BL/6小鼠盲腸中最豐富的兩個(gè)門為厚壁菌門和擬桿菌門。Scavizzi F等[10]報(bào)道了SPF與非SPF級(jí)C57BL/6N小鼠的微生物菌群組成在門和科水平上相似,但門水平中的擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和疣微菌門以及科水平中的擬桿菌科、腸球菌科、乳桿菌科、丹毒科、螺桿菌科、阿克曼菌科、腸桿菌科、雙歧桿菌科的微生物組成存在顯著差異,另外SPF小鼠中缺失螺桿菌科細(xì)菌。Chen J等[11]發(fā)現(xiàn)環(huán)境的改變會(huì)影響小鼠腸道微生物多樣性,如轉(zhuǎn)移到常規(guī)設(shè)施里與普通小鼠共同飼養(yǎng)的SPF級(jí)C57BL/6小鼠糞便微生物中Psedomonasstutzeri與黏金黃桿菌這兩種致病菌水平低于SPF級(jí)C57BL/6小鼠。

除環(huán)境外,腸道微生物的組成也受其它因素的影響。Zhao H等[12]發(fā)現(xiàn)切除SPF級(jí)C57BL/6小鼠卵巢后,小鼠腸道中大腸埃希氏菌、Bacteroidesuniformis、B.xylanisolvens、Parabacteroidesdistasonis等的相對(duì)豐度隨時(shí)間增加、雌激素水平降低而增加,小鼠雌激素水平的降低增加了與小鼠肥胖相關(guān)的韋榮球菌屬和大腸埃希氏菌的豐度。大腸埃希氏菌是一種機(jī)會(huì)性病原體,當(dāng)宿主抵抗力降低時(shí),可引起感染和炎癥性腸病。因此,雌激素的減少導(dǎo)致大腸埃希氏菌的豐度升高可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)加大。Jangid A等[13]發(fā)現(xiàn)SPF級(jí)C57BL/6小鼠Ap1m2基因敲除組與未敲除組相比厚壁菌門、變形菌門和疣微菌門的水平升高,擬桿菌門和放線菌門水平降低;在屬水平上,兩組之間共有77個(gè)屬的微生物發(fā)生顯著變化。Rodriguez-Palacios A等[14]發(fā)現(xiàn),SAMP快速老化小鼠與AKR小鼠相比在門水平上擬桿菌門相對(duì)豐都顯著增加,在綱水平上擬桿菌綱與鞘脂桿菌綱的相對(duì)豐度增加。Jia L等[15]通過宏基因組測(cè)序?qū)PF級(jí)C57BL/6J小鼠進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 S DNA疫苗的免疫接種可以改變小鼠的腸道微生物群組成,小鼠腸道共生菌中擬桿菌科、普雷沃氏菌科和副擬桿菌屬的豐度顯著增加。Jangid A等[16]發(fā)現(xiàn),可溶性纖維可以促進(jìn)SPF級(jí)C57BL/6小鼠乳酸桿菌的富集,飲食中可溶性纖維的存在可能比單獨(dú)的不溶性纖維更有利于腸道微生物生態(tài),從而對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益影響。以上關(guān)于腸道菌群組成及多樣性的研究多采用飼育SPF小鼠以及宏基因組測(cè)序相結(jié)合的方式。飲食、飼養(yǎng)環(huán)境、藥物等條件均可能改變微生物多樣性,宏基因組測(cè)序?yàn)樘骄课⑸锒鄻有耘c環(huán)境條件的關(guān)系提供了有效手段,促進(jìn)了對(duì)微生物多樣性的了解。

2 病原體檢測(cè)

宏基因組測(cè)序可以一次性提供樣品中存在的包括宿主和微生物來(lái)源的所有核酸序列,在病原檢測(cè)以及病原體特異性診斷方面有著很大優(yōu)勢(shì),為疾病針對(duì)性的治療奠定基礎(chǔ)。Schneeberger P H H等[17]根據(jù)篩選出可能引起消化道紊亂的細(xì)菌性疾病對(duì)腹瀉患者糞便樣本進(jìn)行宏基因組檢測(cè),發(fā)現(xiàn)宏基因組學(xué)能夠診斷出多個(gè)多重PCR未檢測(cè)到的細(xì)菌。宏基因組在人類臨床樣本中應(yīng)用的可能性已經(jīng)得到證實(shí),在人體臨床病例診斷中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[18]。SPF動(dòng)物種群對(duì)疾病凈化要求高,需定期進(jìn)行病原體監(jiān)測(cè)。利用SPF動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象結(jié)合宏基因組測(cè)序進(jìn)行病原檢測(cè)的方法也逐漸得到應(yīng)用。Scavizzi F等[10]發(fā)現(xiàn)對(duì)普通小鼠使用宏基因組測(cè)序的方法與常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)的結(jié)果吻合,檢測(cè)出肝螺桿菌、鼠諾如病毒等14種病原,而在SPF級(jí)C57BL/6N小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)特定病原體,這表明應(yīng)用宏基因組測(cè)序?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)可行。

動(dòng)物的生產(chǎn)性能受到多個(gè)因素的影響,其中病原感染即使是在隱性感染狀態(tài)下也會(huì)導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率低等生產(chǎn)問題。病原體檢測(cè)有助于養(yǎng)殖業(yè)疾病預(yù)防,提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。Zhao L等[19]從SPF級(jí)金定鴨所有樣品中均檢測(cè)到約300種病毒,顯示出高水平的混合感染,其中有正黏病毒科、皰疹病毒科、小雙節(jié) RNA 病毒等,這些病毒在不同樣品中的豐度存在差異。Blomstr?m A L等[20]在健康的SPF豬和患有PMWS(斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征)的豬中均檢測(cè)到了圓環(huán)病毒2型,還發(fā)現(xiàn)多種病原共感染。豬扁桃體病毒組特征也得到了表征,發(fā)現(xiàn)共存在8個(gè)病毒科,在所有豬中均發(fā)現(xiàn)存在腺病毒,但其常引起亞臨床感染,不是引起呼吸道疾病的主要病原體,在兩頭SPF級(jí)約×長(zhǎng)二元雜交豬和兩頭傳統(tǒng)飼養(yǎng)的豬中發(fā)現(xiàn)了在歐洲尚未檢測(cè)到的PPV7[21]。宏基因組測(cè)序能夠確定病原體在動(dòng)物中的流行情況,有助于研究病原體在疾病發(fā)展中的潛在作用。

豬是最有可能解決異種器官移植供體短缺問題的動(dòng)物,但存在生物安全等風(fēng)險(xiǎn)。使用宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)供體SPF豬是否攜帶戊型肝炎病毒等人獸共患病病原,為異種器官移植受者的安全提供保障[22]。Mishkin N等[23]對(duì)來(lái)自120個(gè)機(jī)構(gòu)的11 387個(gè)糞便宏基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),鼠衣原體在美洲和歐洲的小鼠中普遍流行,這表明可以利用公開的宏基因組數(shù)據(jù)了解SPF級(jí)以及其它微生物學(xué)等級(jí)實(shí)驗(yàn)用小鼠或其它動(dòng)物中特定病原體的流行情況。宏基因組測(cè)序技術(shù)在SPF動(dòng)物病原監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用將為SPF動(dòng)物種群疾病凈化和預(yù)測(cè)未來(lái)疾病的爆發(fā)提供參考,也使得對(duì)SPF動(dòng)物監(jiān)測(cè)的范圍從病原體擴(kuò)大到更廣泛的微生物群監(jiān)測(cè)。

3 藥物作用機(jī)制

宏基因組測(cè)序技術(shù)不僅可以鑒定腸道菌群的種類和組成,還能夠預(yù)測(cè)腸道菌群的功能,在探究藥物作用機(jī)理方面發(fā)揮作用。中藥對(duì)治療多種疾病有良好作用,中藥發(fā)揮效用的機(jī)制不斷被探索。Liu Y等[24]發(fā)現(xiàn)化滯柔肝顆?？梢愿淖僑PF級(jí)C57BL/6J小鼠腸道微生物的多樣性、結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而改善高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝,這可能是通過代謝和細(xì)胞過程發(fā)揮作用,化滯柔肝顆粒的使用增加了氨基苯甲酸降解、類固醇生物合成、倍半萜和三萜生物合成。管志偉[8]報(bào)道了加味人參烏梅湯能夠使SPF級(jí)SD大鼠因腹瀉導(dǎo)致失調(diào)的腸道菌群顯著改善,中藥組中乳酸桿菌屬等多種益生菌的相對(duì)豐度顯著高于西藥組,菌群調(diào)控了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn),發(fā)揮烏梅湯的止瀉作用。施麗婕等[25]研究發(fā)現(xiàn)化瘀通陽(yáng)方可能通過富集乳酸桿菌屬和Akkermansia達(dá)到治療SPF級(jí)Wistar大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的目的。Zhang S等[26]發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散能夠改善SPF級(jí)SD大鼠功能性消化不良造成的腸道微生物群落的組成和功能失調(diào),也從腸道微生物的角度深入了解參苓白術(shù)散治療功能性消化不良的機(jī)制。

除傳統(tǒng)中藥外,許多西藥作用機(jī)制也在SPF動(dòng)物上通過宏基因組測(cè)序進(jìn)行了研究。Wang R等[27]發(fā)現(xiàn)諾麗果改變了SPF級(jí)2型糖尿病C57BL/6J小鼠的腸道菌群組成,研究結(jié)果表明,另枝菌屬、普雷沃氏菌屬、乳酸桿菌屬和Akkermansia的豐度增加,顫桿菌克屬和脫硫弧菌屬的豐度降低,并顯著降低了與碳水化合物代謝、翻譯、氨基酸代謝和核苷酸代謝相關(guān)的通路,分析發(fā)現(xiàn)諾麗果在2型糖尿病中的降血糖和降血脂活性可能歸因于肝臟腺苷酸激活蛋白激酶的激活和腸道微生物群的調(diào)節(jié)。

傳統(tǒng)動(dòng)物養(yǎng)殖中多使用抗生素預(yù)防、治療疾病,但會(huì)產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留等問題。全面禁抗后微生物制劑替代抗生素作為新的飼料添加劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn),有關(guān)益生菌發(fā)揮抗病作用的研究報(bào)道越來(lái)越多。Zhang Q等[28]鑒定出動(dòng)物雙歧桿菌是對(duì)感染流感的SPF級(jí)C57BL/6小鼠具有保護(hù)作用的腸道微生物群的成員,動(dòng)物雙歧桿菌可能通過促進(jìn)纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和輔酶A的生物合成來(lái)介導(dǎo)對(duì)流感的保護(hù)作用,這為抗流感益生菌制劑的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。Wu F等[29]報(bào)道了副干酪乳桿菌L9和動(dòng)物雙歧桿菌A6降低Wistar大鼠牙周炎齦下微生物組中的鏈球菌屬、梭桿菌屬、韋榮氏球菌屬和埃希氏菌屬等致病菌屬的相對(duì)比例,兩種益生菌均顯著抑制與牙周炎發(fā)病密切相關(guān)的粘附、侵襲等功能相關(guān)的細(xì)菌毒力因子水平,從宏基因組學(xué)角度證明了益生菌對(duì)口腔菌群的調(diào)節(jié)作用。Zhou D等[30]發(fā)現(xiàn)土壤可能作為一種潛在的"益生元",促進(jìn)SPF級(jí)C57小鼠含有T3SS細(xì)菌分泌系統(tǒng)基因的腸道微生物的繁殖和生長(zhǎng),而T3SS豐度與小鼠的先天免疫功能呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明藥物通過調(diào)控腸道菌群的數(shù)量和功能發(fā)揮作用。宏基因組測(cè)序幫助認(rèn)識(shí)藥物與微生物的相關(guān)性,也為藥物使用提供了科學(xué)依據(jù)。

4 微生物與健康

腸道微生物與機(jī)體健康密切相關(guān),因此越來(lái)越多的研究通過宏基因組測(cè)序技術(shù)利用SPF動(dòng)物作為動(dòng)物模型探討腸道微生物與健康的關(guān)系,這為我們了解疾病的發(fā)生和發(fā)展指引了新的方向。Hughes E R等[9]對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型SPF級(jí)C57BL/6小鼠盲腸微生物進(jìn)行了宏基因組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)變形菌門、脫鐵桿菌門和疣微菌門相對(duì)豐度增加,細(xì)菌的甲酸鹽氧化和有氧呼吸是過度表達(dá)的代謝途徑,呼吸脫氫酶、末端氧化酶和末端還原酶等電子傳遞鏈組分的編碼基因豐度增加,與葡萄糖硫酸鈉誘導(dǎo)的炎癥有關(guān)。Jangid A等[13]發(fā)現(xiàn),硫酸鹽還原菌和產(chǎn)乳酸菌的豐度增加可能會(huì)加重結(jié)腸炎的病情,敲除Ap1m2基因的SPF級(jí)C57BL/6小鼠中氧化應(yīng)激相關(guān)基因的豐度增加,而碳水化合物代謝相關(guān)基因的豐度降低,表明微生物群在炎癥期間發(fā)揮維持體內(nèi)平衡的作用。

以上研究從宿主發(fā)病后獲取樣本,未能找到有效的疾病預(yù)測(cè)因子。Miyoshi J等[31]使用抗生素處理IL-10基因缺陷SPF級(jí)C57BL/6J小鼠模型,發(fā)現(xiàn)抗生素處理過的雌鼠的后代出現(xiàn)持續(xù)功能失調(diào)的現(xiàn)象,這些后代發(fā)生的微生物重組與特定功能子系統(tǒng)的改變有關(guān),比較發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)結(jié)腸炎之前,不同處理組的小鼠之間,多個(gè)功能子系統(tǒng)尤其是氮代謝發(fā)生了變化。宏基因組測(cè)序有助于尋找疾病發(fā)作或復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子,實(shí)現(xiàn)早期干預(yù),也可成為評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)的有效工具。

環(huán)境、疫苗、病毒等因素也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體腸道微生物發(fā)生變化進(jìn)而對(duì)宿主健康產(chǎn)生影響。Tu P等[32]發(fā)現(xiàn)除草劑2,4-D(2,4—二氯苯氧乙酸)處理的SPF級(jí)C57BL/6小鼠中,尿素降解、氨基酸和碳水化合物代謝等途徑發(fā)生了顯著變化,通過宏基因組測(cè)序進(jìn)一步揭示了除草劑2,4-D毒性機(jī)制,表明環(huán)境污染物與微生物群之間的相互作用。Chen J等[11]將SPF級(jí)C57BL/6小鼠安置在常規(guī)設(shè)施中,發(fā)現(xiàn)腸道微生物群多樣性顯著增加,也調(diào)節(jié)了小鼠造血基因表達(dá)。疫苗是預(yù)防疾病的有效手段。Swaminathan G等[33]發(fā)現(xiàn)抗生素會(huì)破壞BALB/c小鼠腸道微生物,進(jìn)而降低疫苗接種后IgG水平;研究發(fā)現(xiàn),萜類-醌生物合成、硫代謝、色氨酸代謝、硒化合物代謝等4條代謝通路的富集與抗原特異性IgG滴度的降低有關(guān)。Jia L等[15]證明了不同腸道微生物群組成的SPF級(jí)C57BL/6J小鼠具有不同水平的預(yù)先存在的S2交叉反應(yīng)性抗體。許多研究注重細(xì)菌在健康和疾病中的作用,但對(duì)病毒的作用研究缺乏。Liu L等[34]借助C57BL/6J小鼠發(fā)現(xiàn)共生病毒通過RIG-I信號(hào)通路維持腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài),從而維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

實(shí)驗(yàn)小鼠是多種人類疾病藥物研發(fā)的重要臨床前模型,但基因相同的小鼠疾病外顯率和可重復(fù)性存在很大的差異,限制了許多常用模型的實(shí)用性[35]。Forster S C等[36]發(fā)現(xiàn),Dunceniellamuricolitica和Alistipesokayasuensis在造成葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的SPF級(jí)C57BL/6N小鼠炎癥性腸病模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異中發(fā)揮主導(dǎo)作用,表明去除某些微生物將使SPF動(dòng)物建立更為可靠的疾病模型。宏基因組測(cè)序使得我們可以借助SPF動(dòng)物模型深入了解腸道微生物組與健康的相互作用,通過篩選差異菌群作為預(yù)測(cè)因子、作用靶標(biāo)等使微生物更好地為人類健康服務(wù)。

5 小結(jié)

應(yīng)用宏基因組測(cè)序借助SPF動(dòng)物進(jìn)行研究的報(bào)道越來(lái)越多,充分利用了SPF動(dòng)物無(wú)特定病原體的優(yōu)勢(shì),來(lái)探索微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)和功能以及微生物與環(huán)境、疾病的關(guān)系。隨著測(cè)序技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)不斷發(fā)展,宏基因組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)聯(lián)用,將能夠多角度、多層次的解析我們所面臨的的科學(xué)問題。