蒙古口蘑菌種培養(yǎng)基的篩選研究

徐偉良李春冬隋業(yè)璇李林瑛李鳳忠郭梁

(1.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林郭勒 026000；2.錫林郭勒盟坤源生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 錫林郭勒 026000)

蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum Imai.)，又名蒙古白麗蘑。1937年由日本學(xué)者今井三子(S.Imai)定名發(fā)表，2011年姚一建等通過系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，將其又重新劃分并組建為白麗蘑新屬(Leucocalocybe)，因此蒙古口蘑又被稱作蒙古白麗蘑(Leucocalocybemongolica(S.Imai)X.D.Yu&YJ.Yao)，現(xiàn)屬口蘑科(Tricholomataceae)白麗蘑屬(Leucocalocybe)[1，2]。隨著氣候的變化、草原的退化以及人為破壞性采摘等因素的影響，2021年，蒙古口蘑被列入《國家重點保護(hù)野生植物名錄》，成為二級瀕危保護(hù)物種。野生蒙古口蘑種群數(shù)量的減少甚至瀕危亟需科學(xué)的研究保護(hù)，據(jù)報道蒙古口蘑現(xiàn)只分布在呼倫貝爾市以及錫林郭勒盟等旗縣地區(qū)。

目前，蒙古口蘑相關(guān)研究僅停留在遺傳多樣性[3]、菌種發(fā)酵[4]、生物活性成分(多糖、蛋白質(zhì)、多肽、甾體等)[5-7]等方面?，F(xiàn)階段，蒙古口蘑的人工栽培和馴化也處于實驗室研究階段，唯一成功的報道是在20世紀(jì)90年代，田紹義等[8]報道以麥秸、棉籽皮為原料馴化栽培出蒙古口蘑。食用菌液體培養(yǎng)相比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基具有培養(yǎng)周期短、菌種生長均勻、生產(chǎn)成本低、易于調(diào)控、便于接種、減少污染等優(yōu)點，因此有學(xué)者對蒙古口蘑的液體進(jìn)行了研究。吳曉彤[9]經(jīng)過研究確定蒙古口蘑在搖瓶發(fā)酵時的最佳培養(yǎng)條件為接種量12%，溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r·min-1。

本研究通過蒙古口蘑野生子實體的分離、鑒定、培養(yǎng)獲得口蘑菌種資源，選取不同種類的固體、液體、栽培種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選研究，為后續(xù)蒙古口蘑的人工馴化提供優(yōu)質(zhì)菌種，以期通過科學(xué)手段保護(hù)和開發(fā)錫林郭勒蒙古口蘑資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蒙古口蘑子實體采自于錫林郭勒盟草原；青干草、牛糞、木屑購自于錫林浩特市牧民家；馬鈴薯、小麥、玉米粉等購自于錫林浩特市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 試劑

EasyTaq PCR Super Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司；ITS引物合成，北京睿博興科生物科技有限公司；維生素B1、酵母浸膏、蛋白胨、瓊脂(生化試劑)及其余分析純試劑均購自國藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基參考本研究團(tuán)隊郭梁等研究[10，11]，選取馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)、PDA加富培養(yǎng)基及改良PDA培養(yǎng)基3種作為篩選培養(yǎng)配方。

液體培養(yǎng)基參考本研究團(tuán)隊隋業(yè)璇等研究[12，13]報道的4種液體培養(yǎng)基配方。

栽培種培養(yǎng)基配方3種，參考許修宏研究方法[14]。栽培種培養(yǎng)基1：玉米1.0kg，石膏50.0g，麩皮50.0g，木屑200.0g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸餾水根據(jù)濕度添加；栽培種培養(yǎng)基2：小麥1.0kg，石膏50.0g，麩皮50.0g，牛糞120.0g，青干草120.0g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸餾水根據(jù)濕度添加；栽培種培養(yǎng)基3：高粱1.0kg，石膏50.0g，麩皮50.0g，木屑200g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸餾水根據(jù)濕度添加。

1.2 儀器與設(shè)備

YC-R50恒溫培養(yǎng)搖床和202-3A電熱恒溫培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司；2720 Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀，美國BIO-RAD公司；SW-J-2FD超凈工作臺，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 蒙古口蘑子實體與菌絲體分子鑒定

分別取蒙古口蘑子實體和菌絲體樣品進(jìn)行DNA鑒定。將蒙古口蘑子實體樣品清洗消毒，用鑷子取菌蓋內(nèi)部的子實體樣品50mg放入1.5mL試管中，用剪刀攪碎后備用；菌絲體樣品是先將菌絲球用紗布過濾，用無菌水清洗后，稱取50mg濕重樣品放入1.5mL試管中搗碎作為DNA提取樣品。使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取，選用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共34循環(huán)；72℃加強延伸10min。將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源比對。

1.3.2 菌絲體固體培養(yǎng)基的篩選

選取生長良好的蒙古口蘑子實體，按照無菌操作對蒙古口蘑子實體縱剖，在蒙古口蘑子實體上劃不同的4個位置用接種鉤勾取3mm×3mm×3mm大的塊狀組織，放置在PDA培養(yǎng)基中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中初步培養(yǎng)。用打孔器在初步培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上取生長速度和大小相同的菌絲塊放在3種不同的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并每日記錄，直至菌絲長至培養(yǎng)皿邊緣。用電子萬用爐加熱溶解3種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，使瓊脂溶解在培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌紗布進(jìn)行過濾。將菌絲放在預(yù)先稱量好的培養(yǎng)皿中，放置于80℃狀態(tài)下烘干，取出后冷卻至恒重再稱量。

1.3.3 菌絲體液體培養(yǎng)基的篩選

在篩選出的固體培養(yǎng)基上，選取菌絲長勢相似位置，用打孔器選取16個直徑均為1cm的菌塊，4個為1組，分別接種于100mL 4種不同液體培養(yǎng)基中，并放入25℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。隨機(jī)取10個培養(yǎng)好的菌絲球排成直線，測量其長度，然后除以10即為菌絲球的平均直徑，重復(fù)3次，取平均值。再將菌絲球放在紗布上過濾，用無菌水清洗后，于80℃下烘干4h，冷卻至室溫稱重，利用公式計算菌絲體生物量[11]。計算公式：

菌絲體生物量(g·L-1)=菌絲體干重/培養(yǎng)液體積

(1)

1.3.4 菌絲體栽培種培養(yǎng)基的篩選

挑選當(dāng)年收獲的無蟲蛀、無霉變的小麥、玉米、高粱，清洗去除灰塵雜質(zhì)，并按栽培種培養(yǎng)基配方進(jìn)行混料，在121℃高溫高壓滅菌鍋中，滅菌120min，待冷卻后放入超凈工作臺中備用。在無菌環(huán)境操作下，將篩選出的最優(yōu)液體培養(yǎng)基B按照培養(yǎng)基重量的3%分別接種在以玉米、麥粒、高粱為主料的3種栽培種培養(yǎng)基中，并置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察并記錄菌絲吃料深度，根據(jù)率先長滿栽培瓶的時間和菌絲吃料深度篩選出最優(yōu)栽培種培養(yǎng)基的配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實體與菌絲體的分子鑒定

將采集得到的蒙古口蘑子實體和菌絲體分別進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳驗證。由圖1可知，蒙古口蘑的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在600bp左右，經(jīng)DNA測序后進(jìn)行NCBI序列比對表明，與數(shù)據(jù)庫中蒙古口蘑基因序列相似性為100%，確定子實體與分離得到的菌絲體均為蒙古口蘑。

圖1 蒙古口蘑分子鑒定

2.2 蒙古口蘑菌種固體培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

利用選取的3種固體培養(yǎng)基對蒙古口蘑菌種進(jìn)行篩選培養(yǎng)，連續(xù)觀測32d記錄菌絲的生長狀況，以菌絲干質(zhì)量和菌絲長度為評價指標(biāo)，通過統(tǒng)計分析篩選出最適蒙古口蘑菌種生長的固體培養(yǎng)基配方，結(jié)果見圖2～4。通過觀察測量菌絲長度發(fā)現(xiàn)，在3種培養(yǎng)基上菌絲長勢呈現(xiàn)先快后慢的現(xiàn)象。菌絲在培養(yǎng)至第32天時，PDA培養(yǎng)基與PDA加富培養(yǎng)基上的菌絲率先長至培養(yǎng)皿邊緣，而改良PDA培養(yǎng)基上菌絲生長略慢，也已接近培養(yǎng)皿邊緣，但整體生長速度無顯著差異。通過菌絲干質(zhì)量比較，改良PDA培養(yǎng)基上的菌絲干質(zhì)量最大為0.19±0.03g，而PDA培養(yǎng)基與PDA加富培養(yǎng)基上的菌絲干質(zhì)量分別為0.1±0.01g和0.11±0.003g，綜上實驗數(shù)據(jù)分析，說明改良PDA培養(yǎng)基上的菌絲干質(zhì)量積累較多，確定改良PDA培養(yǎng)基為蒙古口蘑菌種的最優(yōu)固體培養(yǎng)基配方。馬榮山等[11]對蒙古口蘑菌蓋、菌柄、菌褶以及菌蓋和菌柄交界處，取采用組織分離法分離菌絲體進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)果表明在菌絲萌發(fā)后30～36d后，4種組織分離的菌絲均長滿試管，萌發(fā)率約為35%。本研究采用與馬榮山相近的固體培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，最終改良PDA培養(yǎng)基上蒙古口蘑菌絲的長勢和所需生長時間與其基本相近。

圖3 蒙古口蘑菌種在3種固體培養(yǎng)基上的菌絲長度

2.3 蒙古口蘑菌種液體培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

選用常見的4種液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌種培養(yǎng)，結(jié)果見圖5，并以菌絲體生物量(折線圖)和菌絲球平均長度(柱狀圖)為評價指標(biāo)，對蒙古口蘑最佳液體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖6。由圖6可知，蒙古口蘑菌種在液體培養(yǎng)基A、B、C、D上的菌絲生物量分別為3.71±0.15g·L-1、6.19±0.12g·L-1、4.01±0.10g·L-1、2.33±0.11g·L-1，其中液體培養(yǎng)基B上菌絲生物量最大；4種液體培養(yǎng)基中菌絲球平均長度分別為4.5±0.3cm、4.77±0.35cm、3.73±0.15cm、2.7±0.1cm，在液體培養(yǎng)基B上的菌絲球平均長度最高。通過菌絲體生物量及菌絲球平均長度的比較分析，最終確定液體培養(yǎng)基B為蒙古口蘑菌種的最佳培養(yǎng)基配方。其他學(xué)者也對蒙古口蘑液體發(fā)酵進(jìn)行了深入研究。渠志臻[13]通過優(yōu)化接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速等蒙古口蘑液體搖瓶培養(yǎng)參數(shù)，最終測得培養(yǎng)13d后，菌絲體生物量增長到10.6g·L-1。張娟等[15]對巴音布魯克草原上分布的野生蒙古口蘑液體培養(yǎng)基的天然營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)10～15d后，其菌絲生物量可達(dá)6.848g·L-1。本研究初步篩選的液體培養(yǎng)基配方B，接種量遠(yuǎn)小于以上研究報道，并在培養(yǎng)5d后，其生物量就與張娟等研究報道的生物量相近，可見本研究篩選的液體培養(yǎng)基B相較具有一定優(yōu)勢。

2.4 蒙古口蘑菌種栽培種培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

選用3種栽培種培養(yǎng)基對蒙古口蘑菌種進(jìn)行培養(yǎng)，觀察記錄菌絲在栽培種培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，結(jié)果見圖7，并通過菌絲平均吃料深度篩選出最適合該種蒙古口蘑菌種生長的栽培種培養(yǎng)基配方，結(jié)果見圖8。經(jīng)過10d的栽培培養(yǎng)，以玉米為主料的栽培種培養(yǎng)基平均吃料深度為10.2±0.53cm；以高粱為主料的栽培種培養(yǎng)基平均吃料深度為11.36±0.72cm，并率先長滿栽培瓶；以小麥為主料的栽培種培養(yǎng)基平均吃料深度為8.66±0.26cm。綜合以上實驗數(shù)據(jù)顯示，以高粱為主料的栽培種培養(yǎng)基吃料深度最深，且菌絲茂密，生長狀態(tài)良好，由此確定高粱為主料是蒙古口蘑菌種的最優(yōu)栽培種培養(yǎng)基配方。魯鐵[3]對玉米粒、麥粒、大米、羊草、發(fā)酵羊草5種基質(zhì)進(jìn)行了蒙古口蘑固態(tài)發(fā)酵的最佳基質(zhì)的篩選，最終以滿瓶生長時間(32d)和成本確定玉米粒為較優(yōu)良的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。本研究以率先長滿栽培瓶的時間和菌絲吃料深度完善了篩選評價條件，并且菌絲生長時間和長勢明顯優(yōu)于魯鐵研究報道的玉米粒固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。

圖6 4種液體培養(yǎng)基上的菌絲體生物量和菌絲球平均長度

圖7 蒙古口蘑菌種在3種栽培種培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)

圖8 蒙古口蘑菌種在3種栽培種培養(yǎng)基中的吃料深度

3 結(jié)論

本文通過菌種分子鑒定、固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、栽培種培養(yǎng)基的篩選研究確定改良PDA培養(yǎng)基為蒙古口蘑菌種的最佳固體培養(yǎng)基配方，在培養(yǎng)32d后，菌絲干質(zhì)量達(dá)0.19±0.03g；確定液體培養(yǎng)基B為蒙古口蘑菌種的最佳液體培養(yǎng)基配方，在培養(yǎng)5d后，菌絲體生物量與菌絲生長長度分別為6.19g·L-1、2.7±0.1cm；確定以高粱為主料的栽培種培養(yǎng)基為蒙古口蘑菌種的最佳栽培種培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)10d后，其菌絲吃料深度為11.36±0.72cm。本研究最終選用固體、液體、栽培種3種培養(yǎng)基成分來源廣泛、配制方便、價格便宜，通過對蒙古口蘑菌種進(jìn)行改良，適用于大規(guī)模的推廣和應(yīng)用。以3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)菌種為進(jìn)一步保護(hù)和開發(fā)錫林郭勒草原白蘑提供科學(xué)基礎(chǔ)。