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    不同新冠病毒核酸檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果一致性的驗(yàn)證及分析評(píng)價(jià)

    2023-11-29 10:03:10李中秋季全義
    當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2023年21期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)系統(tǒng)

    李中秋,季全義

    (北京市密云區(qū)鼓樓社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科,北京 101500)

    2020 年1 月20 日國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布公告,將新型冠狀病毒感染的肺炎納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類(lèi)傳染病,并采取甲類(lèi)傳染病的預(yù)防、控制措施[1]。我區(qū)疾控在2022 年參加新冠病毒核酸檢測(cè)工作期間,嚴(yán)格執(zhí)行《新型冠狀病毒核酸檢測(cè)質(zhì)控與實(shí)驗(yàn)室生物安全管理規(guī)范》,確保能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和報(bào)告新型冠狀病毒感染的肺炎病例,有效遏制疫情播散和蔓延。其間,世界衛(wèi)生組織提出的“關(guān)切的變異株”有阿爾法、貝塔、伽瑪、德?tīng)査蛫W密克戎。當(dāng)時(shí)奧密克戎株感染病例已取代德?tīng)査瓿蔀橹饕餍兄闧2],在我國(guó)境內(nèi)常規(guī)使用的 PCR 檢測(cè)診斷準(zhǔn)確性未受到影響,新冠病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性仍為確診的首要標(biāo)準(zhǔn)。隨著我區(qū)常態(tài)化新冠疫情防控措施的落實(shí)落細(xì),檢測(cè)標(biāo)本量的不斷增加,傳統(tǒng)手工實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足現(xiàn)有檢測(cè)需要。高通量的病原體核酸提取檢測(cè)系統(tǒng)開(kāi)始在本實(shí)驗(yàn)室得到應(yīng)用。本文對(duì)兩種新冠病毒核酸檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)能力、結(jié)果一致性及生物安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證和分析。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    從菌毒種庫(kù)(-70℃)[3]中隨機(jī)選取2022 年10月—2022 年12 月已滅活確認(rèn)陽(yáng)性的新冠病毒感染(COVID-19)[4]者鼻咽拭子樣本16 例,陰性樣本4 例。

    1.2 儀器與試劑

    珀金埃爾默(PerkinElmer)explorer G3 高通量自動(dòng)化病原體核酸提取檢測(cè)系統(tǒng)(配置:Plate::handler Flex750 機(jī) 械 手 臂、3 臺(tái)Chemagic 360 核 酸 提 取 儀、JANUS G3 自動(dòng)化液體處理工作站、4titude 自動(dòng)封膜機(jī)、LiCONiC LPX280 儲(chǔ) 板 棧、BioTek MultiFlo 快 速分 液 器、2 臺(tái)LightCycler 480 Ⅱ?qū)?時(shí) 熒 光 定 量PCR儀)[5]、耐優(yōu)(NAYO)ES96 全自動(dòng)樣品處理系統(tǒng);ABI QuantStudio Dx 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 檢 測(cè) 儀、Chemagic360 全自動(dòng)核酸提取儀、北京大龍DM0636離心機(jī)、漩渦震蕩儀、手動(dòng)微量移液槍及吸頭。

    碩博源核酸提取純化試劑(Nucleic Acid Extraction and Purification Kit)、明德生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)。

    1.3 檢測(cè)方法

    本實(shí)驗(yàn)室按要求參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。兩種檢測(cè)系統(tǒng)分別設(shè)置一個(gè)弱陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控樣本和三個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)控樣本,對(duì)照樣本隨機(jī)放在待測(cè)樣本中間,同批參與核酸檢測(cè)。所有試劑均在有效期內(nèi)。使用明德生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒,靶基因?yàn)?ORFlab 和N 基因序列,以人類(lèi)管家基因RNaseP作為內(nèi)標(biāo),以保障檢測(cè)結(jié)果的特異性與準(zhǔn)確性。弱陽(yáng)性和三個(gè)陰性對(duì)照樣本的檢測(cè)結(jié)果均滿(mǎn)足質(zhì)量控制要求時(shí),方可進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判定。

    1.3.1 珀金埃爾默explorer G3 高通量自動(dòng)化病原體核酸提取檢測(cè)系統(tǒng) 通過(guò)耐優(yōu)ES96 全自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)、珀金埃爾默explorer G3 檢測(cè)系統(tǒng)及相關(guān)試劑耗材,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化核酸提取、PCR 體系構(gòu)建、自動(dòng)封膜、在線qPCR 擴(kuò)增分析。

    1.3.2 傳統(tǒng)ABI QuantStudio Dx 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng) 在樣本準(zhǔn)備區(qū)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行樣本提取,使用Chemagic360 核酸提取儀進(jìn)行提取純化操作。在試劑準(zhǔn)備區(qū),取出 N 個(gè)(四個(gè)陰陽(yáng)性質(zhì)控品數(shù)+ 待檢樣本數(shù))PCR 反應(yīng)管,加好反應(yīng)液。在樣本準(zhǔn)備區(qū)行加樣封膜瞬時(shí)離心后,移至擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。在ABI QuantStudio Dx 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)儀上設(shè)置樣品名稱(chēng),選擇熒光檢測(cè)通道,設(shè)定循環(huán)參數(shù)后進(jìn)行核酸檢測(cè)。

    1.4 檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

    陰性質(zhì)控要求: ROX 通道擴(kuò)增曲線無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)或Ct ≥35, FAM 與VIC / HEX 通道擴(kuò)增曲線無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)或 Ct ≥40。陽(yáng)性質(zhì)控要求: FAM 、 VIC / HEX 、 ROX三個(gè)通道擴(kuò)增曲線均呈指數(shù)增長(zhǎng)且 Ct <35。

    1.4.1 陽(yáng)性陰性判定值 利用 ROC 曲線法確定陽(yáng)性陰性: FAM 通道擴(kuò)增曲線呈指數(shù)增長(zhǎng)且 Ct <38 為FAM 陽(yáng)性;FAM 通道擴(kuò)增曲線無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)或Ct ≥40為 FAM 陰性。 VIC / HEX 通道擴(kuò)增曲線呈指數(shù)增長(zhǎng)且 Ct <38 為 VIC / HEX 陽(yáng)性;VIC / HEX 通道擴(kuò)增曲線無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)或Ct ≥40 為 VIC / HEX 陰性。ROX 通道擴(kuò)增曲線呈指數(shù)增長(zhǎng)且 Ct <35 為 ROX 陽(yáng)性; ROX 通道擴(kuò)增曲線無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)或 Ct ≥35 為ROX 陰性。

    1.4.2 樣品檢測(cè)結(jié)果判定 陽(yáng)性樣本判定標(biāo)準(zhǔn): FAM 、VIC / HEX 和 ROX 三個(gè)通道均為陽(yáng)性,可報(bào)告為陽(yáng)性樣本。陰性樣本判定標(biāo)準(zhǔn): ROX 通道為陽(yáng)性, FAM 與VIC / HEX 通道為陰性,可報(bào)告為陰性樣本。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    通過(guò)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)中配對(duì)定量資料的t檢驗(yàn)比較兩種系統(tǒng)檢測(cè)新冠病毒樣本的靶基因原始Ct 值有無(wú)差異。采用Kappa 一致性檢驗(yàn)對(duì)兩種檢測(cè)系統(tǒng)陰陽(yáng)性結(jié)果的四格表數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果

    兩種系統(tǒng)檢測(cè)20 份新冠病毒樣本的靶基因(ORF1ab 和N 基因)原始Ct 值見(jiàn)表1、表2。計(jì)算t值為0.446,t0.05/2,19=2.093,|t|<t0.05/2,19,故P>0.05,兩種系統(tǒng)檢測(cè)新冠病毒樣本的ORF1ab 基因Ct 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算t值為0.291,t0.05/2,19=2.093,|t| <t0.05/2,19,故P>0.05,兩種系統(tǒng)檢測(cè)新冠病毒樣本的N 基因Ct 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 兩種系統(tǒng)檢測(cè)ORF1ab 基因原始Ct 值

    表2 兩種系統(tǒng)檢測(cè)N 基因原始Ct 值

    兩種系統(tǒng)檢測(cè)20 份新冠病毒樣本,ROX 通道(為內(nèi)控RNaseP 指示通道)均為陽(yáng)性,判定結(jié)果詳見(jiàn)表3。兩種系統(tǒng)檢測(cè)新冠病毒樣本的靶基因原始Ct 值經(jīng)過(guò)“樣品檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)”中陰陽(yáng)性結(jié)果判定后,整理成配對(duì)設(shè)計(jì)的四格表數(shù)據(jù),采用Kappa 一致性檢驗(yàn)進(jìn)行分析,Kappa 系數(shù)=1,兩種系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的一致性非常好。

    表3 兩種系統(tǒng)檢測(cè)新冠病毒樣本陰陽(yáng)性結(jié)果

    3 討論

    核酸檢測(cè)的生物安全、效率、準(zhǔn)確性是疫情防控工作中最重要的一環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 核酸檢測(cè)是新冠檢測(cè)公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn),本文對(duì)兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR 核酸檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比分析的結(jié)果顯示:兩種系統(tǒng)檢測(cè)新冠病毒樣本的靶基因(ORF1ab 和N 基因)Ct 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,陰陽(yáng)性判定檢測(cè)結(jié)果的一致性非常好。ABI QuantStudio Dx 相關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)從核酸提取、試劑配制到PCR 檢測(cè)的操作和銜接過(guò)程都需要進(jìn)行大量精細(xì)操作,生物安全風(fēng)險(xiǎn)較大,操作空間至少需要三室,耗費(fèi)大量人力、時(shí)間,因此無(wú)法滿(mǎn)足日益增加的檢測(cè)需求;反觀珀金埃爾默explorer G3相關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化工作流程和操作步驟,全自動(dòng)流程減少了檢驗(yàn)人員與樣本接觸,有效降低了感染風(fēng)險(xiǎn), 并大幅減少了人力需求;樣本通量高,可全天候運(yùn)行,迅速提升病毒檢測(cè)能力;移液精度高,可減少人為失誤;設(shè)備占用空間小,生物安全隱患小。

    綜上所述,傳統(tǒng)手工核酸檢測(cè)系統(tǒng)在樣本量較少的情況下,可基本滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室需要,并可用于自動(dòng)化核酸提取系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的復(fù)核檢測(cè)。自動(dòng)化核酸提取系統(tǒng)適合大批量檢測(cè),其同樣具有良好的精確度和準(zhǔn)確性,有利于進(jìn)行質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化。在新型冠狀病毒大流行結(jié)束后,高通量自動(dòng)化病原體核酸提取相關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)因其為模塊化設(shè)計(jì)的自動(dòng)化整合系統(tǒng),能夠根據(jù)疫情需要,迅速調(diào)整檢測(cè)規(guī)模,同時(shí)也可用于其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),可見(jiàn)此系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。

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