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    不同新冠病毒核酸檢測系統(tǒng)結果一致性的驗證及分析評價

    2023-11-29 10:03:10李中秋季全義
    當代醫(yī)藥論叢 2023年21期
    關鍵詞:檢測系統(tǒng)

    李中秋,季全義

    (北京市密云區(qū)鼓樓社區(qū)衛(wèi)生服務中心檢驗科,北京 101500)

    2020 年1 月20 日國家衛(wèi)生健康委發(fā)布公告,將新型冠狀病毒感染的肺炎納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病,并采取甲類傳染病的預防、控制措施[1]。我區(qū)疾控在2022 年參加新冠病毒核酸檢測工作期間,嚴格執(zhí)行《新型冠狀病毒核酸檢測質(zhì)控與實驗室生物安全管理規(guī)范》,確保能及時發(fā)現(xiàn)和報告新型冠狀病毒感染的肺炎病例,有效遏制疫情播散和蔓延。其間,世界衛(wèi)生組織提出的“關切的變異株”有阿爾法、貝塔、伽瑪、德爾塔和奧密克戎。當時奧密克戎株感染病例已取代德爾塔株成為主要流行株[2],在我國境內(nèi)常規(guī)使用的 PCR 檢測診斷準確性未受到影響,新冠病毒核酸檢測陽性仍為確診的首要標準。隨著我區(qū)常態(tài)化新冠疫情防控措施的落實落細,檢測標本量的不斷增加,傳統(tǒng)手工實時熒光定量PCR檢測方法已經(jīng)不能滿足現(xiàn)有檢測需要。高通量的病原體核酸提取檢測系統(tǒng)開始在本實驗室得到應用。本文對兩種新冠病毒核酸檢測系統(tǒng)的檢測能力、結果一致性及生物安全風險進行了驗證和分析。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    從菌毒種庫(-70℃)[3]中隨機選取2022 年10月—2022 年12 月已滅活確認陽性的新冠病毒感染(COVID-19)[4]者鼻咽拭子樣本16 例,陰性樣本4 例。

    1.2 儀器與試劑

    珀金埃爾默(PerkinElmer)explorer G3 高通量自動化病原體核酸提取檢測系統(tǒng)(配置:Plate::handler Flex750 機 械 手 臂、3 臺Chemagic 360 核 酸 提 取 儀、JANUS G3 自動化液體處理工作站、4titude 自動封膜機、LiCONiC LPX280 儲 板 棧、BioTek MultiFlo 快 速分 液 器、2 臺LightCycler 480 Ⅱ?qū)?時 熒 光 定 量PCR儀)[5]、耐優(yōu)(NAYO)ES96 全自動樣品處理系統(tǒng);ABI QuantStudio Dx 實 時 熒 光 定 量PCR 檢 測 儀、Chemagic360 全自動核酸提取儀、北京大龍DM0636離心機、漩渦震蕩儀、手動微量移液槍及吸頭。

    碩博源核酸提取純化試劑(Nucleic Acid Extraction and Purification Kit)、明德生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)。

    1.3 檢測方法

    本實驗室按要求參加室間質(zhì)量評價。兩種檢測系統(tǒng)分別設置一個弱陽性對照質(zhì)控樣本和三個陰性對照質(zhì)控樣本,對照樣本隨機放在待測樣本中間,同批參與核酸檢測。所有試劑均在有效期內(nèi)。使用明德生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒,靶基因為 ORFlab 和N 基因序列,以人類管家基因RNaseP作為內(nèi)標,以保障檢測結果的特異性與準確性。弱陽性和三個陰性對照樣本的檢測結果均滿足質(zhì)量控制要求時,方可進行檢測結果的判定。

    1.3.1 珀金埃爾默explorer G3 高通量自動化病原體核酸提取檢測系統(tǒng) 通過耐優(yōu)ES96 全自動樣品處理系統(tǒng)、珀金埃爾默explorer G3 檢測系統(tǒng)及相關試劑耗材,實現(xiàn)自動化核酸提取、PCR 體系構建、自動封膜、在線qPCR 擴增分析。

    1.3.2 傳統(tǒng)ABI QuantStudio Dx 實時熒光定量PCR 檢測系統(tǒng) 在樣本準備區(qū)生物安全柜內(nèi)進行樣本提取,使用Chemagic360 核酸提取儀進行提取純化操作。在試劑準備區(qū),取出 N 個(四個陰陽性質(zhì)控品數(shù)+ 待檢樣本數(shù))PCR 反應管,加好反應液。在樣本準備區(qū)行加樣封膜瞬時離心后,移至擴增和產(chǎn)物分析區(qū)。在ABI QuantStudio Dx 實時熒光定量PCR 檢測儀上設置樣品名稱,選擇熒光檢測通道,設定循環(huán)參數(shù)后進行核酸檢測。

    1.4 檢測結果判定標準

    陰性質(zhì)控要求: ROX 通道擴增曲線無指數(shù)增長或Ct ≥35, FAM 與VIC / HEX 通道擴增曲線無指數(shù)增長或 Ct ≥40。陽性質(zhì)控要求: FAM 、 VIC / HEX 、 ROX三個通道擴增曲線均呈指數(shù)增長且 Ct <35。

    1.4.1 陽性陰性判定值 利用 ROC 曲線法確定陽性陰性: FAM 通道擴增曲線呈指數(shù)增長且 Ct <38 為FAM 陽性;FAM 通道擴增曲線無指數(shù)增長或Ct ≥40為 FAM 陰性。 VIC / HEX 通道擴增曲線呈指數(shù)增長且 Ct <38 為 VIC / HEX 陽性;VIC / HEX 通道擴增曲線無指數(shù)增長或Ct ≥40 為 VIC / HEX 陰性。ROX 通道擴增曲線呈指數(shù)增長且 Ct <35 為 ROX 陽性; ROX 通道擴增曲線無指數(shù)增長或 Ct ≥35 為ROX 陰性。

    1.4.2 樣品檢測結果判定 陽性樣本判定標準: FAM 、VIC / HEX 和 ROX 三個通道均為陽性,可報告為陽性樣本。陰性樣本判定標準: ROX 通道為陽性, FAM 與VIC / HEX 通道為陰性,可報告為陰性樣本。

    1.5 統(tǒng)計學分析

    通過醫(yī)學統(tǒng)計學中配對定量資料的t檢驗比較兩種系統(tǒng)檢測新冠病毒樣本的靶基因原始Ct 值有無差異。采用Kappa 一致性檢驗對兩種檢測系統(tǒng)陰陽性結果的四格表數(shù)據(jù)進行分析。

    2 結果

    兩種系統(tǒng)檢測20 份新冠病毒樣本的靶基因(ORF1ab 和N 基因)原始Ct 值見表1、表2。計算t值為0.446,t0.05/2,19=2.093,|t|<t0.05/2,19,故P>0.05,兩種系統(tǒng)檢測新冠病毒樣本的ORF1ab 基因Ct 值差異無統(tǒng)計學意義。計算t值為0.291,t0.05/2,19=2.093,|t| <t0.05/2,19,故P>0.05,兩種系統(tǒng)檢測新冠病毒樣本的N 基因Ct 值差異無統(tǒng)計學意義。

    表1 兩種系統(tǒng)檢測ORF1ab 基因原始Ct 值

    表2 兩種系統(tǒng)檢測N 基因原始Ct 值

    兩種系統(tǒng)檢測20 份新冠病毒樣本,ROX 通道(為內(nèi)控RNaseP 指示通道)均為陽性,判定結果詳見表3。兩種系統(tǒng)檢測新冠病毒樣本的靶基因原始Ct 值經(jīng)過“樣品檢測結果判定標準”中陰陽性結果判定后,整理成配對設計的四格表數(shù)據(jù),采用Kappa 一致性檢驗進行分析,Kappa 系數(shù)=1,兩種系統(tǒng)檢測結果的一致性非常好。

    表3 兩種系統(tǒng)檢測新冠病毒樣本陰陽性結果

    3 討論

    核酸檢測的生物安全、效率、準確性是疫情防控工作中最重要的一環(huán)。實時熒光定量PCR 核酸檢測是新冠檢測公認的金標準,本文對兩種實時熒光定量PCR 核酸檢測系統(tǒng)進行對比分析的結果顯示:兩種系統(tǒng)檢測新冠病毒樣本的靶基因(ORF1ab 和N 基因)Ct 值差異無統(tǒng)計學意義,陰陽性判定檢測結果的一致性非常好。ABI QuantStudio Dx 相關檢測系統(tǒng)從核酸提取、試劑配制到PCR 檢測的操作和銜接過程都需要進行大量精細操作,生物安全風險較大,操作空間至少需要三室,耗費大量人力、時間,因此無法滿足日益增加的檢測需求;反觀珀金埃爾默explorer G3相關檢測系統(tǒng)可實現(xiàn)自動化和標準化工作流程和操作步驟,全自動流程減少了檢驗人員與樣本接觸,有效降低了感染風險, 并大幅減少了人力需求;樣本通量高,可全天候運行,迅速提升病毒檢測能力;移液精度高,可減少人為失誤;設備占用空間小,生物安全隱患小。

    綜上所述,傳統(tǒng)手工核酸檢測系統(tǒng)在樣本量較少的情況下,可基本滿足實驗室需要,并可用于自動化核酸提取系統(tǒng)檢測結果的復核檢測。自動化核酸提取系統(tǒng)適合大批量檢測,其同樣具有良好的精確度和準確性,有利于進行質(zhì)量控制和標準化。在新型冠狀病毒大流行結束后,高通量自動化病原體核酸提取相關檢測系統(tǒng)因其為模塊化設計的自動化整合系統(tǒng),能夠根據(jù)疫情需要,迅速調(diào)整檢測規(guī)模,同時也可用于其他實驗室檢測,可見此系統(tǒng)的廣泛應用是實驗室檢測未來發(fā)展的趨勢。

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