青皮飲片、水煎液、配方顆粒的超高效液相色譜指紋圖譜相關(guān)性研究

林榮楷 黃醒鵬 陳偉媚 邱彩月 馮倩儀 劉遠(yuǎn)俊 張正

青皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮。青皮性溫,味苦、辛,歸肝、膽、胃經(jīng),有疏肝破氣、消積化滯的功效,可用于胸脅脹痛、食積氣滯等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明,青皮主要含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類、氨基酸類等化學(xué)成分,具有抗氧化、抗休克、抗心律失常、利膽等藥理作用[2-3]。

青皮配方顆粒是由青皮飲片經(jīng)水提、固液分離、濃縮、干燥、制粒等步驟制備而成的顆粒,其因具備良好的藥效,加上具有免煎煮、服用方便的優(yōu)勢(shì),在臨床上被廣泛使用?！吨兴幣浞筋w粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》由國家藥典委員會(huì)于2021年2月10日發(fā)布,其中對(duì)中藥材、飲片、中間體、配方顆粒特征或指紋圖譜做了“應(yīng)具有相關(guān)性”的明確指示。目前關(guān)于青皮的特征圖譜研究中,都是關(guān)于青皮藥材、飲片、配方顆粒等的單一圖譜研究[4-5]。因此,本研究擬對(duì)青皮配方顆粒原材料—中間體—終產(chǎn)品,即青皮飲片—水煎液—配方顆粒的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)指紋圖譜,以聚類分析(cluster analysis,CA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)及正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段進(jìn)行相關(guān)性研究,以期為青皮配方顆粒的生產(chǎn)過程控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters H-class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司);XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(德國Merck公司);SODA-12型噴霧干燥儀(上海大川原干燥設(shè)備有限公司);LGS20型干法制粒機(jī)(南京迦南科技有限公司)。

1.2 試藥

辛弗林(批號(hào):110727-202110,純度99.80%)、橙皮苷(批號(hào):110721-202019,純度95.30%)、川陳皮素(批號(hào):112055-202102,純度99.70%)、橘皮素(批號(hào):112054-202102,純度99.70%)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院;蕓香柚皮苷(批號(hào):ST05590120,純度98.00%)對(duì)照品購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司;香蜂草苷(批號(hào):17120103,純度99.54%)對(duì)照品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;甲酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司),水為超純水,其余試劑為分析純。

15批青皮藥材(編號(hào):S1～S15)經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定均為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥幼果,符合2020年版《中國藥典》一部青皮項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定,藥材產(chǎn)地信息見表1。15批青皮飲片(編號(hào):Y1～Y15)由15批青皮藥材嚴(yán)格按照2020年版《中國藥典》一部青皮項(xiàng)下飲片炮制規(guī)定進(jìn)行炮制[1];15批青皮水煎液(編號(hào):J1～J15)由15批青皮飲片按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》的藥材煎煮方法相關(guān)要求進(jìn)行制備;15批青皮配方顆粒(編號(hào):P1～P15)由15批青皮水煎液經(jīng)濃縮、干燥、制粒等步驟制得。

表1 15批青皮藥材的產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B);梯度洗脫(0～2分鐘,1%→8% A;2～5分鐘,8%→13% A;5～12分鐘,13%→19% A;12～13分鐘,19%→22% A;13～20分鐘,22%→35% A;20～21分鐘,35%→51% A;21～30分鐘,51%→54% A);流速:0.3 mL/min;柱溫:40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm;進(jìn)樣量:1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為15.802、55.633、65.720、55.154、80.268、80.824 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 青皮飲片供試品溶液 取青皮飲片粉末(過六號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加10%甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用10%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得飲片供試品溶液。

2.3.2 青皮水煎液供試品溶液 精密量取青皮水煎液10 mL,置具塞錐形瓶中,加12.5%甲醇40 mL,稱定重量,按“2.3.1”項(xiàng)下制備方法,自“加熱回流”起,依法制備,即得水煎液供試品溶液。

2.3.3 青皮配方顆粒供試品溶液 取青皮配方顆粒適量,研細(xì),取約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加10%甲醇50 mL,稱定重量,按“2.3.1”項(xiàng)下制備方法,自“加熱回流”起,依法制備,即得配方顆粒供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果如圖1所示,供試品溶液與對(duì)照品溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間處具有相同的色譜峰,且空白溶劑無干擾,表明該方法專屬性良好。

注:峰1:辛弗林;峰3:蕓香柚皮苷;峰4:橙皮苷;峰5:香蜂草苷;峰6:川陳皮素;峰7:橘皮素;A:空白溶劑;B:混合對(duì)照品溶液;C:飲片供試品溶液;D:水煎液供試品溶液;E:配方顆粒供試品溶液。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以4號(hào)峰橙皮苷為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),均小于3%,表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取青皮飲片粉末(編號(hào):Y2),精密稱定6份,按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以4號(hào)峰橙皮苷為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD,均小于3%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取青皮飲片粉末(編號(hào):Y2),精密稱定,按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在制備0、2、4、8、12、24小時(shí)后進(jìn)樣測(cè)定。以4號(hào)色譜峰橙皮苷為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD,均小于3%,表明青皮飲片供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 UPLC指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

2.5.1 指紋圖譜的建立 分別取15批青皮飲片、水煎液及配方顆粒,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”分別對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配,建立共有模式圖,并分別生成對(duì)照指紋圖譜R1、R2和R3,結(jié)果如圖2～4所示。15批青皮飲片、水煎液及配方顆粒的UPLC指紋圖譜均標(biāo)記出7個(gè)相同的共有峰,通過與對(duì)照品圖譜對(duì)比,確定1號(hào)峰為辛弗林、3號(hào)峰為蕓香柚皮苷、4號(hào)峰橙皮苷、5號(hào)峰為香蜂草苷、6號(hào)峰為川陳皮素、7號(hào)峰為橘皮素。

圖2 15批青皮飲片的UPLC指紋圖譜堆疊圖(對(duì)照指紋圖譜R1)

圖3 15批青皮水煎液的UPLC指紋圖譜堆疊圖(對(duì)照指紋圖譜R2)

圖4 15批青皮配方顆粒的UPLC指紋圖譜堆疊圖(對(duì)照指紋圖譜R3)

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 將15批青皮飲片、水煎液及配方顆粒UPLC指紋圖譜的數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件,分別計(jì)算各批次青皮飲片、水煎液及配方顆粒指紋圖譜與各自對(duì)照?qǐng)D譜的相似度,結(jié)果見表2。15批青皮飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜與其相應(yīng)對(duì)照指紋圖譜的相似度分別大于0.890、0.910、0.910,相似度較高,表明不同批次青皮飲片、水煎液、配方顆粒間的質(zhì)量均較為穩(wěn)定。

表2 15批青皮飲片、水煎液及其配方顆粒UPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5.3 對(duì)照指紋圖譜的比較 將15批青皮飲片、水煎液及配方顆粒UPLC指紋圖譜生成的對(duì)照指紋圖譜R1、R2和R3導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件,結(jié)果見表3和圖5。青皮飲片、水煎液、配方顆粒三者對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均大于0.970,表明三者對(duì)照指紋圖譜的主要色譜峰一致,青皮飲片經(jīng)水煎煮后成分無明顯變化,反映出青皮配方顆粒的制備工藝穩(wěn)定可行。

注:峰1:辛弗林;峰3:蕓香柚皮苷;峰4:橙皮苷;峰5:香蜂草苷;峰6:川陳皮素;峰7:橘皮素。

表3 青皮飲片、水煎液、配方顆粒的對(duì)照指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.6.1 共有峰相關(guān)性分析 以15批青皮飲片、水煎液、配方顆粒共45個(gè)樣品各特征峰的“峰面積占比”值(各特征峰峰面積占特征峰總面積的比例)為變量,利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)性分析[7],結(jié)果見表4。青皮飲片分別與水煎液、配方顆粒比較,辛弗林、蕓香橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素均具有極顯著的正相關(guān)性關(guān)系,峰2具有顯著的正相關(guān)關(guān)系;青皮水煎液與配方顆粒比較,全部共有峰均具有極顯著的正相關(guān)性關(guān)系。

表4 15批青皮飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關(guān)性分析結(jié)果

2.6.2 聚類分析(CA) 以15批青皮飲片、水煎液、配方顆粒共45個(gè)樣品各特征峰峰面積為變量,利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行聚類分析[8],結(jié)果如圖6。CA結(jié)果顯示,45個(gè)樣品可聚為兩類,青皮飲片單獨(dú)聚為一類,青皮水煎液和青皮配方顆粒聚為一類,說明水煎液與配方顆粒的指紋圖譜較為相似,質(zhì)量更為接近。

圖6 青皮飲片、水煎液和配方顆粒UPLC指紋圖譜CA圖

2.6.3 主成分分析(PCA) 以15批青皮飲片、水煎液和配方顆粒共45個(gè)樣品各特征峰的峰面積為變量,利用SPSS 26.0軟件,進(jìn)行主成分分析[9],PCA結(jié)果以特征值>1為分析標(biāo)準(zhǔn),提取得到2個(gè)主成分,計(jì)算其特征值和方差貢獻(xiàn)率及主成分因子載荷矩陣,結(jié)果見表5～6。由結(jié)果可知,前兩個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為89.250%,能較全面地反映青皮指紋圖譜的基本信息。主成分1的特征值為4.343,方差貢獻(xiàn)率為62.039%,載荷較高的峰有辛弗林、峰2、蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷和川陳皮素,表明這6個(gè)峰主要反映主成分1的信息;主成分2的特征值為1.905,方差貢獻(xiàn)率為27.211%,載荷較高的峰有橘皮素,表明橘皮素主要反映主成分2的信息。由圖7可知,青皮飲片與其他樣品距離較遠(yuǎn),表明青皮水煎液與配方顆粒中的部分成分含量與飲片存在一定差異,這可能是由于水煎液的的提取溶劑為水,未能將飲片中低極性成分提取完全;水煎液與配方顆粒樣品相互交叉,相距較近,表明青皮水煎液與配方顆粒在成分上具有較大相關(guān)性,差異較小,與CA結(jié)果一致。

圖7 青皮飲片、水煎液和配方顆粒UPLC指紋圖譜主成分得分圖

表5 青皮飲片、水煎液和配方顆粒UPLC指紋圖譜PCA特征值及方差貢獻(xiàn)率

表6 青皮飲片、水煎液和配方顆粒UPLC指紋圖譜主成分因子載荷矩陣

2.6.4 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 以15批青皮飲片、水煎液和配方顆粒共45個(gè)樣品各特征峰峰面積為變量,利用SIMCA 14.1軟件,進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析[10],結(jié)果如圖8～9所示。由模型參數(shù)可知,數(shù)據(jù)矩陣的模型解釋率R2X(cum)為0.904,模型區(qū)分率R2Y(cum)為0.654,模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2(cum)為0.572。45個(gè)樣品可大致分成2類,水煎液和配方顆粒更為接近,與CA、PCA結(jié)果一致。以VIP值大于1為分析標(biāo)準(zhǔn),得出結(jié)論:橙皮苷、川陳皮素、蕓香柚皮苷是影響分類的主要標(biāo)志性成分。

圖9 15批青皮飲片、水煎液及配方顆粒OPLS-DA VIP值圖

3 結(jié)論

中藥配方顆粒是20世紀(jì)末以來,我國對(duì)中藥傳統(tǒng)湯劑劑型進(jìn)行積極“轉(zhuǎn)型”的適配產(chǎn)物之一,是傳統(tǒng)中藥飲片具創(chuàng)新性的應(yīng)用形式[11]。郭東曉等[12]提出,過程評(píng)價(jià)的開展有助于配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的完整性。

本研究對(duì)青皮配方顆粒飲片、水煎液、配方顆粒的UPLC指紋圖譜相關(guān)性進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明,三者的UPLC指紋圖譜均確立了7個(gè)共有峰,并指認(rèn)了其中6個(gè)共有峰。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明,青皮飲片、水煎液、配方顆粒三者對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均大于0.970,表明三者的化學(xué)成分基本一致;斯皮爾曼相關(guān)性分析結(jié)果顯示,辛弗林、蕓香橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素在青皮飲片、水煎液及配方顆粒之間均呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性。CA、PCA和OPLS-DA結(jié)果均顯示,青皮飲片單獨(dú)聚為一類,水煎液和配方顆粒聚為一類,可能是由于橙皮苷等成分水溶性較差[13]、水煎液提取溶劑與飲片供試品提取溶劑極性差異等造成的;而從水煎液到配方顆粒,各類化學(xué)成分均得到較好的轉(zhuǎn)移,說明青皮配方顆粒的制備工藝穩(wěn)定、合理。OPLS-DA結(jié)果顯示,橙皮苷、蕓香柚皮苷、川陳皮素是影響分類的主要標(biāo)志性成分,說明這三個(gè)成分含量在生產(chǎn)過程中變化較明顯。

綜上,青皮配方顆粒飲片、水煎液、配方顆粒的UPLC指紋圖譜符合國家藥典委員會(huì)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》一文“應(yīng)具有相關(guān)性”的要求,表明所選制備工藝穩(wěn)定、可行。

本研究闡明了青皮配方顆粒與飲片、水煎液在化學(xué)成分上的相關(guān)性與差異性,為青皮配方顆粒的生產(chǎn)過程質(zhì)量控制及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了研究基礎(chǔ);同時(shí)也進(jìn)一步完善了中藥配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的完整性,將有助于中藥配方顆粒的進(jìn)一步推廣與使用。