豬PFN1基因在骨骼肌組織中的表達模式及多態(tài)性研究

李新荻,王 宇,盧 鴻,羅布白珍,何辰慶,段夢琪,葉幼榮,張 健,商 鵬*

(1. 西藏農牧學院動物科學學院,西藏 林芝 860000;2. 西藏特色農牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,西藏 林芝 860000;3. 林芝市巴宜區(qū)畜牧獸醫(yī)總站,西藏 林芝 860000)

前纖維蛋白1(Profilin-1,PFN1)是一種在組織中廣泛表達的基因,幾乎與所有細胞功能相關聯(lián),是進化過程中高度保守的肌動蛋白單體結合蛋白(G-actin),分子量為12～15 kDa[1]。骨骼肌由肌纖維組成,肌原纖維是骨骼肌收縮的物質基礎;肌原纖維由粗、細肌絲構成,肌動蛋白為細肌絲的重要組分之一[2]。PFN1作為Profilin家族的首要成員,通過介導G-actin聚合影響細胞骨架的動態(tài)重組以響應胞內外信號,來調控許多重要的細胞活動過程[3]例如,細胞分裂和分化、細胞形態(tài)建成和保持等[4]。目前,對于PFN1基因的研究主要集中在因其缺失引起的細胞功能障礙和突變導致的癌癥引發(fā)機制上[1],關于PFN1基因在骨骼肌中的功能探索尚處于空白,在豬上的相關研究亦未見報道。

藏豬是我國唯一的高原、高寒放牧型豬種[5],多采用放牧為主、舍飼為輔的傳統(tǒng)養(yǎng)殖方式,其育肥豬增重緩慢、育肥期甚長[6]。藏豬以其胴體肉質細嫩、多汁、色鮮、味美與獨有的地域特色風味[7],成為消費者的饋贈佳品與餐桌佳肴。藏豬為小型豬種,發(fā)育期長、生長緩慢[6],難以滿足藏豬肉市場消費的漲幅,如何在保證肉質的前提下提高藏豬肉產量成為當下亟待解決的問題。本研究選用了30、90、180日齡三個不同生長階段的西藏本土小型豬—藏豬,快速生長型豬—大約克豬為研究對象;通過對PFN1基因多態(tài)性與mRNA表達規(guī)律分析,初步探索PFN1基因在藏豬與大約克豬骨骼肌中的作用,為后續(xù)改良藏豬肉品質同時提高藏豬肉產量的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集藏豬(n=40,飼養(yǎng)于西藏某藏豬開發(fā)有限公司)、大約克豬(n=40,飼養(yǎng)于林芝市某生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司)耳組織樣品,置于75%酒精中,-20 ℃保存,用于后續(xù)DNA提取。分別在30日齡(哺乳期結束)、90日齡(保育期結束)、180日齡(快速生長期)各隨頭機挑選8頭藏豬、7頭大約克豬屠宰,采集腿肌、背最長肌組織樣品,迅速放入液氮,轉置于-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制備

用苯酚-氯仿抽提法提取豬DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。用Trizol提取法進行總RNA提取;用快速反轉錄cDNA試劑盒(北京天根生化科技有限公司,KR180123)合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。用NanoDrop 2000(Thermo公司生產)分別檢測DNA、RNA的純度和濃度;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA、RNA的完整性。

1.3 引物設計與合成

1.3.1 基因分型引物 登錄GenBank下載豬PFN1基因CDS區(qū)(登錄號:NM_001244416.1)與啟動子區(qū)域的DNA序列(登錄號:NC_010454.4),使用Primer Premier 5.0軟件及NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站設計基因分型引物(表1)。

表1 PFN1基因5'側翼區(qū)、CDS區(qū)引物信息Table 1 5'-flanking region of PFN1 gene and primer information of CDS region

1.3.2 定量引物 下載GenBank中豬PFN1的mRNA序列,以GAPDH作為內參基因,利用NCBI BLAST網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)設計RT-qPCR引物(表2),用于基因的組織表達分析。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 PFN1基因和GAPDH基因定量引物信息Table 2 Quantitative primer information of PFN1 gene and GAPDH gene

1.4 PCR擴增與測序

以藏豬和大約克豬的cDNA、DNA為模板,分別擴增PFN1基因的CDS區(qū)域、5'UTR啟動子區(qū)域;PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用Sanger測序法對條帶明亮單一,長度正確的PCR產物進行混池測序(TP、YP各10頭)和個體測序(TP、YP各40頭)。

1.5 基因頻率、基因型頻率和轉錄因子預測

使用ChromasPro和SnapGene軟件對測序結果進行分析,統(tǒng)計各個突變位點的基因型頻率和基因頻率;用在線軟件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)對PFN1基因的SNPs位點進行轉錄因子預測。

1.6 RT-qPCR

以cDNA為模板,以GAPDH作為內參基因,檢測PNF1基因的mRNA相對表達量;每個樣品組設置3個重復;qRT-PCR 20 μL反應體系:SYBR Green Mix(北京天根生化科技有限公司,FP171206)10 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL;RNase-free ddH2O 7.8 μL;cDNA模板1 μL。qRT-PCR擴增程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s;59 ℃退火30 s;72 ℃延伸20 s;72 ℃延伸5 min;共40個循環(huán)。mRNA的相對表達量使用2-ΔΔCt法[8]進行計算。

1.7 統(tǒng)計分析

利用IBM SPSS Statistics 23軟件測定PFN1基因表達量的差異顯著性,測定結果以P值(P-value)表示:P<0.05 時差異顯著,P<0.01 時差異極顯著,P>0.05 時差異不顯著[9];使用Pearson's chi-squared test、Fisher Exact test對PFN1基因的基因型頻率和基因頻率進行卡方檢驗(χ2- test):χ2越大,樣本的實際觀測值與理論推斷值之間的偏離程度越大;χ2越小,二者偏差越小;表明理論值與觀測值越相符。

2 結果與分析

2.1 SNPs位點

Sanger測序結果發(fā)現(xiàn),在PFN1基因5'UTR起始密碼子上游2 500 bp啟動子區(qū)域共發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點(圖1):-31 bp處發(fā)現(xiàn)T/C突變,記為T-31C;-1401 bp處發(fā)現(xiàn)A/G突變,記為A-1401G;-1542 bp處發(fā)現(xiàn)C/T突變,記為C-1542T。PFN1基因CDS區(qū)無突變。

圖1 PFN1 基因突變位點測序峰圖a. T-31C位點;b. A-1401G;c. C-1542TFig.1 Sequencing peak of PFN1 mutation sitesa. The T-31C site; b. The A-1401G site; c. The C-1542T site

2.2 基因頻率和基因型頻率

由表3可知,在PFN1基因5'UTR啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點,其中A-1401G、C-1542T為連鎖突變位點(即A-1401G位點出現(xiàn)A到G堿基的突變,同時存在C-1542T位點C到T堿基的突變)。在T-31C位點存在TT、TC、CC三種基因型,藏豬優(yōu)勢等位基因型為CC型;在A-1401G位點存在AA、AG、GG三種基因型,藏豬優(yōu)勢等位基因型為GG型;在C-1542T位點存在CC、CT、TT三種基因型,藏豬優(yōu)勢等位基因型為TT型。于藏豬與大約克豬中的等位基因頻率和基因型頻率均存在極顯著差異(P<0.01);兩個豬品種內均符合Hardy-Weinberg平衡[10](P>0.05)。

表3 PFN1基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率Table 3 Genotype distribution and allele frequency of PFN1 Gene polymorphic site

表4 PFN1基因SNPs位點轉錄因子預測結果 Table 4 Transcription factors prediction result of PFN1 gene SNPs

2.3 轉錄因子預測

通過在線網(wǎng)站對5'UTR啟動子區(qū)域的3個SNPs位點進行轉錄因子預測發(fā)現(xiàn):T-31C、A-1401G、C-1542T突變后產生ASCL1、ASCL2、MYOG、MAZ、PLAGL2、Atoh1、Hand2、SREBF1等8個新的轉錄因子結合位點;其中,T-31C的突變導致FERD3L結合位點消失;C-1542T的突變導致MEIS1結合位點消失。

2.4 骨骼肌發(fā)育過程中PFN1基因的差異表達

由圖2可以看出,PFN1基因在藏豬與大約克豬的腿肌、背最長肌中的相對表達量差異不顯著(P>0.05)。在30日齡,PFN1基因在藏豬和大約克豬腿肌與背最長肌中的mRNA表達水平均高于90日齡與180日齡同組織,且30日齡在不同品種間PFN1基因表達量無顯著差異(P>0.05);90日齡時,藏豬在腿肌中PFN1基因mRNA表達量顯著低于大約克豬(P<0.05),在背最長肌中mRNA表達量極顯著低于大約克豬(P<0.01);180日齡時,藏豬兩組織中mRNA表達量皆極顯著低于大約克豬(P<0.01)。PFN1基因的表達水平隨著兩豬種生長日齡的增加,在骨骼肌組織中呈整體下降的趨勢。

圖2 藏豬與大約克豬不同發(fā)育時期PFN1基因在腿肌和背最長肌中的mRNA表達量*為差異顯著(P<0.05),**為差異極顯著(P<0.01)Fig. 2 mRNA expression levels of PFN1 gene in the leg muscle and longissimus dorsi muscle of Tibet pigs(TP) and Yorkshire pigs(YP) at different development stages* indicates significant difference (P<0.05), ** indicates highly significant difference (P<0.01)

3 討 論

動物細胞中profilin具有兩種不同的功能:一方面,profilin結合G-actin調節(jié)肌動蛋白動態(tài)重組來響應胞內外信號,從而調控細胞的增殖、生長、存活、遷移等活動[11];另一方面,profilin可促進ATP/ADP交換,將G-actin-ATP定位到能提高肌動蛋白裝配的微絲正端,促進單體結合到微絲上使微絲組成肌原纖維[12]。據(jù)Alkam D等研究,PFN1氨基酸序列在脊椎動物和低等生物上高度保守[1]。本試驗克隆了豬PFN1基因的CDS區(qū)域并同源序列做比對,發(fā)現(xiàn)無突變位點的存在,證實了該項觀點。

RT-qPCR結果顯示,PFN1基因mRNA的相對表達量在骨骼肌中30日齡最高,隨日齡增加而下降。有研究表明豬肌纖維數(shù)目在妊娠期已被固定,出生后骨骼肌生長主要通過肌纖維體積的增大實現(xiàn)[13]。Witke等[14]發(fā)現(xiàn),在小鼠中PFN1是胚胎發(fā)育的所有階段存在普遍表達的基因,敲除PFN1基因致使小鼠胚胎細胞在兩細胞階段由于細胞分裂中的缺陷而停滯,該研究證明PFN1基因對于個體早期的細胞增殖發(fā)揮著至關重要的作用。由此推測,PFN1基因高表達于骨骼肌發(fā)育早期,調節(jié)細胞的增殖與分化;而個體出生后肌纖維數(shù)目不再改變或增加,PFN1基因對肌纖維細胞的增殖等作用開始逐漸減弱,這可能是豬PFN1基因表達水平隨日齡增加而逐步下降并且在不同骨骼肌組織中其表達趨勢呈基本一致的原因。本試驗中T-31C、A-1401G突變位點結合的新轉錄因子MyoG參與驅動骨骼肌纖維的終末分化[15],Koki等[16]發(fā)現(xiàn)若敲除MyoG,骨骼肌成肌細胞分化為正常的肌纖維受到抑制并表現(xiàn)為出生后高致死率;高表達MyoG則加速成肌細胞分化成熟、肌管融合,MAZ協(xié)同促進肌細胞分化的過程[17]。關聯(lián)SNPs位點轉錄因子預測與定量結果分析,PFN1基因在肌細胞中的作用一致且符合機體發(fā)育規(guī)律。

肌纖維是骨骼肌的基本單位,肌間脂肪含量、肌纖維直徑等因素對嫩度影響顯著[18]。有研究表明,隨著肌纖維直徑的增大,肌肉嫩度相應降低;肌纖維越細,密度越大,肌肉脂肪含量越高,肉質越細嫩[19]。說明肌纖維直徑與肌內脂肪是影響肉品嫩度的重要因素。據(jù)趙韶華研究,在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌組織中,PFN1基因的表達上調,伴隨心肌細胞肥大、膠原纖維增生和肌動蛋白細胞骨架受損,而沉默PFN1基因則有助于減輕心肌纖維化程度[20]。本試驗結果顯示,在腿肌與背最長肌中,90、180日齡藏豬的表達量均顯著或極顯著低于大約克豬。由此推測,PFN1基因調控細胞骨架穩(wěn)態(tài)以保持肌纖維細胞形態(tài);而藏豬中PFN1的低表達量抑制了肌纖維直徑的增大從而保持藏豬的骨骼肌肌肉嫩度。本試驗中A-1401G、C-1542T兩個連鎖突變位點結合的新轉錄因子PLAGL2通過調節(jié)小GTP酶影響細胞骨架形態(tài)[21]。SREBF1對脂肪沉積有正向調控作用,增加均可顯著促進細胞中脂滴的形成[22]。提示SREBF1和PLAGL2協(xié)同作用,抑制肌纖維直徑增大同時提高了肌纖維與肌束間的脂肪含量[23]。綜上表明,這兩個連鎖突變位點可能是調控PFN1基因表達形成藏豬豬肉的嫩度、風味俱佳的關鍵原因之一,可作為分子標記[24]。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn),豬的PFN1基因3個SNPs位點的多態(tài)性與骨骼肌中mRNA的差異表達相關;推測這3個SNPs位點引起的轉錄因子變化可能是調控其表達的關鍵作用位點。因此,PFN1可作為骨骼肌早期發(fā)育和肉質性狀新的候選基因,為后續(xù)闡明PFN1基因在豬生長發(fā)育中的分子作用機制與分子標記輔助育種提供新思路和理論依據(jù)。