體軸抑制因子1 敲除及過表達對ACT-1 人未分化甲狀腺癌細胞中B 細胞淋巴瘤-2 表達影響的初步研究

文 丹，胥正敏，林師宇，黃 蓉

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院藥學院，四川 南充 637000）

未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）是起源于甲狀腺濾泡上皮細胞的高度侵襲性腫瘤，由于其具有失分化、惡性程度高、易發(fā)生遠處轉移等特點，該類患者往往預后較差、生存期不超過半年[1]。關于ATC 發(fā)病的分子機制目前仍不清楚。AXIN1 基因在多種腫瘤中表達降低并在腫瘤的發(fā)病過程中扮演著抑癌基因的角色，該基因表達異?？梢詫е路切〖毎伟2]、肝細胞癌[3]、結直腸癌[4]和胃腸道癌[5]等多種腫瘤發(fā)生。且研究發(fā)現[6]，采用重組AXIN1 過表達載體（pcDNA3.1-AXIN1）轉染人胚胎腫瘤衍生細胞系NTera2 后，與對照組相比，AXIN1表達量增加，Bcl-2 表達降低。另有研究發(fā)現[7]，運用牙齦卟啉單胞菌-脂多糖（LPS-Pg）處理大鼠成骨細胞后可抑制Bcl-2 表達，而在此基礎上敲低AXIN1基因后，可逆轉Pg-LPS 誘導的促凋亡作用。這些研究都暗示AXIN1 和Bcl-2 基因在疾病發(fā)生過程中可能存在著某種關聯，但關于二者在ATC 腫瘤中的相關性尚需研究證實。本課題組前期研究采用CRISPR-Cas9 基因編輯技術成功構建出AXIN1 基因敲除的ACT-1 單克隆細胞系[8]?；诖耍狙芯繕嫿薃XIN1 基因過表達的ACT-1 腫瘤細胞系，以期在構建成功的兩種工具細胞中探討敲除及過表達AXIN1 基因對ACT-1 中Bcl-2 的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Nthy-ori-3-1 及ACT-1 細胞系均購自ATCC 細胞庫，嘌呤霉素購自Boster 公司，兔抗Bcl-2 單克隆抗體購自CST 公司，DMEM 高糖培養(yǎng)基購自invitrogen 公司；胎牛血清購自NTC 公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜、無菌PBS 及青霉素、鏈霉素均購自Boster 公司；總RNA 提取試劑TRIzol、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水均購自ABI 公司；逆轉錄試劑盒購自Thermo 公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 購自Applied Biosystem 公司；兔抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體、HRP 標記的山羊抗兔IgG 購自Boster 公司；兔抗AXIN1 及Bcl-2 單克隆抗體均購自CST 公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自博士德公司；臺式高速低溫離心機購自上海力申；IX50 熒光顯微鏡購自Olympus 公司;流式細胞儀購自BD Bioscience 公司。

1.2 方法

1.2.1 構建AXIN1 基因過表達病毒載體 將AXIN1的cDNA 序列克隆到MLPIC 病毒載體中，采用核酸內切酶酶切鑒定出AXIN1 基因過表達的病毒載體MLPIC-AXIN1，從插入序列兩端及cDNA 序列中段測全序列的cDNA。

1.2.2 構建AXIN1 基因過表達的ACT-1 腫瘤細胞系首先，采用HEK293T 細胞包裝病毒，24 h 后熒光顯微鏡觀察293T 轉染效率，收集48～72 h 病毒過濾后感染ACT-1 細胞，其陰性對照組及實驗組分別設置3 個生物學復孔。流式檢測24 h 病毒感染效率在10%左右，因轉染后的細胞含有嘌呤霉素抗性，隨即采用嘌呤霉素進行細胞篩選，當加藥后細胞無明顯死亡，可再次行流式檢測紅色熒光細胞比率，若比率達90%左右，則獲得穩(wěn)定過表達AXIN1 的攜帶紅色熒光并含嘌呤霉素抗性基因穩(wěn)定腫瘤細胞株。

1.2.3 實時熒光定量PCR 法檢測細胞中AXIN1 和Bcl-2 mRNA 表達情況 收取細胞，加入TRIzol 裂解液，反復吹打細胞至其完全裂解，按比例加入氯仿靜置分層，低溫離心機高速離心；吸取上清加入等體積異丙醇，室溫靜置，低溫離心機高速離心；棄上清，加入750 ml/L 酒精，低溫離心機離心；甩干酒精，加入RNA 無酶水使其充分溶解；按照逆轉錄試劑盒行反轉錄過程；取cDNA 產物進行實時熒光定量PCR 擴增；觀察每孔對應樣品融解曲線及擴增曲線圖，采用2△△CT法處理及分析數據并記錄。PCR 引物為：β-actin正向序列為5’-TTCTTTGAGCTCCTTCGTT-3’，反向序列為5’-ATGGAGGGGAATACAGCCC-3’；AXIN1 正向序列為5’-CCTCCTGGCATCTGTAAG-3’，反向序列為5’-CCGCTCCTTCTGTCTATG-3’；Bcl-2 正向序列為5’-GTGGATGACTGAGTACCTGAAC-3’，反向序列為5’-GAGACAGCCAGGAGAAATCAA-3’。PCR 反應體系（20 μl）：稀釋后的cDNA 8 μl，正反向引物各1 μl，SYBR?Green 10 μl。PCR 擴增程序如下：50 ℃2 min，95 ℃2 min；95 ℃解鏈15 s，55 ℃～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)40 次。

1.2.4 蛋白質免疫印跡法檢測細胞中AXIN1 和Bcl-2 蛋白表達情況 收取細胞于冰上，離心后棄上清，向細胞內加入蛋白裂解液，槍尖充分吹打，冰上靜置裂解細胞，按比例加入上樣緩沖液，高溫變性后高速離心收取上清；BCA 蛋白定量試劑盒檢測所提取細胞蛋白樣品濃度。按每孔30 μg 總量上樣至SDS-PAGE 膠使其分離，將分離好的蛋白樣品轉移至PVDF 膜上，50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉，分別加入β-actin 抗體（1∶5000）、兔抗AXIN1 單克隆抗體（1∶1000）及兔抗Bcl-2 單克隆抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；PBS 清洗5 次，加入HRP 標記的兔抗二抗（1∶5000），室溫孵育1.5 h；PBST 清洗后，采用化學發(fā)光法加入Western blot 曝光液顯影；導出數據，采用Image J 軟件進行圖像吸光度（A）值分析，用AAXIN1/Aβ-actin或ABcl-2/Aβ-actin的比值分析AXIN1 及Bcl-2 的相對表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Nthy-ori-3-1 及ACT-1 中AXIN1、Bcl-2 mRNA表達水平比較 與正常甲狀腺細胞Nthy-ori-3-1相比，腫瘤細胞ACT-1 中AXIN1 及Bcl-2 mRNA表達水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 ACT-1 中AXIN1 及Bcl-2 基因mRNA 表達量

2.2 過表達AXIN1 的cDNA 病毒載體的構建與驗證與陰性對照組MLPIC 相比，實驗組質粒MLPICAXIN1 在進行酶切鑒定后可見除載體外的小條帶，大小約4000 bp，見圖2、圖3。

圖2 MLPIC 質粒工作結構圖

圖3 質粒酶切鑒定結果

2.3 AXIN1 基因過表達細胞系的構建 在過表達質粒構建成功的基礎上，采用HEK293T 細胞分別包裝MLPIC 及MLPIC-AXIN1 病毒，轉染后24 h 熒光顯微鏡下可見細胞內有明顯mCherry 紅色熒光表達，見圖4。流式細胞檢測結果顯示，ACT-1 細胞感染后24 h mCherry 陽性比率分別為（5.87±0.21）%、（4.97±0.13）%及（5.23±0.15）%，（8.61±0.32）%、（7.30±0.21）%及（7.49±0.42）%，見圖5。感染后的ACT-1 經嘌呤霉素篩選后可獲得穩(wěn)定過表達AXIN1 的腫瘤細胞系，流式分析mCherry 陽性比率可達（92.31±0.42）%、（96.32±0.71）%、（92.21±0.61）%及（95.03±0.82）%、（94.12±0.31）%及（89.61±0.52）%，見圖6。與陰性對照組ACT-1-MLPIC 相比，實驗組ACT-1-MLPIC-AXIN1 中AXIN1 mRNA 和蛋白質表達水平均增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖7。

圖4 HEK293T 細胞包病毒后24h 細胞形態(tài)及mCherry 表達

圖5 ACT-1 感染后24h 流式分析mCherry 陽性細胞比率

圖6 新霉素篩選后流式分析ACT-1 mCherry 陽性細胞比率

圖7 ACT-1 過表達細胞中AXIN1 表達量檢測

2.4 敲除及過表達AXIN1 的ACT-1 細胞中Bcl-2表達水平比較 與陰性對照組ACT-1-scramble 相比，實驗組ACT-1-sgAXIN1.Cr5-17 中Bcl-2 mRNA及蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與陰性對照組ACT-1-MLPIC 相比，實驗組ACT-1-MLPIC-AXIN1 中Bcl-2 mRNA 及蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖8。

圖8 ACT-1 敲除及過表達細胞中Bcl-2 表達量檢測

3 討論

Wnt 信號通路對于細胞增殖、細胞分化和組織穩(wěn)態(tài)的調節(jié)十分重要。其中，該通路組成成分或關鍵負調控因子突變誘導的通路激活是腫瘤發(fā)生的重要原因，持續(xù)的Wnt 通路異常激活往往與腫瘤細胞的異常增殖及耐藥性相關[9，10]。AXIN1 基因作為Wnt通路重要的負調節(jié)因子，可在多種因子的介導下調控Wnt 通路而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡過程[11]。Huang T 等[12]研究發(fā)現，泛素特異性蛋白酶44（USP44）可通過Axin1 去泛素化作用使Wnt/β-catenin 途徑失活，從而抑制結直腸癌細胞增殖，促進其凋亡發(fā)生。Zhang Y 等[13]研究發(fā)現，E3 泛素連接酶（UBE3C）過表達可通過促進AXIN1 泛素化來上調β-catenin信號傳導，從而促進胃癌細胞增殖并抑制細胞凋亡。Biechele TL 等[14]研究發(fā)現，Wnt/β-catenin 信號通路和AXIN1 可以在人黑色素瘤中調節(jié)由突變激酶BRAFV600E 的抑制引發(fā)的細胞凋亡。

細胞凋亡是參與個體胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和免疫的重要生物學過程，主要包括2 種途徑，即內在凋亡途徑和外在凋亡途徑[15]。靶向凋亡途徑的成分，尤其是內在途徑中的Bcl-2 家族，已被證明是改善血液系統惡性腫瘤患者預后的有效治療方法[16]。Bcl-2基因作為抗凋亡基因家族重要的成員之一，可以通過抑制促凋亡蛋白（如BAX 和BAK）的激活來抑制細胞凋亡，從而促進癌細胞存活[17]。通常情況下，抗凋亡因子Bcl-2 蛋白家族可能通過破壞凋亡與抗凋亡之間的平衡，在濾泡上皮細胞起源的甲狀腺腫瘤病理類型轉化中發(fā)揮重要作用[18]。Gupta A 等[19]、Fourati A 等[20]對不同病理類型的甲狀腺癌進行免疫組化發(fā)現，與分化良好的甲狀腺腫瘤相比，ATC 腫瘤中Bcl-2 表達明顯降低。本研究結果發(fā)現，ACT-1細胞系中Bcl-2 表達同樣降低，與上述研究[19，20]基本一致。在AXIN1 敲除的單克隆細胞系中，Bcl-2 表達增加；在ACT-1 過表達的細胞系中，Bcl-2 表達降低，提示ATC 腫瘤發(fā)生過程中Bcl-2 與AXIN1 之間的關聯性，AXIN1 的低表達可能參與了ATC 腫瘤失分化過程，并且當抑癌基因AXIN1 發(fā)生突變時，可能通過上調Bcl-2 的表達來調控細胞的凋亡過程，因此Bcl-2 有望成為ATC 治療的另一個靶標。

綜上所述，在未分化甲狀腺癌細胞中，AXIN1基因在ATC 細胞中起著重要的抑癌作用，Wnt 通路中AXIN1 基因的突變可能通過上調凋亡抑制基因Bcl-2 的表達參與ATC 腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，后期可以在前期研究的基礎上，利用小分子抑制劑對ATC中Bcl-2 分子作用機制進行更深入研究。