不同孔徑3D打印三周期極小曲面基元支架調(diào)控成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的研究

程德斌,張昭,付軍,劉冬,范宏斌

(空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨科,陜西 西安 710032)

鈦及其合金由于優(yōu)異的生物力學(xué)性能和生物相容性,目前已成為骨科植入物中最受歡迎的材料之一,并廣泛應(yīng)用于腫瘤、創(chuàng)傷等骨科相關(guān)疾病[1]。天然骨組織是互相聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu),由外層骨皮質(zhì)和內(nèi)層骨小梁組成[2]。多孔結(jié)構(gòu)已經(jīng)被證實(shí)是調(diào)控植入物-骨界面整合的重要因素。3D打印技術(shù)不僅能在鈦合金假體與骨的接觸面制造相互連接的大孔結(jié)構(gòu)來促進(jìn)新生骨長(zhǎng)入,而且能通過多孔結(jié)構(gòu)降低鈦合金的彈性模量,從而減少或避免應(yīng)力屏蔽[3]。然而,由于3D打印工藝的局限性,目前臨床上使用多孔結(jié)構(gòu)多為孔徑大小在500～1 000 μm的晶胞結(jié)構(gòu)[4]。雖然較大的孔徑大小有利于骨長(zhǎng)入,但植入物的強(qiáng)度會(huì)因此降低。此外,在一些研究中,有研究人員建議骨長(zhǎng)入的最佳孔徑應(yīng)為100～400 μm[5]。然而,其他研究表明600 μm孔徑大小可能促進(jìn)細(xì)胞增殖,并加速骨生長(zhǎng)[6-7]。目前關(guān)于誘導(dǎo)骨生成的最適孔徑仍有爭(zhēng)議。

近期,三周期極小曲面(triply periodic minimal surfaces,TPMS)結(jié)構(gòu)以其優(yōu)異的力學(xué)性能和光滑的局部拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)引起了廣泛的關(guān)注[8],其特殊的孔隙度和結(jié)構(gòu)可以通過定義權(quán)重函數(shù)和空間依賴函數(shù)來形成。在曲面微分幾何中最小曲面的定義是指平均曲率為零的曲面,它可以在3個(gè)獨(dú)立方向上無限延伸[8-9]。碰巧的是,骨小梁的平均曲率接近于零,有學(xué)者認(rèn)為組織生長(zhǎng)過程是曲率驅(qū)動(dòng)的,這意味著TPMS結(jié)構(gòu)可能會(huì)促進(jìn)骨組織再生[10]。因此,本研究旨在基于3D打印TPMS基元支架探索不同孔徑對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖和分化的影響,并為后續(xù)3D打印個(gè)性化假體多孔結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 3D打印TPMS基元支架的設(shè)計(jì)及制造 TPMS是一種特殊的三維周期曲面,將空間劃分為2個(gè)或多個(gè)子空間。TPMS多孔支架具有優(yōu)越的力學(xué)性能和表面積比[9]。本研究應(yīng)用TPMS函數(shù)方程來設(shè)計(jì)TPMS基元支架:ΦPrimitive=cos(ωx)+cos(ωy)+cos(ωz)=0[11]。通過調(diào)控函數(shù)式的參數(shù)來構(gòu)建不同孔徑結(jié)構(gòu)的支架(見圖1),隨后導(dǎo)出STL格式的文件將其輸入至選擇性激光熔融(selective laser melting,SLM)設(shè)備進(jìn)行加工制造。打印的原材料為Ti6Al4V粉末,粒徑15～53 μm,密度為1.45 g/cm3。設(shè)置激光功率為95 W,激光掃描速度可達(dá)1 000 mm/s。

圖1 3D打印TPMS基元支架示意圖

1.2 掃描電鏡評(píng)估支架結(jié)構(gòu)參數(shù) 掃描電鏡(TeneoVS FEI公司,美國)被用于對(duì)3D打印TPMS基元支架進(jìn)行形貌分析。在進(jìn)行形貌分析之前,用金鈀覆蓋TPMS基元支架表面,采用Image J軟件計(jì)算。

1.3 MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1購自武漢普魯塞生物有限公司,并培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的Dulbecco氏培養(yǎng)基(Dulbecoo’s modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中,每3 d換液1次,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 細(xì)胞骨架染色 在24孔培養(yǎng)板中將MC3T3-E1細(xì)胞接種于不同孔徑的3D打印TPMS基元支架表面,接種密度為每孔2.5×104,分別共培養(yǎng)至第7天。用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次后,用戊二醛固定細(xì)胞30 min,PBS隨后清洗,加入異硫氰酸熒光素(FITC)-鬼筆環(huán)肽工作液避光孵育90 min,隨后PBS沖洗,加入DAPI染核5 min。應(yīng)用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,并對(duì)不同激發(fā)光對(duì)應(yīng)的熒光照片進(jìn)行Merge處理。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 將MC3T3-E1細(xì)胞在上述不同孔徑的TPMS基元鈦片中培養(yǎng),分別共培養(yǎng)至1 d、4 d、7 d、10 d。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),棄去上清液后,每孔加入1 mL新鮮培養(yǎng)液和10%比例的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting kit-8,CCK-8)。孵育2 h后,通過酶標(biāo)儀檢測(cè)孔板在450 nm處的吸光值(optical density,OD),每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測(cè)定 將MC3T3-E1細(xì)胞在上述不同孔徑的TPMS基元鈦片中培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(MC3T3-E1細(xì)胞在普通培養(yǎng)板中培養(yǎng))。在培養(yǎng)1 d、7 d和14 d后,根據(jù)ALP檢測(cè)試劑盒的說明,檢測(cè)不同分組在405 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,總蛋白濃度用二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量法進(jìn)行測(cè)定。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)法檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白表達(dá) 在不同分組(空白對(duì)照、400 μm、600 μm、800 μm)與MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)14 d后,用RIPA裂解液提取各組的蛋白。裂解液以12 000 rpm離心15 min后收集上清液,定量蛋白濃度。隨后,取20 μg蛋白樣本經(jīng)煮沸、上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜后,與脫脂奶粉封閉,用抗Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,14695-1-AP,1∶1 000)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,20700-1-AP,1∶1 000)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,22952-1-AP,1∶1 000)和Gapdh(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,10494-1-AP,1∶3 000)在4 ℃孵育過夜。最后,加入二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h,并用電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi luminescence,ECL)試劑顯影觀察。Image J被用于分析各個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 3D打印TPMS基元支架表面形貌觀察 掃描電鏡發(fā)現(xiàn)SLM精確制造出了不同孔徑的TPMS基元支架,與設(shè)計(jì)圖一致,具有均勻分布互相連通的多孔結(jié)構(gòu)(見圖2)。TPMS基元支架參數(shù)實(shí)際值比較:400 μm組孔徑大小和孔徑率分別為(374.6±16.4)μm、(68.9±4.6)%,600 μm組分別為(553.4±26.8)μm、(66.5±3.8)%,800 μm組分別為(784.8±22.7)μm、(64.2±4.4)%。

圖2 掃描電鏡觀察不同孔徑TPMS基元支架的形貌

2.2 不同孔徑支架對(duì)細(xì)胞黏附和增殖的影響 細(xì)胞骨架染色提示成骨細(xì)胞在不同孔徑的支架上黏附良好,增殖旺盛(見圖3)。通過CCK-8試劑檢測(cè)了細(xì)胞增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同孔徑支架的細(xì)胞增殖性在培養(yǎng)到第7天時(shí)均隨著培養(yǎng)時(shí)間和孔徑的增加而增加(見圖4)。與400 μm組相比,800 μm組的增殖活性升高程度最高,這表明大孔徑的TPMS基元支架更適于細(xì)胞增殖。

圖3 不同孔徑TPMS基元支架中成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架形態(tài)

2.3 不同孔徑支架對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響 培養(yǎng)第7天和第14天時(shí),TPMS基元支架上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性均明顯高于空白對(duì)照組,并且隨著時(shí)間的增加,ALP活性也明顯升高(見圖5)。值得注意的是,在不同孔徑的TPMS基元支架之間發(fā)現(xiàn)600 μm孔徑的TPMS基元支架上的ALP活性最高,明顯高于400 μm和800 μm。

2.4 不同孔徑支架對(duì)細(xì)胞成骨分化的作用 培養(yǎng)14 d時(shí)WB分析檢測(cè)了成骨分化相關(guān)蛋白Col Ⅰ、Runx2和OPN的表達(dá)(見圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TPMS基元支架組中MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外,與之前的結(jié)果一致的是,TPMS基元600 μm組中成骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)量最高。

圖6 WB分析MC3T3-E1與不同孔徑TPMS基元支架共培養(yǎng)第14天的成骨相關(guān)

3 討 論

骨腫瘤切除后的大段骨缺損對(duì)骨科醫(yī)生來說仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[12]。在過去的幾年中,鈦及其合金因其優(yōu)異的抗壓強(qiáng)度和良好的生物相容性而被廣泛研究用于骨缺損的重建,并展現(xiàn)了有前景的臨床結(jié)果[1]。特別是Ti6Al4V是目前臨床修復(fù)骨缺損的首選材料。然而,Ti6Al4V具有一定的生物惰性,經(jīng)過拋光處理后幾乎沒有骨整合能力[13-14]。此外,Ti6Al4V的彈性模量遠(yuǎn)高于骨皮質(zhì)和骨小梁,當(dāng)假體和骨組織的彈性模量不同時(shí),兩者之間的應(yīng)力傳遞會(huì)不均勻,產(chǎn)生應(yīng)力屏蔽,最終導(dǎo)致假體松動(dòng)或斷裂[14]。為了克服這些問題,越來越多的研究者關(guān)注探索多孔Ti6Al4V在骨修復(fù)中的應(yīng)用價(jià)值。TPMS是一種通過數(shù)學(xué)函數(shù)設(shè)計(jì)的高度可控的均質(zhì)多孔結(jié)構(gòu)[9],與傳統(tǒng)的晶胞結(jié)構(gòu)相比,TPMS結(jié)構(gòu)通常具有多種優(yōu)勢(shì)。首先,其可以通過隨意控制函數(shù)來實(shí)現(xiàn)孔徑、孔隙率等重要參數(shù)調(diào)整,能更好地適應(yīng)力學(xué)性能的要求;其次,其高表面積體積比的特點(diǎn)能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞黏附、遷移、增殖和營養(yǎng)運(yùn)輸;第三,由于其結(jié)構(gòu)均勻,TPMS展現(xiàn)出了出色的應(yīng)力分布[15-16]。以往的研究對(duì)不同TPMS結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能、滲透性和疲勞行為進(jìn)行了探索,并從理論上證實(shí)了其在骨組織再生中的可行性[15-17]。盡管TPMS結(jié)構(gòu)展現(xiàn)了良好的臨床應(yīng)用前景,但是其調(diào)控細(xì)胞行為的最適孔徑目前仍不清楚。

多孔支架的孔徑大小在調(diào)控成骨細(xì)胞增殖和分化中起著關(guān)鍵作用[13]。隨著基于粉末的金屬熔材增材制造技術(shù)的發(fā)展,如選擇性激光熔化、電子束熔化或直接金屬激光燒結(jié)等,可以設(shè)計(jì)并加工處不同的相對(duì)密度、直徑、孔徑和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[18]。SLM作為最常用的金屬增材制造技術(shù)之一,利用激光完全熔化金屬粉末,然后逐層固化金屬粉末來形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[19]。由于其優(yōu)良的機(jī)械性能、高精度、高構(gòu)建分辨率和卓越的定制性,SLM在制造復(fù)雜精確的結(jié)構(gòu)方面展現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì),特別是金屬假體的制造[20]。Yan等[3]之前應(yīng)用SLM技術(shù)制造了具有80%～95%的高孔隙率的TPMS植入物,其彈性模量和孔隙率可以根據(jù)人體骨骼的水平進(jìn)行調(diào)整,從而減少或避免了應(yīng)力屏蔽,并明顯延長(zhǎng)植入物的使用壽命。Szatkiewicz等[21]以316 L不銹鋼為基材用SLM制造了TPMS支架,并評(píng)估了其不同參數(shù)下的彈性模量、屈服強(qiáng)度、平臺(tái)應(yīng)力和能量吸收關(guān)系,為設(shè)計(jì)和制造更高效的輕質(zhì)結(jié)構(gòu)提供了新的思路。Li等[22]通過SLM技術(shù)制造了超大尺寸的TPMS基元支架,并通過不斷優(yōu)化基元結(jié)構(gòu)參數(shù)同時(shí)提高了力學(xué)性能和滲透性能,為骨組織重建的力學(xué)和生物性能提供很好的解決方案。因此,本研究中應(yīng)用SLM分別制造了孔徑為400 μm、600 μm和800 μm的TPMS基元支架,細(xì)胞增殖分析發(fā)現(xiàn)800 μm組中細(xì)胞增殖活性最高,而400 μm組中的細(xì)胞增殖活性最低。隨著孔徑的增加,成骨細(xì)胞的增殖活性也明顯增高,這一觀點(diǎn)已經(jīng)得到了國內(nèi)外大量學(xué)者的認(rèn)可[14,23-24]。大量的研究表明,幾百微米(150～800 μm)的多孔結(jié)構(gòu)能為細(xì)胞增殖提供足夠的空間,有利于營養(yǎng)物質(zhì)的交換和代謝產(chǎn)物的排出[25-26]。與孔徑為400 μm的TPMS基元支架相比,孔徑為800 μm的TPMS基元支架的細(xì)胞密度和代謝活性顯著增加。Sollazzo等[24]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的增殖高度依賴于孔徑大小。當(dāng)孔徑超過300 μm時(shí),細(xì)胞的增殖率隨著孔徑地增加而增加[24]?？讖酱笮Q定了多孔支架的滲透系數(shù),使整個(gè)支架形成了高度互相聯(lián)通的結(jié)構(gòu),為位于支架中心的細(xì)胞提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),從而更適合細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖。

據(jù)報(bào)道,在骨形成的不同階段(增殖、分化和礦化)中,成骨相關(guān)標(biāo)志物的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)決定了未成熟的成骨細(xì)胞向成熟的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[27]。本研究中隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)均增加,在600 μm組中的含量達(dá)到最高值。ALP在礦化組織的細(xì)胞中高度表達(dá),在成骨細(xì)胞發(fā)育過程中是誘導(dǎo)其早期礦化的表現(xiàn)之一[28]。ALP能通過調(diào)節(jié)局部無機(jī)磷酸鹽沉積速率,降低細(xì)胞外焦磷酸鹽濃度,來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化[28-29]。隨著在TPMS基元支架上細(xì)胞ALP活性的增加,細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞表型分化和礦化的能力逐漸增強(qiáng)。此外,本研究還評(píng)估了成骨關(guān)鍵標(biāo)志物Col Ⅰ、Runx2和OPN蛋白的表達(dá)來進(jìn)一步驗(yàn)證成骨細(xì)胞表型的變化。Col Ⅰ與ALP一樣是廣泛認(rèn)可的成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)記物之一,可以促進(jìn)細(xì)胞成骨分化,并反映成骨分化的表型特征[30]。Runx2是成骨細(xì)胞分化和成熟的關(guān)鍵特異性轉(zhuǎn)錄因子,能編碼一種參與間充質(zhì)前體成骨分化過程的蛋白,與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同在骨形成和生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。Runx2的激活能誘導(dǎo)特異性成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá),包括Col Ⅰα1和骨ALP[31-32]。OPN是一種分泌蛋白,參與了骨重塑和代謝過程。OPN不僅是神經(jīng)-內(nèi)分泌介導(dǎo)調(diào)節(jié)骨量的重要因素,還參與成骨細(xì)胞的多種生物活動(dòng),包括增殖、遷移和黏附等[33]。本研究中WB分析發(fā)現(xiàn)600 μm中細(xì)胞的Col Ⅰ、Runx2和OPN基因在蛋白水平的表達(dá)程度仍然最高,這個(gè)發(fā)現(xiàn)與之前的研究一致。Zhao等[34]發(fā)現(xiàn)3D打印多孔Ti6Al4V支架孔徑為(593.4±16.9)μm時(shí)有利于骨長(zhǎng)入和血管形成。Ran等[35]通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣證明孔徑為(607.0±24.0)μm的多孔Ti6Al4V植入物有利于新生骨向植入物孔內(nèi)生長(zhǎng),保證了骨-植入物的遠(yuǎn)期穩(wěn)定性。細(xì)胞所在的表面的曲率已被證明在調(diào)控組織再生方面起著關(guān)鍵的作用[36-38]。與平面培養(yǎng)的對(duì)照組相比,骨細(xì)胞在3D打印TPMS基元支架中均出現(xiàn)了不同程度的分化。TPMS基元結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的力學(xué)強(qiáng)度和接近于零的凹面曲率,類似于骨小梁的平均曲率[9,15,36]。這意味著較低的曲率可能是TPMS基元支架誘導(dǎo)骨細(xì)胞的成熟和分化的關(guān)鍵因素,并且孔徑大小為600 μm的TPMS基元支架更有利于骨再生,這為3D打印多孔結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)提高了新的思路。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)初步證明了3D打印TPMS基元支架促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和分化,并為TPMS結(jié)構(gòu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在骨再生中的設(shè)計(jì)提供新的參考依據(jù)。但TPMS基元支架調(diào)控細(xì)胞行為的具體潛在機(jī)制仍然不清楚,未來仍需要大量的體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步揭示TPMS基元支架的骨整合作用,為臨床轉(zhuǎn)化提供夯實(shí)基礎(chǔ)。