山藥炭疽病病原菌的分離鑒定及其室內(nèi)毒力測(cè)定

陳 功，易思情，金晨鐘，2，郭開(kāi)發(fā)，2，胡 彪，段秋媛

（1.有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·湖南人文科技學(xué)院 湖南婁底 417000；2.婁底市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 湖南婁底 417000）

山藥（Dioscorea oppositaThunb.）即淮山，為薯蕷科薯蕷屬植物[1]。青樹(shù)坪淮山是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，也是湖南地方特色品種，產(chǎn)自“全國(guó)重點(diǎn)鎮(zhèn)”湖南雙峰青樹(shù)坪鎮(zhèn)，具有山藥界的“丑”山藥之名，青樹(shù)坪山藥外形毛多、疙瘩多、彎曲不整齊，但口感細(xì)膩，性粉，粉中帶糯，可媲美河南鐵棍山藥。其主產(chǎn)區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)含量高，微量元素豐富，經(jīng)國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心檢測(cè)，青樹(shù)坪山藥中的硒元素含量較豐富，已經(jīng)達(dá)到國(guó)家“富硒產(chǎn)品”要求，長(zhǎng)久食用既可以提高身體素質(zhì)，又能增強(qiáng)人體的免疫功能[2]。

近年來(lái)，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和市場(chǎng)需求量的不斷增加，雙峰青樹(shù)坪山藥種植面積逐年擴(kuò)大，病害問(wèn)題日益突出。當(dāng)山藥莖葉受到炭疽病危害后，受害區(qū)域一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)在50%以上。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一種分布范圍廣、寄主植物多、侵染能力強(qiáng)的真菌性病害，危害柑橘、草莓、高粱和玉米等多種農(nóng)作物從而引發(fā)炭疽病，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。炭疽病病原菌的分生孢子主要通過(guò)風(fēng)雨傳播，有時(shí)昆蟲(chóng)也能作為傳播媒介，孢子萌發(fā)后即可從氣孔、皮孔等自然孔口入侵，也可以從傷口入侵[5]。天氣條件適宜尤其高溫高濕、種薯品質(zhì)不佳、種植不合理、農(nóng)業(yè)管理措施不當(dāng)和農(nóng)藥使用不科學(xué)等都會(huì)引起炭疽病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，引起山藥炭疽病的主要病原菌有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeospori‐oides）[7-8]、薯蕷盤(pán)長(zhǎng)孢菌（Gloeosporium pestis）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）[9]，不同地區(qū)山藥炭疽病的病原菌種類不同。筆者研究的山藥病葉源于雙峰青樹(shù)坪鎮(zhèn)的山藥種植基地，將采集到的山藥炭疽病病葉進(jìn)行組織分離，結(jié)合致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征觀察和分子生物學(xué)分析，明確山藥炭疽病病原菌種類及篩選適合的化學(xué)藥劑，可為雙峰縣山藥炭疽病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2022 年6 月在湖南婁底市雙峰縣巡勝蔬菜種植專業(yè)合作社山藥基地采集山藥炭疽病樣品，品種為湖南地方特色品種青樹(shù)坪山藥，共采集樣品9 份。

供試殺菌劑：5%己唑醇懸浮劑（上海滬聯(lián)生物藥業(yè)（夏邑）股份有限公司）；32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑（上海滬聯(lián)生物藥業(yè)（夏邑）股份有限公司）；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司）；70%丙森鋅可濕性粉劑（拜耳股份公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原物的分離與純化 采用組織分離法[10]對(duì)典型的山藥炭疽病病樣進(jìn)行分離純化。取典型的山藥炭疽病葉，放入超凈工作臺(tái)中，用75%乙醇擦拭干凈，待葉片自然干燥后，取病健交界部位的葉組織（大小約為5 mm×5 mm）浸泡在2%次氯酸鈉溶液中1 min，用無(wú)菌水漂洗3 次后放置在無(wú)菌濾紙上，使其干燥，然后接入PDA 平板，處理完成后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d 后在WA 平板上進(jìn)行單孢純化，經(jīng)多次純化，將分離物接種在PDA 斜面試管中并培養(yǎng)一段時(shí)間后置于4 ℃冰箱保存，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)特征 將病原菌PDA 培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中（25 ℃）培養(yǎng)10 d，制作臨時(shí)玻片，對(duì)菌落形態(tài)、色澤、大小、分生孢子等進(jìn)行觀察拍照。在顯微鏡下參照張?zhí)煊頪11]的方法觀察分生孢子和孢子梗以及產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)和大小特征進(jìn)行分類。

1.2.3 致病性測(cè)定 選用長(zhǎng)勢(shì)健康的山藥葉片進(jìn)行田間標(biāo)記，對(duì)健康山藥葉片采用孢子懸浮液進(jìn)行噴霧接種完成致病性測(cè)定。在已分離純化的菌落上用滅菌的打孔器（直徑=5 mm）打取數(shù)個(gè)菌餅，將其置于PD 液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，誘導(dǎo)產(chǎn)孢，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)7 d 后的孢子濃度，用無(wú)菌水將其調(diào)整為1×106個(gè)孢子·mL-1。將健康山藥葉片用75%酒精表面消毒后，使用無(wú)菌接種針進(jìn)行劃傷處理，用噴霧壺將孢子懸浮液均勻噴灑，以不接種孢子懸浮液的健康山藥葉片作為對(duì)照，將接種后的山藥葉片用套袋保濕培養(yǎng)48 h，3 次重復(fù)，定期觀察病斑生長(zhǎng)情況，拍照記錄以及測(cè)量病斑直徑，觀察是否與田間病斑一致，同時(shí)對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行組織分離，比較是否與最初分離接種的發(fā)病菌株菌落特征和分生孢子形狀相同，確認(rèn)其致病性。

1.2.4 分子鑒定 取PDA 培養(yǎng)基上具代表性菌株的菌絲組織，研磨后用DNA 提取試劑盒，提取病原物的基因組DNA。使用引物ITS1/ITS4[12]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：總體積為50 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix（+dye）25 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 20 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃4 min、94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃40 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。反應(yīng)完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序完的基因序列進(jìn)行校正處理，然后在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)Gen-Bank 當(dāng)中搜索比對(duì)同源序列，對(duì)比分析代表菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)已知的相關(guān)序列的同源百分率。代表菌株根據(jù)ITS 基因的擴(kuò)增序列，然后利用MEGA 7 軟件，通過(guò)自展法（bootstrap）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 病原物的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。供試殺菌劑有5%己唑醇懸浮劑、32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別吸取各化學(xué)藥劑滴入PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中（V化學(xué)藥劑：VPDA培養(yǎng)基=1∶9），混勻，冷卻凝固備用，每個(gè)濃度梯度3 次重復(fù)。4 種供試殺菌劑的最終質(zhì)量濃度分別為32.5%苯甲嘧菌酯（650、325、162.5、81.25、40.625 mg ·L-1），5%己 唑 醇 懸 浮 劑（100、50、25、12.5、6.25 mg·L-1），70%丙森鋅（1400、700、350、175、87.5 mg·L-1），10%苯醚甲環(huán)唑（5、2.5、1.25、0.625、0.321 5 mg·L-1），對(duì)照組則是在培養(yǎng)基中加入等量無(wú)菌水。使用已滅菌打孔器（直徑=5 mm）在分離純化后的菌落中打取菌餅1 塊，將其接種在PDA 平板中央，放置恒溫培養(yǎng)箱中（25 ℃）培養(yǎng)，用十字交叉法測(cè)量7 d 后的培養(yǎng)基菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)，得出菌絲生長(zhǎng)抑制率。求毒力回歸方程，計(jì)算EC50及相關(guān)系數(shù)。

抑制率/%=[1-（處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]×100；

農(nóng)藥質(zhì)量濃度/（mg·L-1）=（含量百分?jǐn)?shù)/稀釋倍數(shù)）×106。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥炭疽病田間癥狀及致病性測(cè)定

田間調(diào)查可見(jiàn)，山藥炭疽病發(fā)病初期為不規(guī)則的褐色小點(diǎn)，周圍伴有明顯的黃色暈圈，病斑擴(kuò)大后中間凹陷，顏色呈淺灰褐色，邊緣呈黑褐色，病健界限明顯，見(jiàn)圖1。將病原菌離體接種到健康山藥葉片上，接種3 d 后觀察試驗(yàn)接種癥狀，發(fā)病葉片病斑中間部位下陷，呈暗灰色，邊緣呈黑褐色，與田間觀察一致，空白處理不發(fā)病，見(jiàn)圖1。并且對(duì)發(fā)病病斑進(jìn)行組織分離法后可重新分離鑒定為同一種病原菌。

圖1 山藥葉片致病性測(cè)定Fig.1 Pathogenicity determination of yam leaves

2.2 病原菌形態(tài)特征

從采集的9 份山藥炭疽病病葉中分離得到9份病原菌，獲得純培養(yǎng)后觀察（圖2），菌落正面菌絲較為致密，呈褐綠色毛氈狀，并形成幾圈散落的橙紅色孢子堆，具同心輪紋（圖2-A）。顯微鏡下觀察分生孢子為無(wú)色、圓桶形、兩端鈍圓、光滑、單孢、內(nèi)有油滴狀顆粒物，大小為（14.4～19.7）μm×（4.6～5.9）μm（n=50）（圖2-C）。根據(jù)真菌分離物形態(tài)特征，初步鑒定為炭疽菌屬（Colletotrichum）。

圖2 炭疽菌屬形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the Colletotrichum

2.3 分子生物學(xué)鑒定

為準(zhǔn)確鑒定病原菌的種類，對(duì)該病原菌采用ITS 基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)可得500 bp左右的條帶。登錄NCBI 將測(cè)得的基因序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)（圖3），9 株病原菌（T2、T5、T6、T7、T9、T11、T12、T21、T22）的ITS 基因序列（登錄號(hào)依次 為：OQ607561.1、OQ607562.1、OQ607563.1、OQ607564.1、OQ607565.1、OQ607566.1、OQ607567.1、OQ607568.1、OQ607569.1），與已登錄的菌株Colletotrichum gloeosporioides（登錄號(hào)依次為EF208618.1、AJ311880.1），相似性在99%以上。使用MEGA 7 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，該病原菌和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）聚為一個(gè)分支，進(jìn)一步表明該菌株為膠孢炭疽菌（Colletotri‐chum gloeosporioides）。

圖3 基于ITS 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on ITS gene

2.4 室內(nèi)毒力測(cè)定

由表1 可知，4 種化學(xué)藥劑的EC50大小順序?yàn)椋?0%丙森鋅可濕性粉劑＞5%己唑醇懸浮劑＞10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑＞32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑，山藥炭疽病菌對(duì)后3 種化學(xué)藥劑表現(xiàn)敏感，其中山藥炭疽病病原菌對(duì)32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑最為敏感，其EC50為0.020 4 mg·L-1。

表1 供試殺菌劑對(duì)山藥炭疽病病菌的毒力回歸方程和EC50Table 1 Virulence regression equation and EC50 of the tested fungicides against the pathogen of yam anthracnose

3 討論與結(jié)論

炭疽病是山藥種植中普遍發(fā)生的真菌病害，該病主要危害葉和莖，不同地區(qū)山藥炭疽病的病原菌種類不同[13]。眾多研究結(jié)果表明，山藥炭疽病病原菌種類繁多，其中有關(guān)于膠孢炭疽菌Colletotri‐chum gloeosporioides的 報(bào) 道 最 多[7-8，14]。而 韓 曉 勇等[15]認(rèn)為，引起紫山藥炭疽病的病原菌是喀斯特炭疽菌Colletotrichum karstii、膠孢炭疽菌Colletotri‐chum gloeosporioides、暹羅炭疽菌Colletotrichum si‐amense、隱秘炭疽菌Colletotrichum aenigma、薯蕷盤(pán)長(zhǎng)孢菌Gloeosporium Pestis[15]和辣椒炭疽菌Col‐letotrichum capsici[16]。炭疽菌類真菌在屬和種的命名上曾經(jīng)發(fā)生過(guò)重大變更，是同物異名，或是不同地域存在不同病原種，需要進(jìn)一步深入了解。

目前，控制該病害的發(fā)生主要還是采用化學(xué)防治的手段，筆者在本試驗(yàn)中采用4 種殺菌劑對(duì)雙峰青樹(shù)坪山藥炭疽病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，室內(nèi)毒力測(cè)定中5%己唑醇懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑3 種化學(xué)藥劑對(duì)山藥炭疽病病原菌均具有較好的抑菌效果，這與陳建等[17]、張帥等[8]對(duì)炭疽病原菌的研究基本一致，而且32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑是一種高效低毒的新型復(fù)配殺菌劑，在辣椒、水稻等農(nóng)作物病害防治中已有應(yīng)用研究，在生產(chǎn)過(guò)程中，不但能提高對(duì)該病的防治效果，還降低了成本，有效減少了農(nóng)藥用藥量，以及降低產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)[18]。

筆者從雙峰青樹(shù)坪采集山藥炭疽病病樣9 份，分離得到9 株分離物，經(jīng)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征觀察、18S rDNA-ITS 基因序列分析，明確引起山藥炭疽病的病原物為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。該病原菌對(duì)5%己唑醇懸浮劑、32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑3 種化學(xué)藥劑敏感，這些藥劑可用于山藥炭疽病的化學(xué)防治。通過(guò)對(duì)山藥炭疽病的發(fā)生危害調(diào)查、病原菌鑒定、致病性測(cè)定及病原菌室內(nèi)毒力測(cè)定的研究，為今后該病害發(fā)生和流行規(guī)律研究及科學(xué)防治奠定了基礎(chǔ)。