高產(chǎn)β-葡聚糖酶木霉菌誘變育種及對(duì)黃瓜枯萎病的生防效果

楊春林，李洪浩，胡 強(qiáng)，席亞東

（1.蔬菜品種改良與種質(zhì)創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 成都 610066；2.四川省樂山市植保植檢站 四川樂山 614000；3.竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·樂山師范學(xué)院 四川樂山 614000）

β-葡聚糖屬于非淀粉性多糖，是葡萄糖以β-1，3和β-1，4 糖苷鍵連接而成的D 型葡萄糖聚合物[1]。β-葡聚糖除了在植物細(xì)胞壁中少量存在外，還是絕大多數(shù)病原真菌細(xì)胞壁的主要骨架結(jié)構(gòu)成分[2]。β-葡聚糖酶屬于水解酶類，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和昆蟲中，因來源和序列進(jìn)化關(guān)系的差異，其結(jié)構(gòu)和催化功能呈現(xiàn)多樣性，目前關(guān)于具有應(yīng)用潛力的不同來源的β-葡聚糖酶的報(bào)道很多[3]。外源β-葡聚糖酶通過催化葡聚糖多聚體的水解而抑制病原真菌的生長及增殖[4]，在環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題日益突出的今天，作為具有生防功能的生物酶類，β-葡聚糖酶在植物真菌病害防治方面具有很大的研究應(yīng)用價(jià)值。

獲得β-葡聚糖酶的途徑主要有兩種，一種是從動(dòng)植物體內(nèi)分離提取[5-6]，另一種則是通過微生物發(fā)酵。目前報(bào)道產(chǎn)β-葡聚糖酶的微生物主要有芽孢桿菌[7-8]、鐮刀菌[9]、曲霉菌[10-11]、木霉菌等[12-13]。其中，木霉菌因同時(shí)具有空間占位、降解病原菌細(xì)胞壁及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御抗性等多種生防機(jī)制，是重要的植物病害生物防治菌[14-16]。由于篩選技術(shù)等方面的局限，野生菌株的產(chǎn)酶能力比較低，往往采取人工育種的方式對(duì)菌株進(jìn)行改良[17-19]以獲得理想菌株。誘變育種通過誘變劑處理提高菌種的突變概率和變異幅度，從而選出具有優(yōu)良特性的變異菌株[20]。四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生防實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明，哈茨木霉菌株Th-30 對(duì)多種蔬菜作物具有防病促生效果[21-22]。筆者采用紫外線照射與亞硝基胍處理相結(jié)合的方法對(duì)哈茨木霉菌株Th-30進(jìn)行誘變，選育β-葡聚糖酶高產(chǎn)突變菌株，提高其生防潛力，并評(píng)價(jià)突變木霉菌株β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果，以期為黃瓜枯萎病生物防治提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

哈茨木霉菌Trichoderma harzianumTh-30、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生防實(shí)驗(yàn)室保存；3%氨基寡糖素由河北嘉和生物科技有限公司生產(chǎn)；2%春雷霉素由江西省贛州宇田化工有限公司生產(chǎn)；β-葡聚糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品由德國Sigma 公司生產(chǎn)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試劑及培養(yǎng)基制備

1.2.1 試劑配制DNS 試劑 3，5-二硝基水楊酸3.15 g、酒石酸鉀鈉91 g、NaOH 20 g、無水亞硫酸鈉2.5 g、苯酚2.5 g、ddH2O 1000 mL；亞硝基胍（NTG）溶液：NTG 結(jié)晶10 mg、助溶劑甲酸銨0.05 mL、pH 6 磷酸鹽緩沖液配成4000 μg·mL-1原液。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 初篩培養(yǎng)基（1 L）：l g·L-1β-葡 聚 糖、3 g·L-1NaNO3、0.6 g·L-1去氧膽酸鈉、1 g·L-1K2HPO4、0.01 g·L-1FeSO4·7H2O、0.5 g·L-1MgSO4·7H2O、0.5 g·L-1KCl、18 g·L-1瓊脂，4 g·L-1的剛果紅溶液3 mL。葡聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1 g·L-1β-葡聚糖、5 g·L-1蛋白胨、10 g·L-1燕麥粉、1 g·L-1KH2PO4、0.1 g·L-1CuSO4·5H2O、0.1 g·L-1CaCl2·2H2O、0.08 g·L-1MnCl2·4H2O、0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.07 g·L-1ZnSO4·7H2O、0.05 g·L-1CoCl2·6H2O、0.01 g·L-1FeSO4·7H2O。

1.3 木霉菌的復(fù)合誘變育種

1.3.1 單孢子懸液的制備 誘變試驗(yàn)于2021 年7－11 月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病害實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。取斜面保存的木霉菌種，于30 ℃條件下活化培養(yǎng)，用無菌生理鹽水沖洗孢子制成懸液，倒入無菌三角瓶中，塞緊棉塞并用無菌牛皮紙包扎瓶口，充分振蕩形成單孢子懸液，用滅菌的脫脂棉過濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為106CFU·mL-1。

1.3.2 紫外誘變 移取單孢子懸液5 mL 加至無菌培養(yǎng)皿，放入無菌磁力攪拌子，用黑紙包住后置于磁力攪拌器上，距15 W 紫外燈30 cm 處誘變5～45 min。移取經(jīng)紫外線照射的孢子懸液，將孢子濃度調(diào)整為104CFU·mL-1，取0.1 mL 孢子懸液涂布于初篩培養(yǎng)基上，用黑紙包住于30 ℃培養(yǎng)72 h 后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率。從致死率為70%～80%的平板中挑取生長旺盛、透明圈大的菌落，接種于剛果紅鑒定平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3 次，觀察記錄菌落生長和透明圈產(chǎn)生情況。選取透明圈直徑/菌落直徑較大的菌株，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后按1.3.1 的方法制成單孢子懸液進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.3 亞硝基胍誘變 將5 mL 單孢子懸液、1 mL NTG 溶液加入離心管中，充分混勻，28 ℃水浴振蕩5～45 min，離心后去上清液，用無菌水洗滌菌體3～5 次以終止NTG 的誘變作用；加入5 mL 無菌生理鹽水，充分搖勻，取0.1 mL 孢子懸液涂布于初篩培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)72 h 后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，并計(jì)算致死率。從致死率70%～80%的平板中挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，觀察記錄菌落生長和透明圈產(chǎn)生情況，選取透明圈直徑/菌落直徑較大的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 突變菌株β-葡聚糖酶粗酶液的制備 將突變菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)至產(chǎn)生大量綠色分生孢子，用5 mL 無菌水沖洗并收集分生孢子液，將孢子濃度調(diào)整到106CFU·mL-1后接種到葡聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于28 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)64 h，得到木霉β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液。將發(fā)酵液于4 ℃、5000 r·min-1離心10 min，取上清液。在上清液中加入分散的硫酸銨，攪拌均勻后于室溫靜置過夜，將鹽析液于4 ℃、8000 r·min-1離心20 min，去上清液，加入5 mL 磷酸鹽緩沖液充分溶解，若出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象則再次離心10 min；將上清液用0.20 μm 微孔濾膜過濾，除去分生孢子即得β-葡聚糖酶粗酶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5β-葡聚糖酶活性測定 采用還原糖法（DNS法）測定突變菌株的β-葡聚糖酶粗提液活性，以1 mL 粗酶液1 分鐘水解葡聚糖產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的β-葡聚糖酶量為1 個(gè)酶活性單位（U）。

1.3.6 突變菌株生長速率及產(chǎn)孢能力測定 將突變菌株于20 ℃活化培養(yǎng)3 d，用打孔器沿菌落邊緣截取直徑5 mm 菌塊接種于PDA 培養(yǎng)基上，黑暗條件下20 ℃恒溫培養(yǎng)2 d 和7 d 分別測量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3.7 突變菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 將保存的突變菌株用PDA 培養(yǎng)基活化培養(yǎng)10 d 后進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接至第8 代，采用DNS 法測定每代菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶活性，研究其高產(chǎn)β-葡聚糖酶的遺傳穩(wěn)定性。

1.4 不同木霉菌β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)室內(nèi)盆栽黃瓜枯萎病的防治效果

1.4.1 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理 試驗(yàn)于2022 年3－4月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。黃瓜種子經(jīng)5%次氯酸鈉溶液浸種10 min 后用清水沖洗，放入墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱于28 ℃催芽；胚根長約5 mm時(shí)將其播種于塑料育苗缽內(nèi)，在20～25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)育苗，每天光照12 h，育苗基質(zhì)為高溫蒸汽滅菌（134 ℃，30 min）的蛭石、草炭和菜田土（體積比為1∶2∶1）。試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)處理：清水對(duì)照（CK）、UN-2β-葡聚糖酶發(fā)酵液、UN-2β-葡 聚 糖 酶 粗 酶液、Th-30β-葡聚糖酶發(fā)酵液、3%氨基寡糖素、2%春雷霉素，每個(gè)處理3 次重復(fù)，出苗后每組保留30株生長健壯一致的幼苗，隨機(jī)區(qū)組排列，常規(guī)管理，至2 片子葉展平期，將幼苗連根取出，清水沖洗根部后用106CFU·mL-1黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液沒過根部浸根5 s，重新定植于育苗缽內(nèi)；間隔24 h 后，每育苗缽分別澆入200 mL 不同的處理液，15 d 后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)和防治效果。

1.4.2 盆栽病害調(diào)查 按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1857.3—2010）《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第三部分：黃瓜抗枯萎病鑒定技術(shù)規(guī)程》，將黃瓜枯萎病病情級(jí)別劃分為5 個(gè)級(jí)別：0 級(jí)，無癥狀；1 級(jí)，子葉黃化，但未萎蔫；2 級(jí)，子葉萎蔫；3 級(jí)，子葉和真葉萎蔫或植株矮化；4級(jí)，枯死。病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果/%＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100。

1.4.3 幼苗鮮質(zhì)量調(diào)查 試驗(yàn)結(jié)束后輕輕取出黃瓜幼苗沖洗干凈，用濾紙將水分吸干后用電子天平稱量各處理幼苗鮮質(zhì)量，并計(jì)算增重率。增重率/%=（處理組幼苗鮮質(zhì)量－對(duì)照組幼苗鮮質(zhì)量）/對(duì)照組幼苗鮮質(zhì)量×100。

1.5 突變木霉菌株UN-2對(duì)黃瓜枯萎病的大田防治效果

1.5.1 大田試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理 試驗(yàn)分別于2022 和2023 年3－6 月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園進(jìn)行，選擇黃瓜枯萎病發(fā)病較重的連作黃瓜地進(jìn)行大田防治效果試驗(yàn)。黃瓜幼苗第1 片真葉出現(xiàn)時(shí)移栽，種植密度為3000 株·667 m-2。試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，共12 個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)移栽100 株黃瓜苗。移栽5 d 后，采用灌根法施用1.3.4 制備的木霉UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液、木霉UN-2β-葡聚糖酶粗酶液，每株施用200 mL，每隔7 d 施用1 次，連續(xù)3 次，以施用3%氨基寡糖素800 倍液和清水為對(duì)照。

1.5.2 大田病害調(diào)查 第3 次施藥后10 d（幼苗期）、25 d（速長期）、40 d（開花期）、55 d（盛果期）分4 次調(diào)查各小區(qū)黃瓜枯萎病發(fā)病情況。參照張忠良等[23]的方法，將黃瓜枯萎病病情級(jí)別劃分為5 個(gè)級(jí)別：0 級(jí)，植株正常生長，不發(fā)?。? 級(jí)，植株有少于1/4 的葉片萎蔫；2 級(jí)，植株有等于或多于1/4、少于1/2 的葉片萎蔫；3 級(jí)，植株有等于或多于1/2、少于3/4 的葉片萎蔫；4 級(jí)，植株完全萎蔫死亡。病情指數(shù)和防治效果計(jì)算方法同1.4.2。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2007 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，DPS 9.50統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan 氏新復(fù)極差法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變方法對(duì)木霉菌株的致死效應(yīng)

由圖1～2 可知，兩種誘變方式下木霉孢子致死率在處理前期均呈快速增長趨勢，處理15 min 時(shí)致死率已超過75%，隨著誘變時(shí)間的延長，誘變處理對(duì)木霉孢子的致死率曲線趨于平緩。其中，紫外誘變15 min 對(duì)木霉孢子致死率為78.6%，亞硝基胍誘變10 min 對(duì)木霉孢子致死率為76.3%。試驗(yàn)以木霉孢子致死率70%～80%的處理劑量為參考，即紫外線輻射誘變15 min 再用亞硝基胍處理10 min 作為復(fù)合誘變育種方式。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 Mutagenic lethality curve of ultraviolet

圖2 亞硝基胍誘變致死率曲線Fig.2 Mutagenic lethality curve of NTG

2.2 高產(chǎn)葡聚糖酶木霉菌株的選育

通過復(fù)合誘變篩選出126 株在初篩培養(yǎng)基上生長旺盛且透明圈/菌落直徑比較大的突變木霉菌株。將126 株突變菌株進(jìn)行β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵試驗(yàn)，DNS 法酶活測定結(jié)果表明，6 株突變木霉菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶能力顯著高于親本木霉菌株Th-30，分別編號(hào)為UN-1、UN-2、UN-3、UN-4、UN-5和UN-6（表1），6 株突變菌株β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液酶活性為33.70～44.50 U，較親本菌株提高57.70%～108.24%；其中突變菌株UN-2 和UN-5 發(fā)酵液酶活性提高率均超100%，產(chǎn)酶能力顯著高于其他突變菌株。從不同菌株的生長特性來看，除了突變菌株UN-3、UN-5 的菌絲生長速率顯著低于親本菌株外，其他突變菌株生長速率與親本菌株沒有顯著差異；除了UN-4 的產(chǎn)孢量顯著低于親本菌株外，其他突變菌株的產(chǎn)孢量與親本菌株沒有顯著差異。

表1 不同菌株的β-葡聚糖酶活性及生長特性Table 1 Activity of β-Glucanase and growth characteristics of different strains

2.3 突變菌株產(chǎn)酶能力的遺傳穩(wěn)定性

突變木霉菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），6 株突變菌株產(chǎn)酶能力在代次轉(zhuǎn)接前期均有不同程度下降，轉(zhuǎn)接5 代后其產(chǎn)β-葡聚糖酶活性基本保持穩(wěn)定，說明本試驗(yàn)通過復(fù)合誘變獲得的目標(biāo)菌株高產(chǎn)β-葡聚糖酶的能力具有較好的遺傳穩(wěn)定性。其中，菌株UN-2 高產(chǎn)β-葡聚糖酶遺傳穩(wěn)定性最好，轉(zhuǎn)接8 代后產(chǎn)β-葡聚糖酶活性為44.1 U，與第1 代基本相當(dāng)；其次是菌株UN-4，其轉(zhuǎn)接8 代后產(chǎn)β-葡聚糖酶活性為39.8 U；菌株UN-5 第1 代產(chǎn)β-葡聚糖酶活性最高，但是轉(zhuǎn)接4 代后產(chǎn)酶能力下降較快，轉(zhuǎn)接8 代后β-葡聚糖酶活性為38.1 U，較第1 代下降14.38%。

圖3 突變菌株產(chǎn)酶能力的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of enzyme production ability of mutant strains

2.4 木霉菌β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)室內(nèi)盆栽黃瓜枯萎病的防治效果

由表2 可知，黃瓜枯萎病盆栽防治效果5 組處理病情指數(shù)為23.33～40.83，均顯著低于清水對(duì)照；UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液和UN-2β-葡聚糖酶粗酶液處理的病情指數(shù)均顯著低于Th-30β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液和2%春雷霉素處理。從防治效果看，3%氨基寡糖素對(duì)黃瓜枯萎病防治效果最好，達(dá)68.31%；UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液和UN-2β-葡聚糖酶粗酶液對(duì)黃瓜枯萎病防治效果分別為65.29%、63.77%，均與3%氨基寡糖素和2%春雷霉素處理差異不顯著。不同處理對(duì)黃瓜幼苗增重率差異明顯，其中木霉UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液和3%氨基寡糖素對(duì)黃瓜幼苗促生增重效果較好，增重率均超過30%。木霉UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液不論是對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果還是黃瓜幼苗的單株增重率均高于UN-2β-葡聚糖酶粗酶液。

表2 不同木霉菌株對(duì)室內(nèi)盆栽黃瓜枯萎病的防治效果Table 2 Indoor potted control effects of different Trichoderma harzianum strain on cucumber wilt disease

2.5 突變菌株UN-2對(duì)黃瓜枯萎病的大田防治效果

由表3 可知，大田防治效果試驗(yàn)突變木霉菌株UN-2 對(duì)黃瓜枯萎病具有一定的防控作用。2022 年大田防治試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在黃瓜幼苗期和速長期，UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果分別為62.72%、67.11%，UN-2β-葡聚糖酶粗酶液對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果分別為61.01%、63.28%，同一生育期內(nèi)2 個(gè)生防處理的防治效果均與3%氨基寡糖素差異不顯著。黃瓜開花期，UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果為66.38%，與3%氨基寡糖素處理差異不顯著，顯著高于UN-2β-葡聚糖酶粗酶液處理。黃瓜盛果期，UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液、UN-2β-葡聚糖酶粗酶液和3%氨基寡糖素的防治效果分別為65.22%、50.72%和57.24%，不同處理之間差異顯著。不同處理均在黃瓜速長期（第3 次施藥后25 d）防治效果達(dá)到最高，隨著黃瓜生育期的發(fā)展，UN-2β-葡聚糖酶粗酶液和3%氨基寡糖素對(duì)黃瓜枯萎病防治效果下降較快，UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液的防治效果下降較慢，其原因可能是發(fā)酵液中的木霉孢子在黃瓜根際土壤和植株體內(nèi)定殖，代謝產(chǎn)物包括β-葡聚糖酶等系列生防因子可持續(xù)產(chǎn)生抗病作用。2023年大田試驗(yàn)結(jié)果與2022 年相似，由于降雨偏少，黃瓜枯萎病田間病情指數(shù)比2022 年小，不同處理的防治效果均比2022 年有所提高，其中UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)不同生育期黃瓜枯萎病的防 治 效 果 分 別 為68.47% 、71.63% 、70.79% 和68.65%。

表3 突變菌株UN-2 對(duì)黃瓜枯萎病的田間防治效果Table 3 Field control effect of mutant strain UN-2 on cucumber wilt disease

3 討論與結(jié)論

野生菌株改良手段主要有誘變育種、原生質(zhì)體融合以及遺傳改造等[18，24]。雖然建立在現(xiàn)代基因操作技術(shù)基礎(chǔ)上的基因改造更為精確，但誘變育種往往能帶來更為復(fù)雜的連鎖反應(yīng)結(jié)果并具有應(yīng)用簡便、費(fèi)用低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前菌種選育最常用的方法[25]。目前，報(bào)道較多的誘變育種手段有紫外輻射誘變、亞硝基胍處理、低溫等離子體誘變或以上述兩種方法復(fù)合誘變[26-27]。本試驗(yàn)采用紫外線照射與亞硝基胍處理相結(jié)合的方法，對(duì)哈茨木霉菌Th-30 進(jìn)行復(fù)合誘變育種，得到6 個(gè)高產(chǎn)β-葡聚糖酶的突變菌株，其β-葡聚糖酶活性與親本菌株相比提高57.70%～108.24%，且高產(chǎn)酶能力具有遺傳穩(wěn)定性，說明該方法在木霉菌株誘變育種中具有一定的適用性。

誘變育種的原理是通過物理或化學(xué)的誘導(dǎo)使微生物中某些基因進(jìn)行重組或缺失來優(yōu)化基因性狀，而這個(gè)過程往往對(duì)微生物具有一定的致死效應(yīng)。在誘變育種過程中，致死率過低，不能產(chǎn)生足夠的變異個(gè)體，使下一步篩選工作難度增加，致死率過高則存活菌數(shù)量太低且變異菌株活力較弱，一般選取致死率為70%～80%的處理劑量作為選育高產(chǎn)菌株的參考劑量[28]。試驗(yàn)中紫外誘變15 min、亞硝基胍誘變10 min 對(duì)應(yīng)木霉孢子致死率分別為78.6%和76.3%，兩種方法復(fù)合誘變獲得的β-葡聚糖酶高產(chǎn)突變菌株具有遺傳穩(wěn)定性，且對(duì)木霉菌株菌絲生長速率和產(chǎn)孢量沒有顯著影響。由于試驗(yàn)室條件的限制，筆者僅從酶活性水平上考查了突變菌株產(chǎn)酶能力的遺傳穩(wěn)定性，在短期內(nèi)為研究工作的開展提供了有價(jià)值的參考，突變菌株在β-葡聚糖酶基因表達(dá)水平上的遺傳穩(wěn)定性還有待在今后的研究和應(yīng)用中驗(yàn)證。

天然來源的β-葡聚糖酶資源豐富、性質(zhì)穩(wěn)定，具有特定的催化活性，在植物保護(hù)方面發(fā)揮著重要的作用[29]。葡聚糖酶能通過水解病原真菌細(xì)胞壁成分控制病害發(fā)展，其直接作用于植物細(xì)胞壁的產(chǎn)物低聚糖可誘導(dǎo)與抗病反應(yīng)有關(guān)的酶類如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸-CoA 聯(lián)結(jié)酶（4CL）的合成，從而增強(qiáng)植物的抗病性[2]。范青等[30]探討了兩種拮抗菌葡聚糖酶的產(chǎn)生及抑菌的機(jī)制，李紀(jì)順等[31]通過染色體整合β-1，4-葡聚糖酶基因提高綠色木霉對(duì)小麥紋枯病的防治效果，程紅梅等[32]通過轉(zhuǎn)β-1，3-葡聚糖酶基因提高棉花對(duì)枯萎病和黃萎病的抗性。黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum侵染引起的一種維管束病害[33]。黃瓜枯萎病發(fā)病率一般為20%～30%，嚴(yán)重時(shí)為80%～90%，是制約黃瓜產(chǎn)量及品質(zhì)的重要因素[34]。目前，防控黃瓜枯萎病的方法主要以化學(xué)防治為主，也有利用木霉菌等生物制劑防控黃瓜枯萎病的研究和報(bào)道。李進(jìn)一等[35]通過溫室盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)短密木霉菌株對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)90.4%；谷祖敏等[36]研究表明，木霉菌可以明顯促進(jìn)黃瓜根系和植株的生長發(fā)育；王依純等[37]報(bào)道了一株擬康氏木霉菌對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果高達(dá)81.54%，且對(duì)黃瓜幼苗有明顯的促生作用。木霉菌能產(chǎn)生多種降解植物病原菌細(xì)胞壁的酶類物質(zhì)，其中β-葡聚糖酶是公認(rèn)的影響生防菌株重寄生能力的重要因子。筆者的試驗(yàn)通過誘變育種獲得的β-葡聚糖酶高產(chǎn)木霉菌株UN-2 發(fā)酵液處理黃瓜枯萎病的病情指數(shù)顯著低于親本菌株Th-30 處理，并對(duì)黃瓜幼苗具有明顯的促生增重作用，證實(shí)木霉菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶能力的增強(qiáng)和生防潛力之間具有正相關(guān)性。2023 年大田試驗(yàn)結(jié)果表明，突變木霉菌株UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)不同生育期黃瓜枯萎病的防治效果分別為68.47%、71.63%、70.79%和68.65%。

綜上所述，突變木霉菌株UN-2 產(chǎn)β-葡聚糖酶活性顯著提高，其β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病具有良好的防治效果，對(duì)黃瓜幼苗具有明顯促生作用，是一種可以有效防治黃瓜枯萎病的生防資源。下一步需要優(yōu)化突變菌株UN-2β-葡聚糖酶誘導(dǎo)發(fā)酵條件及生防制劑的生產(chǎn)工藝，深入探討其高效利用技術(shù)，為黃瓜枯萎病的生物防治提供重要技術(shù)支撐。