高溫脅迫下外源褪黑素對(duì)膠州大白菜幼苗生理特性的影響

周海月，劉維信，陳 熙，倪潤(rùn)茂，趙紫彤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 山東青島 266109）

大白菜（Brassica campestrisL.ssp.pekinensis）喜低溫冷涼環(huán)境，幼苗期適宜溫度為20～25 ℃，因此多在秋季氣溫偏涼時(shí)種植。膠州大白菜原產(chǎn)于山東省青島市膠州市，具有味美鮮甜、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，是全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品，更是青島特產(chǎn)，栽培面積約4000 hm2。然而在實(shí)際生產(chǎn)中，秋后內(nèi)陸極端高溫會(huì)使膠州大白菜出現(xiàn)出苗受阻，葉片萎蔫、發(fā)黃甚至枯萎的現(xiàn)象，制約膠州大白菜生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量及商品性。

褪黑素（melatonin，MT）被認(rèn)為是潛在參與調(diào)控種子萌發(fā)的一種植物激素[1]。近些年研究發(fā)現(xiàn)MT 廣泛存在于高等植物體內(nèi)，目前在蔥科、鳳梨科、天南星科、十字花科等100 多種植物中均已發(fā)現(xiàn)MT 的存在[2]，褪黑素對(duì)植物的各種生理活動(dòng)起重要作用，尤其是可以緩解各種逆境對(duì)植物的損傷[3]。噴施MT 能顯著提高小白菜抗氧化物酶的活性[4]，間接增加抗氧化物質(zhì)的含量，提高西瓜嫁接苗的低溫抗性[5]；MT 還能高效清除自由基從而增強(qiáng)黃瓜的耐冷性[6]和耐熱性[7-8]，提高玉米抗鹽脅迫能力[9]，緩解干旱脅迫對(duì)小麥幼苗的細(xì)胞膜造成的損害[10]。但目前關(guān)于MT 緩解大白菜幼苗高溫脅迫下的生理機(jī)制尚不清晰。

筆者利用不同濃度外源MT 處理膠州大白菜幼苗，并與脅迫對(duì)照相比，研究高溫脅迫下膠州大白菜的各項(xiàng)生理指標(biāo)變化，揭示外源MT 緩解膠州大白菜高溫脅迫的作用機(jī)制，為膠州大白菜抵抗高溫逆境方面的研究和實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的膠州大白菜商品種為秋季王，購(gòu)于膠州市東茂蔬菜研究所。褪黑素購(gòu)于麥克林公司（上海）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于2022 年9－12 月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科技樓進(jìn)行。大白菜種子消毒后進(jìn)行催芽，萌發(fā)的種子直接播種到50 孔穴盤(pán)進(jìn)行培苗，待幼苗長(zhǎng)到2 葉1 心時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽到直徑10 cm 的圓形花盆中，基質(zhì)加水混勻至成團(tuán)不滴水的狀態(tài)裝盆，每盆1 棵，放入實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行后續(xù)的脅迫處理。每個(gè)處理20 盆幼苗。光周期12 h（晝）/12 h（夜）、晝夜溫度（28±1）℃/（17±1）℃。待植株子葉展平生長(zhǎng)到5 周齡后選擇整齊一致的壯苗，進(jìn)行噴施外源MT 處理，設(shè)置6 個(gè)處理濃度，分別為0（CK）、10、50、100、200 和500 μmol·L-1，于夜間避光噴施，以葉片滴水為度，噴布幼苗葉片，一共噴施3 次，每次間隔24 h，最后一次噴施MT 1 d 后將幼苗進(jìn)行高溫處理，培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)定為：光周期12 h（晝）/12 h（夜），光照度1000 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度75%，晝夜溫度（39±1）℃/（27±1）℃。

1.2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 高溫脅迫11 d 后進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定，用直尺測(cè)定幼苗的株高、葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)，用游標(biāo)卡尺測(cè)定莖粗。將幼苗清理干凈后稱(chēng)鮮質(zhì)量，烘干至恒質(zhì)量后分別測(cè)定地上部和地下部干質(zhì)量。

1.2.3 生理指標(biāo)的測(cè)定 分別在脅迫的第1、3、5、7、9、11 天，選取各處理長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的植株，取其第4 片真葉用于各生理指標(biāo)的測(cè)定。參考高俊鳳[11]的方法測(cè)定相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性，采用氮藍(lán)四唑法（NBT）測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量。參考Heath[12]的方法測(cè)定葉綠素總含量和葉綠素a 含量；采用TAD 法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[13]。上述指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次，以平均值作為各處理的實(shí)測(cè)值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 整理所得數(shù)據(jù)并繪制表格和柱形圖，采用IBM SPSS Statistics 26 進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度外源MT 處理對(duì)膠州大白菜形態(tài)指標(biāo)的影響

2.1.1 不同濃度外源MT 處理對(duì)膠州大白菜生長(zhǎng)發(fā)育特性的影響 由圖1 可以看出，高溫脅迫處理前3 d 大白菜葉片幾乎無(wú)變化，在高溫脅迫第5天時(shí)CK 和500 μmol·L-1MT 處理組葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；脅迫第7 天時(shí)CK 和500 μmol·L-1MT 處理組葉片大部分萎蔫，10 μmol·L-1MT 處理組部分葉片萎蔫；脅迫第9 天時(shí)200 μmol·L-1MT 處理組葉片出現(xiàn)萎蔫；脅迫第11 天時(shí)CK 和500 μmol·L-1MT處理組出現(xiàn)植株死亡情況，10 μmol·L-1MT 處理組葉片出現(xiàn)發(fā)黃、失綠、大面積萎蔫的現(xiàn)象，且無(wú) 法 恢 復(fù)，50 和200 μmol·L-1MT 處 理組有部分葉片萎蔫，100 μmol·L-1MT 處理組表現(xiàn)正常。由表1 可以看出，噴施MT 能顯著提高高溫脅迫下大白菜的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)（除地下部干質(zhì)量和500 μmol·L-1MT 處 理 的 莖 粗），且 隨 噴 施 濃 度的增加總體上呈先上升再下降的趨勢(shì)，其中噴施100 μmol·L-1MT 處理的株高、葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、莖粗、鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量、地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量最高，分別比CK 顯著增加36.17%、46.31%、151.42%、73.31%、115.14%、78.87%、77.41%、192.62%。

圖1 高溫脅迫下不同濃度外源MT 處理11 d 內(nèi)大白菜幼苗形態(tài)的變化Fig 1 Changes in the morphology of Chinese cabbage seedlings under high temperature stress with different concentrations of exogenous MT treatments within 11 d

2.1.2 高溫脅迫下MT 處理對(duì)苗期膠州大白菜葉片葉綠素含量的影響 由圖2 可以看出，除第1 天和第7 天500 μmol·L-1MT 處理外，高溫脅迫下所有噴施MT 處理的總?cè)~綠素和葉綠素a 含量均高于CK。CK 和500 μmol·L-1MT 處理的總?cè)~綠素和葉綠素a 含量在11 d 內(nèi)持續(xù)下降，而10、50、100、200 μmol·L-1MT 處理的總?cè)~綠素和葉綠素a 含量隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，各處理的總?cè)~綠素和葉綠素a 含量在第5 天達(dá)到最高，其中50、100、200 μmol·L-1MT 處理的總?cè)~綠素和葉綠素a 含量（第1 天除外）在高溫脅迫時(shí)均高于CK，脅迫第11 天時(shí)分別比CK 顯著增加56.63%、63.02%、27.67%和69.04%、87.66%、57.12%。

圖2 高溫脅迫下外源MT 對(duì)大白菜葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of exogenous MT on chlorophyll content of Chinese cabbage leaves under high temperature stress

2.2 外源MT 對(duì)高溫脅迫下大白菜幼苗生理特性的影響

2.2.1 外源MT 對(duì)高溫脅迫下大白菜幼苗滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響 由圖3-A 可以看出，隨脅迫時(shí)間增加，葉片可溶性蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，第5 天時(shí)所有處理的可溶性蛋白質(zhì)含量均達(dá)到最高，噴施外源MT 的各處理降幅整體均小于CK，其中100 μmol·L-1MT 處理的可溶性蛋白質(zhì)含量（除第1 天外）均高于其他處理，在高溫第5 天和第11 天時(shí)100 μmol·L-1MT 處理分別比CK 顯著提高62.52%和119.34%。

圖3 高溫脅迫下外源MT 對(duì)大白菜葉片滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響Fig.3 Effects of exogenous MT on the osmoregulatory system of Chinese cabbage leaves under high temperature stress

由圖3-B 可以看出，除100 μmol·L-1MT 處理外，其他處理隨脅迫時(shí)間增加葉片相對(duì)含水量呈持續(xù)下降趨勢(shì)，噴施外源MT 各處理組的相對(duì)含水量降幅均小于CK，其中100 μmol·L-1MT 處理的葉片相對(duì)含水量在高溫11 d 內(nèi)下降10.86%，降幅低于其他處理，在脅迫第11 天時(shí)100 μmol·L-1MT 處理葉片相對(duì)含水量比CK 顯著高54.21%。

由圖3-C 可以看出，隨脅迫時(shí)間增加，葉片相對(duì)電導(dǎo)率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，噴施外源MT 各處理組的相對(duì)電導(dǎo)率增幅均小于CK，100 μmol·L-1MT處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率在高溫11 d 內(nèi)上升27.68%，增幅均低于其他處理，在脅迫第11 天時(shí)100 μmol·L-1MT 處理比CK 顯著低30.40%。

2.2.2 外源MT 處理對(duì)膠州大白菜抗氧化酶活性的影響 由圖4 可以看出，隨脅迫時(shí)間增加，抗氧化酶活性大致呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)（除CK、200 μmol·L-1和500 μmol·L-1MT 處理組的APX 活性），APX、SOD 和CAT 活性在第5 天達(dá)到最高，POD 活性在第3 天達(dá)到最高。外源MT 處理組的SOD 和CAT 活性在脅迫第3 天后均高于CK，APX 活性在脅迫第5 天后高于CK，10、100、200 μmol·L-1MT 處理組的POD 活性在脅迫第3 天后均高于CK。100 μmol·L-1MT 處理的膠州大白菜幼苗的SOD 和POD 活性在脅迫第3 天后顯著高于CK 和其他處理組。在脅迫第11 天時(shí)，100 μmol·L-1MT 處理組的APX、SOD、CAT、POD 活性分別比CK 顯著提高105.04%、93.96%、153.48% 和294.21%。

2.2.3 外源MT處理對(duì)大白菜MDA含量的影響由圖5 可以看出，隨脅迫時(shí)間的增加，葉片MDA 含量整體呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，除第1 天外，噴施MT 處理的葉片MDA 含量在整個(gè)脅迫時(shí)間內(nèi)均顯著低于CK。100 μmol·L-1MT 處理的MDA 含量在第3 天增幅最小，整個(gè)脅迫期間（除第1 天外）都顯著低于其他處理，第11 天時(shí)葉片MDA 含量比CK 顯著降低55.15%。

圖5 高溫脅迫下外源MT 對(duì)大白菜葉片MDA 含量的影響Fig.5 Effect of exogenous MT on MDA content of Chinese cabbage leaves under high temperature stress

3 討論與結(jié)論

葉綠素是高等植物和所有其他能進(jìn)行光合作用的生物體中所特有的一類(lèi)能吸收傳遞光能和參與光化學(xué)反應(yīng)的光合綠色色素。植物葉綠素含量與其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)，研究表明，大部分葉綠素a 和全部葉綠素b 是主要參與吸收和傳遞光能的光合色素，葉綠素a 更是作物光合作用的主要組分，可以反映作物對(duì)長(zhǎng)波光的吸收程度[12]。

可溶性蛋白質(zhì)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，保護(hù)生物膜及細(xì)胞的生命物質(zhì)免受脅迫傷害[13]。MT通過(guò)增加可溶性蛋白質(zhì)的含量，提高玉米[9]]、甜瓜[13抗鹽脅迫的能力，增強(qiáng)菊花幼苗耐熱性[14]。

前人研究表明，外源MT 處理能夠提高高溫脅迫下甘藍(lán)[15]、黃瓜[7-8]中APX、SOD、CAT 和POD 的活性；研究發(fā)現(xiàn)，外源MT 處理能夠降低鹽脅迫下玉米[9]、干旱脅迫下油菜[16]和冷脅迫下黃瓜[17]中MDA 的含量。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫脅迫導(dǎo)致膠州大白菜幼苗葉片葉綠素含量明顯下降，但噴施MT 能在短時(shí)間內(nèi)顯著提高總?cè)~綠素含量和葉綠素a 含量，以100 μmol·L-1MT 處理效果最佳，說(shuō)明外源MT 處理可以增強(qiáng)膠州大白菜幼苗葉片光合色素的穩(wěn)定性，與在小麥[10]、小白菜幼苗[18]、甜瓜[19]上的研究結(jié)果一致。這可能與MT 可以調(diào)節(jié)光合色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)、提高葉綠素合成過(guò)程中的酶活性有關(guān)[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨脅迫時(shí)間增加膠州大白菜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，噴施不同濃度MT 在一定程度上提高了葉片可溶性蛋白質(zhì)含量，這可能是因?yàn)镸T 會(huì)調(diào)節(jié)植物的蛋白質(zhì)代謝，從而影響可溶性蛋白質(zhì)的合成。100 μmol·L-1MT 處理的膠州大白菜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量最高，對(duì)高溫脅迫的緩解效果最好。相對(duì)電導(dǎo)率反映細(xì)胞膜損壞程度，可以通過(guò)這一重要指標(biāo)鑒定植物高溫抗性能力的強(qiáng)弱[20]。高溫導(dǎo)致植物的水分蒸發(fā)速率加快，引起植物體內(nèi)的電解質(zhì)紊亂，加劇植物葉片水分流失，從而造成葉片萎蔫[21]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使其死亡。高溫脅迫下膠州大白菜葉片相對(duì)含水量逐漸降低，葉片相對(duì)電導(dǎo)率逐漸升高，說(shuō)明高溫破環(huán)了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致膜透性增強(qiáng)。噴施MT 可有效緩解高溫脅迫對(duì)大白菜細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，減少細(xì)胞膜的破裂和細(xì)胞質(zhì)胞液外滲，100 μmol·L-1MT 處理表現(xiàn)最好，這與前人在油菜幼苗上的研究結(jié)果一致[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，APX、SOD、CAT、POD 活性和MDA 含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，APX、SOD、CAT 活性在高溫脅迫下前5 d 逐漸上升之后第7 天開(kāi)始下降；POD 活性在高溫脅迫下前3 d 上升后第5 天迅速下降，MDA 含量先上升后緩慢下降。然而，高溫脅迫第3 天開(kāi)始，外源MT 處理組的SOD和CAT 活性均高于CK，10、100、200 μmol·L-1MT處理組的POD 活性高于CK；MDA 含量均顯著低于CK。噴施100 μmol·L-1MT 的膠州大白菜幼苗APX 活性在第5 天顯著高于其他處理組，自脅迫第3 天開(kāi)始，100 μmol·L-1MT 處理組的SOD、CAT（除第7 天）和POD 活性最高，MDA 含量最低?？寡趸富钚缘淖兓砻魍庠碝T 可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物的抗氧化系統(tǒng)，降低高溫脅迫對(duì)植物的氧化損傷，從而增強(qiáng)大白菜的耐熱性。MDA 含量下降也許是因?yàn)榭寡趸窤PX、SOD、POD 和CAT 活性的提高，清除了自由基。以上結(jié)果說(shuō)明，外源MT 通過(guò)調(diào)節(jié)植物的MDA 含量減輕氧化應(yīng)激作用，降低了高溫對(duì)膠州大白菜的損傷程度。

綜上所述，與對(duì)照相比，噴施不同濃度的外源MT，能夠提高膠州大白菜幼苗的生物量、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和多種抗氧化酶（APX、SOD、CAT）活性，減緩了相對(duì)含水量下降和相對(duì)電導(dǎo)率提升，并且顯著降低了除脅迫第1 天外的MDA 含量。同時(shí)，不同濃度MT 噴施的效果也存在差異，濃度為100 μmol·L-1的外源MT 噴施葉面效果最佳。