甜瓜高效不定芽再生體系的建立

賀玉花，徐龍?zhí)m，唐伶俐，徐永陽，田小琴，張 健，孔維虎，李文東，趙光偉

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009；2.三亞中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家南繁研究院 海南三亞 572000；3.濰坊創(chuàng)科種苗有限公司 山東昌樂 262400）

甜瓜（Cucumis meloL.）屬于葫蘆科甜瓜屬，是世界上重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物之一。我國是世界甜瓜生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國，據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2021 年我國甜瓜種植面積為38.66 萬hm2，產(chǎn)量達(dá)1400 萬t，占世界總產(chǎn)量的49%。當(dāng)前甜瓜育種多依賴雜交、回交等傳統(tǒng)育種手段，存在育種周期長、盲目性大、改良數(shù)量性狀效果較差等缺點(diǎn)[1-2]。與傳統(tǒng)育種相比，分子育種更精準(zhǔn)高效，是當(dāng)前和未來甜瓜育種中的重要策略。解析基因功能是開展分子育種的前提，遺傳轉(zhuǎn)化是進(jìn)行基因功能驗(yàn)證、明確基因功能最直接的手段，而構(gòu)建甜瓜高效不定芽再生體系是實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。

甜瓜不定芽再生體系受基因型、外植體類型、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度等因素的影響。不同基因型甜瓜的內(nèi)源激素水平存在差異，因而其再生能力也有所不同[3-4]。研究表明，不同基因型甜瓜間再生率差異顯著，且薄皮甜瓜再生率要高于厚皮甜瓜[5-10]。選擇不定芽誘導(dǎo)能力較高的外植體類型，是建立再生體系的關(guān)鍵。而不同類型的外植體，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和種類存在一定差異，未分化的分生組織及分化程度較低的薄壁組織細(xì)胞更適于誘導(dǎo)再生[11-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜的各個(gè)部位均可用于組織再生獲得完整植株，其中子葉、下胚軸使用較多[5，13-17]。另外，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度是影響外植體分化的重要因素，常用于甜瓜再生的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。在不定芽誘導(dǎo)階段，一般均需添加6-BA，添加質(zhì)量濃度一般在0.5～2.0 mg·L-1，添加少量的IAA 或ABA能夠更好地平衡內(nèi)源激素水平，提高不定芽再生率[17-20]。不添加植物生長調(diào)節(jié)劑也可以實(shí)現(xiàn)不定芽的伸長和生根，再生率約為70%[21-22]，而添加少量的植物生長調(diào)節(jié)劑能夠促進(jìn)不定芽伸長和生根，并且縮短再生時(shí)間。添加低質(zhì)量濃度的6-BA（0.05～0.5 mg·L-1）能夠促進(jìn)不定芽伸長且降低玻璃化程度，再生苗狀態(tài)較好，再生率為80%左右[3，18-19，23-24]。以1/2 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加少量IAA 或IBA（0.2～0.5 mg·L-1最佳），能夠促進(jìn)不定芽生根[16-20，25-26]。

盡管甜瓜再生體系構(gòu)建已有不少報(bào)道，但在甜瓜離體再生過程中仍存在愈傷組織分化出芽困難、不定芽誘導(dǎo)率低和再生體系重復(fù)性差等問題。筆者以8 個(gè)甜瓜基因型為試驗(yàn)材料，通過對甜瓜基因型，外植體類型，不定芽誘導(dǎo)、伸長及不定根誘導(dǎo)過程中植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行探究，以期篩選出再生能力強(qiáng)、不定芽再生率高的甜瓜基因型并建立重復(fù)性高的甜瓜不定芽再生體系，為甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供一定科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及地點(diǎn)

試驗(yàn)材料共8 份不同的甜瓜種質(zhì)，包括3 個(gè)厚皮甜瓜材料：B8（紅心脆，原新疆地方品種）、P110（Vedrantais，原法國材料）、905（引自西甜瓜中期庫，原美國品種PMR45）；5 個(gè)薄皮甜瓜材料：IVF05（引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所）、E5（甜寶，原日本材料）、E55（牛角蜜，原地方品種）、E79（白沙蜜，原地方品種）、974（黃皮梨瓜，原地方品種）。材料均經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所甜瓜遺傳育種課題組連續(xù)多代自交純化。

試驗(yàn)于2021 年9 月至2022 年3 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 挑選狀態(tài)健康的甜瓜種子，加適量常溫?zé)o菌水浸泡30 min 后剝?nèi)ネ夥N皮，移至超凈工作臺(tái)后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用2%的次氯酸鈉浸泡15 min（其間不斷搖晃），無菌水沖洗4～5 次，播種于1/2 MS 培養(yǎng)基上，在正常光周期條件（25 ℃，光照16 h·d-1，黑暗8 h·d-1，光照度3000 lx）下培養(yǎng)3 d，至子葉由黃轉(zhuǎn)綠時(shí)獲得無菌苗。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng) 選擇上述8 個(gè)基因型的甜瓜材料分別獲取無菌苗，將無菌苗子葉沿腹縫線遠(yuǎn)胚軸端劃開（圖1），開口深度為0.5 cm 左右，接種于添加不同質(zhì)量濃度的6-BA 和ABA（設(shè)置10 個(gè)組合，具體處理見表1）的MS 培養(yǎng)基上，在正常光周期條件下培養(yǎng)，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，觀察不定芽誘導(dǎo)情況。每個(gè)處理3 個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10 個(gè)外植體，14 d 繼代1 次，28 d 后統(tǒng)計(jì)出芽情況，計(jì)算不定芽出芽率。根據(jù)不定芽出芽率，篩選再生能力最佳的基因型及不定芽誘導(dǎo)階段最適培養(yǎng)基。

圖1 外植體處理示意圖Fig.1 Diagram map of cotyledon treatment

不定芽出芽率/%=出芽外植體個(gè)數(shù)/接種外植體個(gè)數(shù)×100。

1.2.3 外植體類型的篩選 選擇再生能力最佳基因型材料和最適培養(yǎng)基，設(shè)置子葉近胚軸端、子葉遠(yuǎn)胚軸端和胚軸3 種外植體（圖2），對其不定芽誘導(dǎo)能力進(jìn)行探究。在無菌環(huán)境下去除無菌苗生長點(diǎn)、根系及大部分胚軸，保留子葉和2 cm 左右胚軸，同時(shí)將子葉垂直葉脈切割，分成近胚軸端和遠(yuǎn)胚軸端兩部分。將不同類型的外植體接種于最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。每個(gè)外植體類型3 個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10 個(gè)外植體，14 d 繼代1 次，28 d 后觀察不定芽誘導(dǎo)情況，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率，篩選最佳外植體類型。

圖2 外植體類型示意圖Fig.2 Diagram map of cotyledon types

1.2.4 不定芽伸長 不定芽誘導(dǎo)28 d 后，將生長狀態(tài)較好的不定芽叢切下，轉(zhuǎn)移至MS 伸長培養(yǎng)基上，在正常光周期條件下培養(yǎng)，設(shè)置添加6-BA 質(zhì)量濃度梯度0.1（處理A）、0.2（處理B）、0.5（處理C）、1.0 mg·L-1（處理D）4 個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10 個(gè)不定芽。21 d 后觀察不定芽叢伸長情況，確定不定芽伸長最適培養(yǎng)基。

1.2.5 不定根誘導(dǎo) 不定芽伸長至2～3 cm、具有3～4片真葉時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至1/2 MS 生根培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根誘導(dǎo)。設(shè)添加IBA 質(zhì)量濃度梯度0.0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1等5 個(gè)處理（A～E），每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 個(gè)不定芽。培養(yǎng)14 d 后觀察生根情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2016 和SPSS Statistics 26 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型及植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度配比對甜瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

基因型和植物生長調(diào)節(jié)劑直接影響不定芽誘導(dǎo)率，試驗(yàn)以8 個(gè)基因型甜瓜為研究對象，對10 個(gè)不同組合的培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，28 d 后統(tǒng)計(jì)出芽率（表1）。結(jié)果表明，4 個(gè)薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）的平均出芽率分別為23.3%、20.7%、31.0%、35.3%，顯著低于厚皮基因型甜瓜B8、P110和薄皮基因型甜瓜IVF05，其中除E79 在處理5 的出芽率為80.0%、974 在處理3 的出芽率為83.3%外，4 個(gè)薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）在其他處理?xiàng)l件下的出芽率均低于60.0%，表明4 個(gè)薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）的再生能力較弱。905 只有在處理6、7 和處理10 條件下出芽率高于60.0%，且其平均出芽率低于50.0%，表明905 的再生能力也較弱。而B8、P110 和IVF05 的平均出芽率均在55.0%以上，再生能力較強(qiáng)，其中B8 誘導(dǎo)再生獲得的不定芽叢長勢好，單芽多，再生苗狀態(tài)較好，是更合適的再生材料。

處理1 和處理2 只添加了6-BA，其平均出芽率顯著低于其他另外添加了ABA 的處理，表明添加一定量的ABA 能促進(jìn)甜瓜不定芽誘導(dǎo)。處理3和處理9 的平均出芽率均為53.8%，高于其他處理，且B8、P110 和IVF05 均可在處理9 下獲得最高出芽率，分別為96.7%、86.7%和93.3%，因此選擇處理9 培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA）為不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

2.2 不同外植體類型對甜瓜不定芽再生的影響

與先誘導(dǎo)愈傷組織再誘導(dǎo)不定芽的間接再生相比，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的直接再生方式可以縮短轉(zhuǎn)化進(jìn)程，因此，外植體應(yīng)選擇產(chǎn)生不定芽數(shù)量多的類型。以B8 為研究對象，MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA 為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，觀察3種外植體的再生能力，28 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽出芽率。結(jié)果如表2 所示，胚軸做外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，誘導(dǎo)出芽率極低，是不適合的外植體類型。以子葉近胚軸端做外植體，出芽率為93.3%，顯著高于其他2 種外植體，且產(chǎn)生愈傷組織較少，因此，子葉近胚軸端是最適合用于不定芽再生的外植體類型。

表2 不同外植體類型對B8 不定芽再生的影響Table 2 Effect of different explant types on adventitious bud regeneration in B8

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽伸長的影響

以B8 為研究對象，設(shè)置4 個(gè)不同質(zhì)量濃度6-BA 處理（A～D），在不定芽誘導(dǎo)21 d 后觀察不定芽伸長情況（圖3），并統(tǒng)計(jì)單芽數(shù)量（表3）。結(jié)果表明，添加不同質(zhì)量濃度的6-BA，叢生芽均可得到伸長，各處理間不定芽伸長量沒有明顯差異，但隨著6-BA 質(zhì)量濃度逐漸升高，發(fā)現(xiàn)獲得的單芽數(shù)量逐漸減少，當(dāng)6-BA 添加質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，獲得的伸長單芽數(shù)為16.3，顯著高于其他處理。在不定芽伸長量正常的基礎(chǔ)上，單芽數(shù)量越多，越有利于切割出更多的無菌苗用于后期生根。因此，B8材料不定芽伸長階段最適培養(yǎng)基配比為MS+0.1 mg·L-16-BA。

表3 不同質(zhì)量濃度6-BA 處理對B8 不定芽伸長的影響Table 3 Effect of different concentrations on adventitious bud extensions in B8

圖3 不同濃度6-BA 對B8 不定芽伸長的影響Fig.3 Effects of different concentrations of 6-BA on the extension of adventitious buds in B8

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定根誘導(dǎo)的影響

以B8 為研究對象，設(shè)置5 個(gè)不同質(zhì)量濃度IBA 處理（A～E），在不定根誘導(dǎo)14 d 后觀察不定根誘導(dǎo)情況（圖4），并統(tǒng)計(jì)生根率和平均主根數(shù)（表4）。結(jié)果表明，不同的處理?xiàng)l件下再生苗生根率均較高（均在85.0%以上），但誘導(dǎo)產(chǎn)生的根系形態(tài)及數(shù)量有明顯差異。處理A 產(chǎn)生根系數(shù)量不穩(wěn)定，大多數(shù)根系僅含有一條主根，側(cè)根較多。處理B 和處理C 的主根數(shù)量有一定的增加，但發(fā)育較好、側(cè)根發(fā)達(dá)的主根數(shù)量相對較少。處理D 平均主根數(shù)量為3.1，顯著高于其他處理，且根系發(fā)育好、側(cè)根發(fā)達(dá)，是最佳的生根處理。處理E 不定根生長受到抑制，平均主根數(shù)僅為0.9。綜上，IBA 的適量添加可以促進(jìn)不定根的產(chǎn)生，但質(zhì)量濃度過高（1.0 mg·L-1）會(huì)抑制生根，當(dāng)添加質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，促進(jìn)生根效果最好，1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA 是較合適的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表4 不同質(zhì)量濃度IBA 處理對B8 不定根誘導(dǎo)的影響Table 4 Effect of different concentrations in the rooting of adventitious buds in B8

圖4 不同質(zhì)量濃度IBA 對B8 不定根誘導(dǎo)的影響Fig 4 Effect of different concentrations of IBA on the rooting of adventitious buds in B8

3 討論與結(jié)論

穩(wěn)定且高效的再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化成功實(shí)現(xiàn)的前提。植物再生分為通過誘導(dǎo)愈傷組織的間接再生和通過誘導(dǎo)不定芽的直接再生，甜瓜中主要采用直接誘導(dǎo)再生的方式。甜瓜不定芽再生體系受基因型、外植體類型、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度等因素的影響。筆者研究發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)厚皮甜瓜材料（B8、P110）和1 個(gè)薄皮甜瓜材料（IVF05）不定芽誘導(dǎo)能力均較強(qiáng)，平均出芽率顯著高于其他4 個(gè)薄皮甜瓜基因型材料（E5、E55、E79、974），這與前人得出的薄皮甜瓜再生率高于厚皮甜瓜的結(jié)論不同[7-10，12]。筆者認(rèn)為，這與試驗(yàn)中所選材料不同有關(guān)，對于甜瓜厚皮材料與薄皮材料的再生能力的強(qiáng)弱并沒有定論。

在誘導(dǎo)外植體直接再生的過程中添加適量的植物生長調(diào)節(jié)劑可以提高外植體出芽率，同時(shí)提高不定芽的伸長速度和新生苗生根率，從而縮短再生周期。不定芽誘導(dǎo)階段一般會(huì)添加6-BA，同時(shí)添加少量的IAA、ABA 能獲得更好的效果，不定芽誘導(dǎo)率在70%～90%[3，18，24，27-28]。筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，對于8 個(gè)不同基因型材料，出芽率最高的培養(yǎng)基均添加了少量的ABA，表明在不定芽誘導(dǎo)過程中，添加適量的ABA 能夠促進(jìn)不定芽誘導(dǎo)，這與前人研究結(jié)果一致[18，29]，但是對于不同基因型材料，出芽率最高的培養(yǎng)基添加ABA 的質(zhì)量濃度不同，表明在進(jìn)行甜瓜再生時(shí)，針對不同基因型，應(yīng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，篩選最適合的植物生長調(diào)節(jié)劑種類與質(zhì)量濃度。B8 材料在MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA 培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，其誘導(dǎo)率高達(dá)96.7%，高于前人研究中其他基因型材料的不定芽誘導(dǎo)率。添加少量的植物生長調(diào)節(jié)劑可以有效促進(jìn)再生芽的伸長，而筆者研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度6-BA 處理不定芽伸長量并沒有明顯差異，這與Zhang 等[30]的研究結(jié)論一致，但0.1 mg·L-16-BA 處理產(chǎn)生的單芽數(shù)量顯著高于其他3 個(gè)處理。

甜瓜的子葉、下胚軸均能進(jìn)行脫分化，再生獲得完整植株。在含有STM基因（莖尖分生組織）的干細(xì)胞中，分生組織的誘導(dǎo)率更高，生長更快，而子葉中STM基因主要分布在子葉近胚軸端U 型切口的深層細(xì)胞中，因此更適于用作再生。筆者在對B8 材料外植體類型的研究中發(fā)現(xiàn)，胚軸不定芽誘導(dǎo)率極低，產(chǎn)生大量愈傷組織，而靠近胚軸端的子葉卻有著極高的不定芽誘導(dǎo)率，這與前人研究結(jié)果一致[28，31]。

綜上所述，筆者通過對甜瓜再生過程中基因型、外植體類型、植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行研究，篩選出再生能力較強(qiáng)的厚皮甜瓜材料B8，并以其為基礎(chǔ)建立了一個(gè)穩(wěn)定高效的甜瓜再生體系，其中再生過程中最佳外植體類型為子葉近胚軸端，不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA，不定芽伸長最佳培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-16-BA，不定根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA。