寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 群落變化規(guī)律*

王佳瑋，呂 燕，劉建利，孫欽飛，侯露露，劉 濤，王麗霞

（1 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，國家民委黃河流域農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）（2 西鄂爾多斯國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局）

寧夏枸杞（Lyciumbarbarum）是茄科枸杞屬藥用植物，也是寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古、新疆和青海等地重要的經(jīng)濟(jì)林果樹種[1]。根腐病是枸杞的“癌癥”，由尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）[2-4]、腐皮鐮刀菌（F.solani）[2,4]、串珠鐮孢菌（F.moniliforme）[3]、銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）[3]、三線鐮刀菌（F.tricinctum）[4]、厚垣鐮孢菌（F.chlamydosporum）[4]、鏈格孢菌（Alternariaalternate）[4]、黃色鐮刀菌（F.culmorum）[5]、木賊鐮刀菌（F.equiseti）[5]造成，主要危害3 年齡以上的枸杞植株，造成植株死亡，發(fā)病率高達(dá)72.4%[2]。近年來，越來越多的研究表明植物根部病害的發(fā)生和土壤微生態(tài)密切相關(guān)[6-8]，賈晨波等[9]報(bào)道，寧夏枸杞根腐病的發(fā)生也與土壤細(xì)菌、真菌多樣性及其物種組成的變化有密切關(guān)系。

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一種在土壤中廣泛存在，可以與90%以上陸生植物根部形成共生關(guān)系的一種有益真菌，AMF與植物共生后能提高宿主對(duì)病蟲害的抗性[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞根腐病植株根區(qū)土壤AMF 群落組成與健康植株具有顯著差異[13]。但在寧夏枸杞根腐病的發(fā)病過程中，植株根區(qū)土壤AMF群落的詳細(xì)變化規(guī)律仍需進(jìn)一步深入研究。因此，本研究以寧夏枸杞根腐病植株不同發(fā)病時(shí)期的根區(qū)土壤為研究材料，分析在不同發(fā)病時(shí)期植株根區(qū)土壤AMF 變化規(guī)律，為后續(xù)開展應(yīng)用AMF 防控根腐病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019 年8 月，在寧夏銀川西夏區(qū)蘆花臺(tái)農(nóng)戶自種枸杞園（東經(jīng)106°9′，北緯38°39′）采集樣品，根據(jù)表1 標(biāo)準(zhǔn)劃分4 個(gè)寧夏枸杞根腐病發(fā)病時(shí)期。先清除植株周圍地表的凋落物，在植株周圍取直徑1 cm 根系，抖落收集根系上散落的土為根區(qū)土。3株植株土壤混合為1 個(gè)樣品，每個(gè)樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)時(shí)期采集3 個(gè)樣品，共采集12 個(gè)土壤樣品。將土壤樣品和根系裝入無菌自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣品過2 mm 篩，部分陰干，保存于4 ℃冰箱中用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定和AMF 分離鑒定；根系樣品保存于4 ℃冰箱中用于AMF 侵染率的測(cè)定。

表1 寧夏枸杞根腐病發(fā)病時(shí)期劃分標(biāo)準(zhǔn)[4]

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 AMF 分離鑒定

采用濕篩傾析-蔗糖離心法[13]分離AMF 孢子，觀察記錄孢子大小、形態(tài)、顏色、表面紋飾、孢壁結(jié)構(gòu)、連孢菌絲和內(nèi)含物等特征，根據(jù)國際AMF保藏中心（INVAM）在http://invam.wvu.edu/和http://www.amf-phylogeny.com/上提供的最新分類描述及圖片進(jìn)行種屬鑒定。

1.2.2 AMF 多樣性測(cè)定

參照呂燕等[13]和劉海躍等[14]的方法對(duì)AMF 孢子密度、多度、相對(duì)多度及物種多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。孢子密度（spore density，SD）＝10 g 土樣中孢子數(shù)量；多度（relative abundance，RA）＝（AMF 某個(gè)屬或某個(gè)種的孢子數(shù)/樣品中AMF 總孢子數(shù)）×100%；分離頻度（frequency，F(xiàn)）＝（AMF 某個(gè)屬或某個(gè)種出現(xiàn)次數(shù)/樣品數(shù)）×100%；重要值（important value，IV），樣品中AMF 某個(gè)屬或某個(gè)種分離頻度與多度之和的平均值，即IV＝（F＋RA）/2；根據(jù)重要值將AMF 優(yōu)勢(shì)度劃分為4 個(gè)等級(jí)，即IV＞60%為優(yōu)勢(shì)屬（種），40%＜IV≤60%為亞優(yōu)勢(shì)屬（種），20%＜IV≤40%為伴生屬（種），IV≤20%為偶見屬（種）。

香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)計(jì)算公式如下：

式中S 為某樣品AMF 種類數(shù)，Pi為種i 所占比率。

辛普森指數(shù)計(jì)算公式如下：

式中S 為某樣品AMF 種類數(shù)，Ni為種i 的個(gè)體數(shù)，N為全部物種的個(gè)體數(shù)。

1.2.3 AMF 定殖率測(cè)定

依據(jù)呂燕等[13]和Phillings 等[15]的方法，觀察并計(jì)算AMF 定殖率，計(jì)算公式如下：

定殖率（%）＝（有AMF 侵染的根段長度/根段總長度）×100

1.2.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

pH 值采用電位法測(cè)定，有機(jī)質(zhì)（OM）含量采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，全氮（TN）含量采用凱氏定氮法測(cè)定，全磷（TP）含量采用酸溶-鉬銻抗比色法測(cè)定，全鉀（TK）含量采用氫氟酸高氯酸消煮法測(cè)定，銨態(tài)氮（NH4+-N）含量采用苯酚-次氯酸鹽法測(cè)定，硝態(tài)氮（NO3--N）含量采用紫外分光光度法測(cè)定[16]，速效磷（AP）含量采用鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀（AK）含量采用醋酸銨-火焰光度計(jì)法測(cè)定，易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量（Easily extractable glomalin related soil protein，EEGRSP）和總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量（Total glomalin related soil protein，TGRSP）采用Braford 法測(cè)定[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用美吉生信云平臺(tái)工具（https://cloud.majorbio.com/）進(jìn)行組間差異分析和PCoA 分析；運(yùn)用R 語言（R×64 3.5.1）“vegan”包進(jìn)行PERMANOVA 分析；運(yùn)用微生太生科云平臺(tái)（https://www.bioincloud.tech/#/）對(duì)AMF 與土壤因子進(jìn)行RDA 分析和環(huán)境因子相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤理化性質(zhì)

寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤全氮、全鉀、速效鉀含量均存在顯著性差異，而pH 值和有機(jī)質(zhì)、全磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷含量均無顯著性差異（表2）。土壤全氮含量隨著寧夏枸杞根腐病發(fā)病程度的加重呈增加趨勢(shì)，發(fā)病后期最高，為2.19 g/kg，分別為未發(fā)?。?.73 g/kg）、發(fā)病前期（1.61 g/kg）的1.27、1.36 倍；而土壤全鉀、速效鉀含量均隨著寧夏枸杞根腐病發(fā)病程度的加重呈降低趨勢(shì)，發(fā)病后期土壤全鉀含量（1.99 g/kg）比未發(fā)?。?.29 g/kg）和發(fā)病前期（4.46 g/kg）分別降低了53.61%和55.38%，發(fā)病后期土壤速效鉀含量（104.39 mg/kg）比未發(fā)?。?98.83 mg/kg）和發(fā)病前期（210.41 mg/kg）均降低了約50%。因此，根區(qū)土壤全氮含量增高和全鉀、速效鉀含量降低可能與寧夏枸杞根腐病的發(fā)生有關(guān)。

表2 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤理化性質(zhì)

2.2 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF孢子密度、定殖率和球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量

寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF孢子密度、定殖率、EEGRSP 含量、TGRSP 含量在土壤中均有顯著差異（表3）。AMF 孢子密度隨著寧夏枸杞根腐病發(fā)病程度的加重呈先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)病前期（14.50 個(gè)/g）和發(fā)病中期（12.83個(gè)/g）較高，比未發(fā)?。?.77 個(gè)/g）和發(fā)病后期（9.70個(gè)/g）增加了31.32%～49.48%。AMF 定殖率、EEGRSP 含量、TGRSP 含量均隨著寧夏枸杞根腐病發(fā)病程度的加重呈增高趨勢(shì)，發(fā)病中期AMF 定殖率（21.10%）分別是未發(fā)?。?.50%）和發(fā)病前期（7.72%）的8.44、2.73 倍；發(fā)病中期EEGRSP 含量（39.62 mg/g）分別是未發(fā)?。?0.73 mg/g）和發(fā)病前期（33.49 mg/g）的1.29、1.18 倍；發(fā)病后期TGRSP 含量（72.65 mg/g）分別是未發(fā)?。?6.63 mg/g）和發(fā)病前期（63.94 mg/g）的1.10 倍左右。因此，枸杞根腐病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致根區(qū)土壤AMF 孢子密度、定殖率、EEGRSP 含量、TGRSP 含量的變化，AMF孢子密度先增加后降低，在發(fā)病前期和中期顯著增加，在發(fā)病后期又降低至和未發(fā)病時(shí)無顯著差異；AMF 定殖率、EEGRSP 含量均在發(fā)病中期達(dá)到最高值，發(fā)病后期維持相對(duì)恒定，而TGRSP 含量在發(fā)病后期達(dá)到最高值。

2.3 AMF 孢子形態(tài)

在4 組樣品中共分離6 屬16 種，包括無梗囊霉屬（Acaulospora）4 種：蜜色無梗囊霉（A.mellea）、皺壁無梗囊霉（A.rugosa）、細(xì)凹無梗囊霉（A.scrobiculata）、孢果無梗囊霉（A.sporocarpia）（圖版1-1～4）；傘房球囊霉屬（Corymbiglomus）1 種：簇孢傘房球囊霉（C.corymbiforme）（圖版1-5）；多樣孢囊霉屬（Diversispora）1 種：橙黃多樣孢囊霉（D.aurantia）（圖版1-6）；球囊霉屬（Glomus）6 種：雙網(wǎng)球囊霉（G.bireticulata）、寬柄球囊霉（G.magnicaule）、黑球囊霉（G.melanosporum）、多梗球囊霉（G.multicaule）、網(wǎng)狀球囊霉（G.reticulatum）、地表球囊霉（G.versiforme）（圖版1-7～12）；根孢囊霉屬（Rhizophagus）1 種：明根孢囊霉（R.clarus）（圖版1-13）；隔球囊霉屬（Septoglomus）3 種：縮隔球囊霉（S.constrictum）、沙荒隔球囊霉（S.deserticola）、黏質(zhì)隔球囊霉（S.viscosum）（圖版1-14～16）。

2.4 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF群落組成

寧夏枸杞根區(qū)土壤中AMF 群落優(yōu)勢(shì)屬在根腐病不同發(fā)病時(shí)期有所差異。未發(fā)病和發(fā)病中期優(yōu)勢(shì)屬均為球囊霉屬，多度分別為49.0%和34.9%，發(fā)病前期和發(fā)病后期優(yōu)勢(shì)屬均為隔球囊霉屬，多度分別為34.5%和33.5%（圖1-A）。單因素方差分析顯示（圖1-B），隔球囊霉屬、根孢囊霉屬、球囊霉屬和無梗囊霉屬在不同發(fā)病時(shí)期多度均差異顯著（P＜0.05），所有發(fā)病時(shí)期球囊霉屬和無梗囊霉屬均比未發(fā)病時(shí)低；隔球囊霉屬剛好相反，所有發(fā)病時(shí)期均高于未發(fā)病時(shí)；根孢囊霉屬則先增高后降低。因此，根腐病發(fā)病時(shí)期改變了寧夏枸杞根區(qū)土壤中AMF 群落組成，其中隔球囊霉屬、根孢囊霉屬、球囊霉屬和無梗囊霉屬在寧夏枸杞不同發(fā)病時(shí)期多度存在顯著差異，但多度變化規(guī)律不盡相同。

圖1 屬水平寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 群落組成

根腐病發(fā)病時(shí)期改變了寧夏枸杞根區(qū)土壤中AMF 群落優(yōu)勢(shì)種，未發(fā)病為蜜色無梗囊霉，發(fā)病前期和發(fā)病中期為明根孢囊霉，發(fā)病后期為縮隔球囊霉（表4）。蜜色無梗囊霉、寬柄球囊霉、黑球囊霉、地表球囊霉、明根孢囊霉、縮隔球囊霉等6 個(gè)種在所有的時(shí)期都發(fā)現(xiàn)，且重要值較高（表4），單因素方差分析顯示（圖2），5 個(gè)種在不同發(fā)病時(shí)期多度差異顯著（P＜0.05），黑球囊霉、寬柄球囊霉和蜜色無梗囊霉所有發(fā)病時(shí)期重要值均比未發(fā)病時(shí)降低；縮隔球囊霉剛好相反，所有發(fā)病時(shí)期均高于未發(fā)病；地表球囊霉和明根孢囊霉則是先增高后降低。而簇孢傘房球囊霉和雙網(wǎng)球囊霉只在發(fā)病時(shí)期出現(xiàn)；孢果無梗囊霉、多梗球囊霉和網(wǎng)狀球囊霉進(jìn)入發(fā)病期后逐漸消失（表4）。

圖2 種水平寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF差異物種

表4 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 種重要值 %

2.5 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF群落α-多樣性

寧夏枸杞根區(qū)土壤中AMF 群落α-多樣性指數(shù)隨著根腐病發(fā)病時(shí)期不同有所差異，物種多度、香農(nóng)-威納指數(shù)和辛普森指數(shù)均以發(fā)病前期最高，而其他時(shí)期之間差異均不顯著（表5）。因此，根腐病發(fā)生導(dǎo)致寧夏枸杞根區(qū)土壤中AMF 群落α-多樣性指數(shù)先升高后下降，以發(fā)病前期最高。

表5 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 群落α-多樣性

2.6 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF群落β-多樣性

基于Bray_Curtis 距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）4個(gè)發(fā)病時(shí)期寧夏枸杞根區(qū)土壤AMF 群落β-多樣性結(jié)果顯示，4 個(gè)發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 群落組成存在差異（R2＝0.893，P＝0.001），發(fā)病時(shí)期對(duì)AMF群落差異解釋度為50.47%（圖3）。

圖3 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 群落PCoA 圖

2.7 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF群落與土壤理化因子RDA 分析

對(duì)土壤理化因子各項(xiàng)指標(biāo)與不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 群落進(jìn)行冗余分析（RDA），速效鉀和全鉀含量是影響不同發(fā)病時(shí)期寧夏枸杞根區(qū)土壤AMF 群落的主要因子，2 個(gè)排序軸（RDA1 和RDA2）對(duì)物種變量的解釋量分別為34.46%和29.25%，累計(jì)解釋量為63.71%。速效鉀含量和全鉀含量促進(jìn)未發(fā)病、發(fā)病前期AMF 群落建成，而抑制發(fā)病中期、發(fā)病后期AMF 群落建成（圖4）。

圖4 寧夏枸杞根腐病不同發(fā)病時(shí)期根區(qū)土壤AMF 群落與土壤理化因子RDA 分析圖

3 討論

研究表明，植物病害的發(fā)生和相關(guān)微生物群落的失調(diào)密切相關(guān)[18]，植物病害的發(fā)生也會(huì)引起相關(guān)微生物群落發(fā)生變化，也會(huì)對(duì)根系A(chǔ)MF 群落組成產(chǎn)生影響。玉米紋枯病[19]、三七根腐病[20]、星油藤根腐病[21]、生姜姜瘟病[22]、紐荷爾臍橙根腐病[23]等研究表明，病害發(fā)生造成AMF 侵染率、根際土壤孢子密度降低。而本研究表明，AMF 定殖率隨著寧夏枸杞根腐病的發(fā)生而增高，在發(fā)病中期達(dá)到最高值，分別是未發(fā)病、發(fā)病前期的8.44、2.73 倍，發(fā)病后期維持相對(duì)恒定；孢子密度在發(fā)病前期和中期顯著增加，比未發(fā)病和發(fā)病后期增加了31.32%～49.48%，且發(fā)病后期降低至和未發(fā)病無差異。這一結(jié)果與前人的研究不同，可能是因?yàn)椴煌牟『︻愋秃筒煌耐寥蕾|(zhì)地、宿主類型會(huì)引起AMF 的不同應(yīng)答，寧夏枸杞種植園土壤偏鹽堿[1]，而與本試驗(yàn)結(jié)果不一致的病害大多是南方酸性土壤發(fā)生的病害；另外，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞根腐病在3 年齡以上的植株才開始發(fā)病[2-5]，病原菌在土壤里的潛伏周期較長，侵染過程較慢，發(fā)病時(shí)間相對(duì)來說較長，因此，宿主植物有充足的時(shí)間招募包括AMF 在內(nèi)的土壤益生微生物來抵御病原菌侵染[24]，從而致使AMF 孢子密度和侵染率都較未發(fā)病時(shí)增加。

球囊霉素相關(guān)土壤蛋白（Glomalin related soil protein，GRSP）是由AMF 產(chǎn)生的具有良好熱穩(wěn)性的特殊糖蛋白，能夠促進(jìn)土壤團(tuán)聚體形成，保持團(tuán)聚體穩(wěn)定性，增加土壤有機(jī)碳庫，提高植物抗逆能力[25]。關(guān)于植物病害的發(fā)生對(duì)AMF 釋放代謝物GRSP 的研究較少。程申等[23]研究結(jié)果表明，根腐病的發(fā)生可降低GRSP 含量，尤其是總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白（TGRSP）含量。本研究結(jié)果表明，寧夏枸杞根區(qū)土壤中易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白（EEGRSP）和總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白（TGRSP）含量均隨著根腐病的發(fā)生而增高，EEGRSP 含量在發(fā)病中期達(dá)到最高值，TGRSP 含量在發(fā)病后期達(dá)到最高值，總體在發(fā)病后期維持相對(duì)恒定。有研究表明，土傳病害的發(fā)生和不同土壤質(zhì)地有關(guān)[26]，可能是AMF 通過產(chǎn)生GRSP，改善土壤質(zhì)地，增加通透性，從而改變整個(gè)土壤微環(huán)境，抑制病原菌繁殖。

AMF 是土壤微生物中重要的類群，土著AMF長期存在于土壤中，已適應(yīng)土壤的生態(tài)條件且具備良好的生存優(yōu)勢(shì)，病原入侵前植物與AMF 建立共生體可提前誘導(dǎo)寄主建立抗病防御體系，有助于預(yù)防土傳病害的發(fā)生[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，所有根腐病發(fā)病時(shí)期寧夏枸杞根區(qū)土壤中球囊霉屬和無梗囊霉屬多度均比未發(fā)病時(shí)降低；隔球囊霉屬剛好相反，所有發(fā)病時(shí)期多度均高于未發(fā)病時(shí)；根孢囊霉屬則是先增高后降低。在未發(fā)病時(shí)，土壤中含量較高的球囊霉屬和無梗囊霉屬，可能作為后續(xù)開發(fā)防控枸杞根腐病的AMF 菌劑候選菌。其他植物病害防控研究也有報(bào)道，球囊霉屬和無梗囊霉屬AMF 具有很好的生防潛力[11-12]。

土壤是土壤微生物依存的基質(zhì)，土壤理化性質(zhì)會(huì)影響包括土傳病害在內(nèi)的所有微生物種群增長及群落構(gòu)建[28]。北蒼術(shù)根腐病[29]、石柱黃連根腐病[30]、香蕉枯萎病[31]、辣椒疫病[32]等研究發(fā)現(xiàn)，罹病植株土壤理化性質(zhì)與健康植株有顯著差異，但差異規(guī)律在各個(gè)病害上并不完全一致?？赡芤蜓芯繕拥赝寥?、栽培農(nóng)藝措施（尤其施肥量）、病原菌種類、宿主植物及其參與物質(zhì)循環(huán)的根區(qū)微生物群落不同而結(jié)果不同。本研究發(fā)現(xiàn)，根腐病發(fā)生與寧夏枸杞根區(qū)土壤中全氮、全鉀、速效鉀含量有關(guān)，土壤全氮含量增高和全鉀、速效鉀含量降低，有可能促進(jìn)寧夏枸杞根腐病的發(fā)生。氮元素過多容易造成植物生長過快，莖稈細(xì)弱，纖維素、木質(zhì)素減少，組織柔嫩，體內(nèi)可溶性非蛋白態(tài)氮含量過高也容易造成土壤酸化、土壤板結(jié)硬化、透氣性差，致使土壤微生物由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變，容易遭受病蟲害感染；而鉀元素能使植株的葉片和枝干更加強(qiáng)壯，提高植株抗病、抗寒、抗旱、抗倒伏、抗鹽能力[33]。因此，在寧夏枸杞種植過程中降氮增鉀有利于防控根腐病。

4 結(jié)論

（1）根腐病發(fā)生顯著影響寧夏枸杞根區(qū)土壤AMF 定殖率、孢子密度、群落組成、多樣性、球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量，但變化規(guī)律不一致。

（2）在寧夏枸杞根區(qū)土壤降氮增鉀，接種球囊霉屬和無梗囊霉屬AMF 可能防控根腐病的發(fā)生。