基于廣泛靶向代謝組學(xué)的2 種百香果風(fēng)味差異研究*

袁啟鳳，顏培玲，史斌斌，陳 楠，王立娟，盧 晨，李仕品

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006）

百香果學(xué)名西番蓮（PassifloraedulisSims.）[1]，目前主要在貴州省低海拔、熱量豐富的縣區(qū)發(fā)展，如羅甸、貞豐、從江、榕江等地區(qū)。百香果屬于“短、平、快”產(chǎn)業(yè)，作為“當(dāng)年種植當(dāng)年見效”的樹種，百香果也從零星種植發(fā)展到大面積種植，品種也從以紫果為主的品種發(fā)展為黃果等多品種共存的格局，逐步滿足了消費(fèi)者對不同風(fēng)味的需求。紫果類品種以臺農(nóng)一號為代表，黃果類品種以芭樂味黃金百香果為代表。除貴州省外，福建、廣西、云南、海南等省區(qū)市也是我國百香果的主產(chǎn)地[2-3]。但不同地區(qū)的百香果種植環(huán)境、種植模式有所不同，也可能導(dǎo)致同一品種在風(fēng)味上存在一定的差異。果實(shí)風(fēng)味不但關(guān)系到消費(fèi)者味覺的感受，而且還關(guān)系到果品本身的營養(yǎng)價(jià)值[4]。百香果富含蔗糖、黃酮、氨基酸、有機(jī)酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[5-6]，紫果類品種果實(shí)成熟時(shí)果皮呈現(xiàn)紫紅色，香氣濃郁，但口感酸，鮮食率低，黃果類品種果實(shí)成熟時(shí)果皮為金黃色，酸度低，糖度高，口感為純甜味，鮮食率高，但香味相比紫果類品種淡[7-8]。

廣泛靶向代謝組學(xué)分析是一種結(jié)合非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)優(yōu)點(diǎn)的新方法，利用基于多反應(yīng)監(jiān)測模式的QTRAP 質(zhì)譜法，可同時(shí)定量數(shù)百個(gè)已知代謝物和近千種未知代謝物，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、廣泛靶向代謝物的檢測和鑒定[9]。為探明貴州產(chǎn)區(qū)紫果類和黃果類百香果風(fēng)味上的差異，本文基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜廣泛靶向代謝組學(xué)的方法對2 種百香果內(nèi)含物質(zhì)的代謝物種類及相對含量進(jìn)行檢測，以期找出差異代謝物，并從差異代謝物角度揭示2 種百香果風(fēng)味差異的原因，為深入研究百香果風(fēng)味形成機(jī)理及定向育種提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紫果百香果（臺農(nóng)一號）和黃金百香果（芭樂味黃金百香果）。紫果百香果成熟時(shí)果皮為紫紅色，果形為橢圓形，口感酸甜，香氣濃郁；黃金百香果成熟時(shí)果皮為金黃色，果形為扁圓形至圓形，口感純甜，香味偏淡。2 個(gè)品種果實(shí)采集于貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣良田鎮(zhèn)壩草村貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所亞熱帶果樹示范基地，均在果實(shí)成熟期挑選大小、色澤、成熟度一致且無機(jī)械損傷的果實(shí)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜（UPLC，Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A）、串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP）、甲醇（色譜純，Merck）、乙腈（色譜純，Merck）、乙醇（色譜純，Merck）、標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，BioBioPha/Sigma-Aldrich）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本的采集及制備

以紫果百香果和黃金百香果果汁為試材，分為A、B 2 個(gè)組進(jìn)行代謝組分析，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。將樣品分別置于凍干機(jī)（Scientz-100F）中真空冷凍干燥，用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀，稱取100 mg 粉末溶解于0.6 mL 的70%甲醇提取液中，溶解后的樣品置于4 ℃冰箱中過夜，其間渦旋6 次以提高提取率，10 000 r/min 下離心10 min，取上清，微孔濾膜（0.22μm pore size）過濾樣品，保存于進(jìn)樣瓶中用于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS 數(shù)據(jù)采集條件

液相條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相中A為超純水（含0.04%乙酸），B 為乙腈（含0.04%乙酸）；洗脫梯度為0～10 min，5%～95%B，10～11 min，95%B，11.0～11.1 min，5%B，11.1～14.0 min，5%B；流速條件0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量4μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣（CUR）30 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（QQQ）中，根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）對每個(gè)離子對進(jìn)行掃描檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

混樣質(zhì)控樣本（QC）mix01、mix02、mix03 由A 組和B 組百香果混合而成，用于判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性。代謝物定性基于武漢邁維生物技術(shù)有限公司自建數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database）、代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫和二級譜信息完成。運(yùn)用Analyst 1.6.3 軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)代謝物保留時(shí)間與峰型信息，對每個(gè)代謝物在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，以確保定性定量的準(zhǔn)確。將代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）以觀察分組之間和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。根據(jù)獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影VIP 值和差異倍數(shù)值（Fold Change，F(xiàn)C）進(jìn)一步篩選差異代謝物。相對含量采用峰面積歸一法進(jìn)行計(jì)算，利用SPSS 22.0 軟件分析差異顯著性。將差異代謝物映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋，根據(jù)注釋結(jié)果按照KEGG 通路中的類型進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果廣泛靶向代謝組學(xué)分析

如表1 所示，紫果百香果和黃金百香果中共檢測到代謝產(chǎn)物11 類405 種，包括黃酮類103 種、酚酸類49 種、氨基酸及其衍生物66 種、核苷酸及其衍生物35 種、有機(jī)酸31 種、生物堿20 種、糖及醇類21 種、木脂素和香豆素11 種、脂質(zhì)48 種、維生素8 種、其他13 種；2 種百香果果實(shí)檢測到共有代謝物、差異顯著代謝物分別為366 種和263 種，共有代謝物黃酮類81 種、酚酸類43 種、氨基酸及其衍生物64 種、核苷酸及其衍生物35 種、有機(jī)酸29種、生物堿17 種、糖及醇類21 種、木脂素和香豆素10 種、脂質(zhì)47 種、維生素7 種、其他12 種。紫果百香果代謝產(chǎn)物有383 種，未檢測到的黃酮類主要是槲皮素、山奈酚、木犀草素、金合歡素、芹菜素、矢車菊素等11 種糖苷衍生物，酚酸類是異綠原酸B、3-（4-羥基苯基）丙酸、肉桂酸乙酯等3 種，氨基酸及其衍生物是N-（3-吲哚乙?；?L-丙氨酸1 種，有機(jī)酸是α-羥基異丁酸、3-羥基丁酸等2種，生物堿是N-芥子酰腐胺、N′-阿魏酰腐胺、N-阿魏酰基胍丁胺等3 種，脂質(zhì)是甘油亞油酸酯1 種，其他是Z-蒿本內(nèi)酯1 種；黃金百香果代謝產(chǎn)物有388 種，未檢測到的黃酮類主要是山奈酚、刺槐素、新奧司明、香葉木素、木犀草苷、香葉木苷、金圣草黃素、圣草次苷等11 種，酚酸類是香蘭素、1-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸等3 種，氨基酸及其衍生物是順式-4-羥基-D-脯氨酸1 種，木脂素和香豆素是東莨菪內(nèi)酯1 種，維生素是煙酸1 種。本次檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種百香果雖各自具有一些獨(dú)特的物質(zhì)，但主要還是集中體現(xiàn)在黃酮類和酚酸類物質(zhì)上。

表1 2 種百香果代謝產(chǎn)物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.2 主成分分析及聚類分析

將2 種百香果總共405 種代謝產(chǎn)物進(jìn)行主成分分析，第1 主成分解釋了總方差的62.54%，第2 主成分解釋了總方差的14.21%，其中3 個(gè)紫果百香果樣品、3 個(gè)黃金百香果樣品和3 個(gè)質(zhì)控樣品分別獨(dú)立聚在一起（圖版4-A-a）。利用歸一化方法UV（unit variance scaling）對代謝產(chǎn)物含量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用R 軟件分析并形成熱圖，聚類分析代謝物在不同樣本間的積累模式如圖版4-A-b，結(jié)果顯示，紫果百香果和黃金百香果代謝產(chǎn)物分別具有相似的積累趨勢。主成分分析和層次聚類分析均表明，紫果百香果和黃金百香果之間具有不同的代謝產(chǎn)物特征，這為后續(xù)分析差異代謝物提供了基礎(chǔ)。

2.3 差異代謝物的篩選與分析

基于OPLS-DA 結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影VIP 值（VIP≥1）和代謝物含量的差異倍數(shù)值（FC≥2、FC≤0.5），如圖版4-B 所示，2 種百香果篩選到的差異代謝物有163 種（上調(diào)80 種、下調(diào)83 種）。由表2 可知，紫果百香果和黃金百香果共篩選到11類163種差異代謝物，其中黃酮類72 種（上調(diào)31 種、下調(diào)41種）、酚酸類28 種（上調(diào)15 種、下調(diào)13 種）、氨基酸及其衍生物15 種（上調(diào)3 種、下調(diào)12 種）、核苷酸及其衍生物9 種（上調(diào)4 種、下調(diào)5 種）、有機(jī)酸9 種（上調(diào)7 種、下調(diào)2 種）、糖及醇類5種（上調(diào)4 種、下調(diào)1 種）、維生素3 種（上調(diào)2種、下調(diào)1 種）、脂質(zhì)6 種（上調(diào)5 種、下調(diào)1 種）、生物堿8 種（上調(diào)5 種、下調(diào)3 種）、木脂素和香豆素3 種（上調(diào)0 種、下調(diào)3 種）、其他5 種（上調(diào)4 種、下調(diào)1 種）。從數(shù)量上看，黃酮類和酚酸類都構(gòu)成了2 種百香果的主要差異代謝物，與紫果百香果相比，黃金百香果中下調(diào)物質(zhì)多于上調(diào)物質(zhì)。

表2 2 種百香果果實(shí)差異代謝物統(tǒng)計(jì)

將檢測到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析和定量分析，比較代謝產(chǎn)物定量信息在各分組中發(fā)生的差異倍數(shù)變化，將差異代謝物的差異倍數(shù)進(jìn)行l(wèi)og2 處理，即將FC 值進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)換之后，F(xiàn)C 值被劃分成正、負(fù)，可以直觀地通過正、負(fù)來判斷上調(diào)、下調(diào)，然后根據(jù)log2FC 絕對值的大小判斷差異強(qiáng)度。若FC原值不進(jìn)行轉(zhuǎn)換，則結(jié)果全是正值，無法直觀判斷上調(diào)還是下調(diào)。從表3 可以看出，與紫果百香果相比，黃金百香果變化程度（log2FC）排在前10 位的上調(diào)代謝物包括5 種酚酸類、3 種有機(jī)酸、1 種黃酮類和1 種生物堿，下調(diào)代謝物包括9 種黃酮類和1種酚酸類。從前10 位差異代謝物來看，黃酮類、酚酸類和有機(jī)酸構(gòu)成了2 種百香果的主要差異代謝物質(zhì)。

表3 2 種百香果差異倍數(shù)排在前10 位的代謝產(chǎn)物

差異倍數(shù)排在前10 位的上調(diào)代謝物包括了3種有機(jī)酸，這一現(xiàn)象與黃金百香果實(shí)際口感不一致，比較2 種百香果中糖、酸、氨基酸的差異情況（表4）可以發(fā)現(xiàn)，黃金百香果中除磷酸葡糖酸下調(diào)外，其余4 種糖均上調(diào)；而峰面積最大的L-高絲氨酸下調(diào)。雖然黃金百香果中上調(diào)有機(jī)酸種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于下調(diào)，但果實(shí)中酸甜風(fēng)味主要取決于糖和酸之間總量平衡關(guān)系。此外，呈味氨基酸在果實(shí)風(fēng)味中也發(fā)揮比較重要的作用，紫果百香果和黃金百香果中13種氨基酸相對含量差異顯著，紫果百香果中11 種氨基酸及其衍生物上調(diào)、2 種下調(diào)，其中苯丙氨酸、L-天冬氨酸2 種呈味氨基酸顯著高于黃金百香果。

表4 2 種百香果中主要的糖、酸和氨基酸代謝差異統(tǒng)計(jì)

2.4 差異代謝物KEGG 富集分析

將差異代謝物進(jìn)行KEGG 富集分析，其中代謝物富集較多且差異顯著的通路包括黃酮和黃酮醇類生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）、黃酮類生物合成（Flavonoid biosynthesis）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、哌啶和嘧啶生物堿合成（Tropane piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis）、煙酸和煙酰胺代謝（Nicotinate and nicotinamide metabolism）以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine，serine and threonine metabolism）等（圖版4-C）。KEGG 富集分析同樣顯示，黃酮相關(guān)的通路是2 種百香果差異最顯著的。

3 討論與結(jié)論

2 種百香果共含有黃酮類、酚酸類、氨基酸類、有機(jī)酸類、糖及醇類等405 種代謝產(chǎn)物，其中功能性物質(zhì)黃酮類、酚酸類種類最多，也是紫果百香果和黃金百香果中差異代謝物數(shù)量最多的兩類物質(zhì)，同時(shí)2 種百香果各自獨(dú)有的黃酮類物質(zhì)也是最多的。百香果作為民間傳統(tǒng)藥用植物，廣泛應(yīng)用于利尿、止咳、消炎止痛[10-11]。通過差異代謝物篩選，共得到163 種物質(zhì)，同樣以黃酮類（72 種）、酚酸類（28 種）為主。KEGG 富集分析顯示，黃酮相關(guān)的通路也是2 種百香果差異最顯著的。黃酮和酚酸功能復(fù)雜，在調(diào)節(jié)果實(shí)風(fēng)味方面具有很重要的作用，此外，在提高植物抗逆性、影響果實(shí)色澤方面也發(fā)揮著重要的作用[12-14]。柿、葡萄和核桃內(nèi)種皮因富含單寧、兒茶素等而具有澀味[15-17]，柚子有明顯的苦味是因?yàn)楦缓制ぼ誟18]，新橙皮苷也是柑橘的苦味來源[19-20]。百香果中檢測到一定量的新橙皮苷、原兒茶酸，但吃的時(shí)候察覺不到苦澀味很可能是被別的物質(zhì)中和，所以黃酮類和酚酸類物質(zhì)是如何影響百香果風(fēng)味的，還需進(jìn)一步研究。

水果中的糖和有機(jī)酸組分及比例是影響果實(shí)風(fēng)味的重要因素[7,21]。百香果果汁中含有豐富的糖和有機(jī)酸，2 種百香果中共檢測到山梨糖醇、葡萄糖等21 種糖醇以及檸檬酸、琥珀酸等31 種有機(jī)酸，其中5 種糖和9 種酸相對含量差異顯著。黃金百香果中磷酸葡糖酸下調(diào)，耐斯糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸上調(diào)；L-高絲氨酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸下調(diào)，（S）-2-羥基丁酸、4-乙酰氨基丁酸、5-羥基己酸、2-羥基丁酸、半乳糖醛酸上調(diào)；α-羥基異丁酸、3-羥基丁酸獨(dú)有。雖然黃金百香果中上調(diào)代謝物的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于下調(diào)代謝物，但黃金百香果總酸含量低于紫果百香果[22]，所以黃金百香果中上調(diào)和獨(dú)有的7 種酸很可能對總酸的貢獻(xiàn)量不大，L-高絲氨酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸2 種酸的下調(diào)才是造成黃金百香果總酸含量低于紫果百香果的主要原因。同理，黃金百香果口感甜于紫果百香果，是因?yàn)樘呛扛?，與耐斯糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸4 種糖上調(diào)有關(guān)[22-23]。氨基酸不僅是食物中重要的營養(yǎng)成分，同時(shí)在豐富食物味道方面也起到重要的作用[24-25]，一般意義上把谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸這6 種能呈現(xiàn)出特殊鮮味的氨基酸稱為呈味氨基酸。百香果中氨基酸含量豐富，檢測到66 種氨基酸及其衍生物，紫果百香果和黃金百香果中15 種氨基酸及其衍生物相對含量差異顯著，紫果百香果中12 種氨基酸及其衍生物上調(diào)，3 種下調(diào)，其中苯丙氨酸、L-天冬氨酸2 種呈味氨基酸顯著高于黃金百香果，L-天冬氨酸和苯丙氨酸在食品加工過程中通常作為香味劑、鮮味劑添加使用，因此以苯丙氨酸、L-天冬氨酸為代表的氨基酸的上調(diào)是導(dǎo)致紫果百香果香味、鮮味濃于黃金百香果的重要原因[23]。

百香果因其獨(dú)特香氣而備受歡迎，主要是因?yàn)楹胸S富的芳香類物質(zhì)[26]。脂質(zhì)是芳香類物質(zhì)等揮發(fā)性有機(jī)物的前體物質(zhì)，在百香果成熟過程中顯著降低[27]。紫果百香果和黃金百香果中6 種脂質(zhì)含量存在顯著差異，紫果百香果中5 種脂質(zhì)上調(diào)、1 種下調(diào)，紫果百香果香味更加濃郁很可能與單酰甘油酯、甘油亞油酸酯等5 種脂質(zhì)的分解上調(diào)密切相關(guān)。