兩種不同品牌谷胱甘肽還原酶檢測(cè)試劑盒的性能評(píng)價(jià)

錢 錦，黃 穎

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 泰州 225300）

谷胱甘肽還原酶（GR，Glutathione reductase）是一種利用還原型輔酶II（NADPH）將氧化型谷胱甘肽（GS-SG）催化反應(yīng)為還原型（GSH）的酶。目前國(guó)內(nèi)主流的全自動(dòng)生化分析儀均可以完成谷胱甘肽還原酶檢測(cè)，這使得大批量快速檢測(cè)該項(xiàng)目得到實(shí)現(xiàn)。生化檢驗(yàn)體外診斷試劑品牌多種多樣，選擇一款適合于實(shí)驗(yàn)室及臨床的生化檢測(cè)試劑尤為重要。性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)無(wú)疑是實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)體外診斷試劑的最方便有效的方式。根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)描述[1]，驗(yàn)證是指通過提供客觀證據(jù)對(duì)規(guī)定要求已得到滿足的認(rèn)定，即醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室通過具體實(shí)驗(yàn)明確試劑廠商聲明的技術(shù)數(shù)據(jù)有無(wú)問題。這是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室在新試劑使用前最為重要的一步。

1 資料與方法

1.1 一般資料 新鮮人血清標(biāo)本1.5ml 左右。驗(yàn)證參考范圍所需的正常人群來(lái)源于我院健康體檢者，共40 名，其中男22 名，女18 名。每種試劑隨機(jī)抽取20 名，其中男11 名，女9 名。年齡18～65 歲。要求血常規(guī)、肝、腎功能、血糖血脂等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)正常；B 超、胸透/胸片、心電圖正常；無(wú)糖尿病、血液系統(tǒng)、心血管等系統(tǒng)疾病史；排除妊娠人群、排除用藥者及服用保健品者；半年內(nèi)無(wú)手術(shù)史及輸血/獻(xiàn)血史。

1.2 儀器、試劑及檢測(cè)方法 檢測(cè)儀器為Beckman Coulter AU5800全自動(dòng)生化分析儀。試劑為安徽大千谷胱甘肽還原酶檢測(cè)試劑盒，試劑批號(hào)20210600101，校準(zhǔn)品批號(hào)202106001，質(zhì)控品批號(hào)202106001；山東中拓谷胱甘肽還原酶檢測(cè)試劑盒，試劑批號(hào)21042711，校準(zhǔn)品批號(hào)2103171L，質(zhì)控品批號(hào)2106031L。兩種品牌的谷胱甘肽還原酶試劑檢測(cè)方法均為速率法。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器準(zhǔn)備 使用廠家推薦檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行儀器設(shè)置，隨后使用配套校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)校準(zhǔn)，確認(rèn)校準(zhǔn)結(jié)果無(wú)誤后開始進(jìn)行性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選取兩個(gè)濃度的質(zhì)控品，關(guān)注醫(yī)學(xué)決定水平，每天檢測(cè)1 個(gè)分析批，每批檢測(cè)2個(gè)水平的樣本，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，連續(xù)檢測(cè)5 天，計(jì)算實(shí)驗(yàn)室內(nèi)（總）標(biāo)準(zhǔn)差或CV。判斷標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)室總不精密度CV≤6.67%。

1.3.3 正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 谷胱甘肽還原酶無(wú)可獲取的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無(wú)法使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，因此采用患者樣本比對(duì)的方法進(jìn)行正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。該方法遵循衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定要求[1]。我院采用與安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（三級(jí)甲等）檢驗(yàn)科（通過CNAS ISO15189 認(rèn)可）進(jìn)行人血清標(biāo)本比對(duì)的方案進(jìn)行正確度驗(yàn)證。選取患者/受試者樣本20份，被測(cè)物濃度、活性等在測(cè)量區(qū)間內(nèi)均勻分布，并關(guān)注醫(yī)學(xué)決定水平，用實(shí)驗(yàn)方法和比對(duì)方法分別檢測(cè)，分成3～4 天，每天5～7個(gè)標(biāo)本檢測(cè)完。參比系統(tǒng)：經(jīng)驗(yàn)證分析性能符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)，日常室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)/能力驗(yàn)證合格的檢測(cè)系統(tǒng)。優(yōu)先選用符合以上要求的CNAS認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)參比系統(tǒng)為通過ISO15189 認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室。判斷標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)均值與參比系統(tǒng)均值的總體差異≤10%。

1.3.4 線性范圍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選取接近廠家聲明線性上下限濃度樣本，按4H+1L,3H+2L，2H+3L，1H+4L 比例混合，包括原有的高值、低值共6 份樣品，每個(gè)濃度水平的樣本重復(fù)測(cè)定3 次，一次性完成檢測(cè)，對(duì)測(cè)定值與稀釋系數(shù)Excel表格計(jì)算一次、二次、三次回歸系數(shù)；系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤；對(duì)應(yīng)T值及回歸標(biāo)準(zhǔn)誤差。判斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)T檢驗(yàn)，若二次、三次系數(shù)與 “0” 無(wú)顯著差異，即線性驗(yàn)證成功；若當(dāng)存在非線性時(shí)，根據(jù)回歸標(biāo)準(zhǔn)誤的大小，將最小者確定為最適擬合模型。對(duì)判斷為非線性的數(shù)據(jù)需進(jìn)行非線性程度的判斷。首先需進(jìn)行不精密度和偏離直線平均差異（ADL 值）的計(jì)算。將計(jì)算出的ADL 值同不精密度與ADL 臨界值表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，如小于臨界值，則表示數(shù)據(jù)雖判斷為統(tǒng)計(jì)學(xué)上的非線性，但不精密度和ADL 為臨床可接受，為臨床可接受的非線性[2]。

1.3.5 參考范圍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選擇20 份無(wú)相關(guān)疾病的體檢合格的健康人群標(biāo)本，在檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)定，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并對(duì)參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證。判斷標(biāo)準(zhǔn)：若20 份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)離群值判斷處理后，均在參考區(qū)間內(nèi)或不多于2 個(gè)標(biāo)本超出，則驗(yàn)證通過。否則需參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行參考區(qū)間確立實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel軟件。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 精密度 兩品牌試劑精密度性能均符合要求。精密度驗(yàn)證結(jié)果見表1。

表1 安徽大千和山東中拓精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 正確度驗(yàn)證 允許范圍為不超過10.0%。兩品牌試劑正確度性能均符合要求。正確度驗(yàn)證結(jié)果見表2、圖1、圖2。

圖1 山東中拓正確度驗(yàn)證回歸分析圖

圖2 安徽大千正確度驗(yàn)證回歸分析圖

表2 安徽大千和山東中拓正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 線性范圍驗(yàn)證 安徽大千的線性范圍為10～200U/L，山東中拓的線性范圍為4～300U/L。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分析可知，兩品牌試劑線性范圍性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的ADL實(shí)測(cè)值均低于臨界值（允許值），可判定驗(yàn)證均通過。其中安徽大千為線性方程，山東中拓為臨床可接受的三階非線性方程。線性范圍驗(yàn)證結(jié)果見表3。

表3 安徽大千和山東中拓線性范圍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 參考范圍驗(yàn)證 通過不同批次正常人的血清檢測(cè)和驗(yàn)證，安徽大千和山東中拓參考范圍均符合要求。參考范圍驗(yàn)證結(jié)果見表4。

表4 安徽大千和山東中拓參考范圍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，安徽大千和山東中拓的檢測(cè)性能指標(biāo)均符合相關(guān)要求。其中山東中拓總精密度（取小者）較小、線性范圍（取寬者）較寬，雖正確度方面（取小者）安徽大千略優(yōu)于山東中拓，但從試劑穩(wěn)定性（精密度要小）和使用成本（潛在高值復(fù)查率要低）方面綜合考慮，山東中拓略優(yōu)于安徽大千。

3 討論

性能驗(yàn)證是指由醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室通過特定實(shí)驗(yàn)，使用客觀證據(jù)證明廠家聲明的性能指標(biāo)是否滿足規(guī)定要求的過程，該過程由醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立完成。

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室性能驗(yàn)證方案離不開標(biāo)準(zhǔn)文件，較為經(jīng)典的為美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的EP（evaluation of permance）文件，用于指導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室和制造商進(jìn)行性能驗(yàn)證和確認(rèn)。EP文件多且雜，并帶有復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式。目前中文譯文較少，且最新文件無(wú)法免費(fèi)獲取，因而無(wú)法廣泛推廣。近年來(lái)我國(guó)衛(wèi)生部門以EP文件為基礎(chǔ)，發(fā)布了各種用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室性能驗(yàn)證的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T），大大提高了標(biāo)準(zhǔn)文件的閱讀性和普及性。但不同性能驗(yàn)證內(nèi)容需要參考不同的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于基層醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)仍不方便。中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）于2019年開始發(fā)布關(guān)于不同檢驗(yàn)領(lǐng)域的性能驗(yàn)證說明，這些文件將衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)整合在一起，加入不同專業(yè)領(lǐng)域特定要求，對(duì)整個(gè)性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行系統(tǒng)描述，以期規(guī)范不同實(shí)驗(yàn)室操作流程。

相較于室內(nèi)質(zhì)控，性能驗(yàn)證的難主要體現(xiàn)在樣本的選擇和數(shù)據(jù)的計(jì)算。以線性范圍驗(yàn)證為例，不同于精密度、正確度和參考范圍驗(yàn)證，線性范圍驗(yàn)證需要的樣本濃度跨度極大，計(jì)算非常繁瑣，以CLSI EP6 方案為甚。雖然CLSI 在臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的制定上，處于最權(quán)威的機(jī)構(gòu)，但對(duì)于線性驗(yàn)證的處理顯得欠妥。2020 年CLSI 發(fā)布了最新的EP06 文件（EP06-Ed2），其中對(duì)于統(tǒng)計(jì)方法做了大幅度改變，不再要求做二項(xiàng)和三項(xiàng)回歸，而是采納加權(quán)線性（WLS，Weiguted Least Square）[3]。但原文中專家們?nèi)匀徽J(rèn)為EP06-A的統(tǒng)計(jì)方式更科學(xué)。所以猜想這是不是為了在 “數(shù)學(xué)” 和 “實(shí)踐” 之間取得一個(gè)平衡，放棄了二項(xiàng)和三項(xiàng)回歸的要求。中國(guó)國(guó)家衛(wèi)健委頒布的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，涉及線性驗(yàn)證的有兩份文件：（1）WS/T 408-2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評(píng)價(jià)指南》；（2）WS/T 420-2013《臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證》。這兩份文件均未完全遵循CLSI EP06方案。WS/T 420-2013使用相關(guān)系數(shù)判斷線性，本身在統(tǒng)計(jì)方法上值得商榷。WS/T 408-2012 最接近EP06方案，但在臨床可接受的非線性驗(yàn)證上，確與EP06 方案存在差異。主要體現(xiàn)在計(jì)算最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值A(chǔ)DL （aveage deviation from linearity）。WS/T 408-2012計(jì)算ADL是針對(duì)所有濃度的平均值，EP06 是要求對(duì)每個(gè)濃度的樣本做逐一判斷，即每個(gè)濃度包括低值樣本必須通過，往往難以達(dá)到臨床可接受的判斷標(biāo)準(zhǔn)。三份文件均存在使用上的難點(diǎn)和不足。2019 年之前CNAS并未明確規(guī)定性能驗(yàn)證的方案，只要求采用相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文件即可，實(shí)驗(yàn)室在實(shí)施線性范圍驗(yàn)證時(shí)，多數(shù)采用WS/T 420-2013 方案，該方案實(shí)施簡(jiǎn)單，通過率高，但該方案本身存在缺陷，需要淘汰。針對(duì)此問題，2019 年CNAS 發(fā)布的CNAS GL-037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》，建議將WS/T 408-2012作為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室線性范圍性能驗(yàn)證的依據(jù)。

綜上所述，CNAS GL-037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》文件可進(jìn)行同一項(xiàng)目不同試劑品牌的性能比較。性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)應(yīng)由醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作人員獨(dú)立完成。實(shí)驗(yàn)室選擇試劑品牌時(shí)，應(yīng)根據(jù)真實(shí)的數(shù)據(jù)結(jié)果，對(duì)試劑穩(wěn)定性、使用成本等多方面進(jìn)行綜合判斷。總之，CNAS GL-037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》通過標(biāo)準(zhǔn)化整合，一定程度上為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室尤其是基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試劑品牌的選擇，提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)流程。