自身免疫性大皰性皮膚病的實驗室診斷進展

烏心怡，潘 萌，朱海琴

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科，上海 200025）

自身免疫性大皰性皮膚病（autoimmune bullous dermatoses，AIBD）是一組由針對皮膚及黏膜組織中結構蛋白的自身抗體引起的器官特異性異質性疾病，抗原抗體反應導致了表皮內細胞間以及真表皮之間的連接破壞，皮膚黏膜黏附能力喪失，臨床出現(xiàn)水皰[1-2]。根據(jù)水皰所在部位，可分為表皮內大皰病和表皮下大皰病。尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）是表皮內大皰病中最常見的亞型，至少有2/3 的患者屬于此類型[3-4]。在亞洲地區(qū)，PV 的發(fā)病率為每年1．6～16．1 人/百萬人[3,5]。絕大部分患者的年齡都在40～60 歲，且以女性患病更為常見[5]。表皮下大皰病中大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）是最常見的亞型[6]，在亞洲地區(qū)的發(fā)病率為每年2．6～7．5 人/百萬人[6]。隨著年齡的增長，BP 的發(fā)病率也會隨之增加，與PV 不同的是，在高于75歲的人群中，男性患者更為常見[7-8]。

在天皰瘡中，自身免疫系統(tǒng)主要針對的是橋粒的組成部分（見表1）；而在類天皰瘡疾病中，自身抗體主要針對的是真表皮連接的結構蛋白[9（]見表2）。根據(jù)自身免疫系統(tǒng)針對的成分不同，臨床應用的治療方法也不同，因此需要依靠實驗室診斷予以鑒別。目前，兩者的實驗室診斷以直接免疫熒光法（direct immunofluorescence，DIF）為金標準，血清學方法為輔，后者包括間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）和免疫印跡法（immunoblotting，IBT）等。近年來不斷有新型實驗室技術出現(xiàn)，包括生物芯片技術、EUROTide?孵育技術、MESACUP anti-Skin profile TEST、側向流動免疫層析技術（lateral flow immunoassay,LFIA）、化學發(fā)光酶免疫技術、熒光疊加抗原定位-激光掃描共焦顯微鏡技術（fluorescence overlay antigen mapping using laser-scanning confocal microscopy, FOAM-LSCM）等。目前國內缺少對AIBD 實驗室診斷方法的綜合性總結，因此本文將基于AIBD 的傳統(tǒng)實驗室診斷方法，將其與新型實驗室技術進展進行比較，探討后者在AIBD 診斷中的臨床應用價值。

表1 表皮內水皰病的特異性抗原Table 1 Specific antigens of epidermal bullous dermatosis

1 傳統(tǒng)實驗室診斷方法

1.1 病理檢查

基于受累皮膚或黏膜的組織病理學檢查是鑒別診斷大皰性皮膚病最基本的實驗室方法[10]。取患者的新鮮（24 h內）、完整水皰置于4%甲醛溶液中，固定后進行常規(guī)石蠟切片和蘇木精-伊紅染色，用光學顯微鏡觀察浸潤細胞的類型以及表真皮裂隙的部位，可以區(qū)分表皮內水皰與表皮下水皰[11-12]。

1.2 DIF

取皮損周圍1～2 cm范圍內的正常皮膚，通過冰凍切片技術和熒光結合物標記的抗人抗體，對沉積于皮損局部的自身抗體進行直接檢測。DIF 是AIBD 最可靠、最特異性的診斷方法，其靈敏度可達到82%～91%，特異度可達到98%[13-14]。筆者團隊對25 例PV 患者的分析研究發(fā)現(xiàn)，DIF的陽性率可以達到80%[15]。但DIF 對于明確靶抗原具有一定局限性，只能通過產生熒光沉積的抗體類型和熒光沉積的模式來輔助診斷。例如棘細胞間的IgG 和C3的熒光沉積常出現(xiàn)在PV、PF 和PNP 中，而基底膜帶的IgG 和C3線性熒光沉積通常出現(xiàn)在類天皰瘡疾病中。

1.3 血清學診斷

血清學診斷可以用來區(qū)分不同類型的循環(huán)自身抗體，其優(yōu)勢是侵入性最小，尤其對于難以進行皮膚取樣的患者是比較好的檢測方法。AIBD 的血清學診斷方法包括IIF、ELISA和IBT等[9]。

1.3.1 IIF

猴子或豚鼠的食管是高度靈敏的IIF 底物。在底物上先滴加樣本血清，孵育后加入熒光結合物標記的抗人抗體，在熒光顯微鏡下通過不同的熒光沉積模式，可清楚地分辨天皰瘡與類天皰瘡疾病，類似DIF。猴食管底物對天皰瘡的診斷靈敏度達到81%～100%，特異度達到89%～100%[16]。在類天皰瘡的診斷中，猴食管底物的檢測靈敏度達到68%～73%，特異度達到97%[13]。

1.3.2 鹽裂皮膚試驗

鹽裂皮膚試驗采用1 mol/L 氯化鈉溶液浸泡（4 ℃，24～48 h），使皮膚的真皮和表皮在透明板處分裂，抗原決定簇充分暴露以利于抗體結合，便于觀察區(qū)分基底膜帶的熒光沉積位于表皮側或真皮側。鹽裂皮膚檢測AIBD 的靈敏度可以達到73%～96%，特異度可以達到97%[13]。試驗優(yōu)勢在于可區(qū)分不同的自身抗體，如抗BP180、抗BP230、抗α6β4整合素抗體位于鹽裂皮膚的表皮側，對類天皰瘡、線狀IgA大皰性皮病等具有一定檢出率；而抗Ⅶ型膠原、抗層粘連蛋白332、抗層粘連蛋白γ1抗體結合在鹽裂皮膚的真皮側，對EBA、抗p200類天皰瘡有一定檢出率[5,8]。

1.3.3 ELISA

ELISA 已經廣泛應用于AIBD 循環(huán)抗體的檢測，除了可以明確靶抗原，其優(yōu)勢在于能夠定量監(jiān)測抗體水平、判斷疾病發(fā)展和預后評估[5,17]，同時操作比較簡便。將標準血清和樣本血清加入預先包埋抗原的微孔中，孵育后加入酶標二抗，最后加入底物顯色，用分光光度計測定吸光度。筆者團隊研究發(fā)現(xiàn)，ELISA 法對PV 患者的抗Dsg3 抗體檢出率為92%，對PF患者的抗Dsg1抗體檢出率為90%[18]。

1.3.4 IBT

IBT 能夠輔助檢測相對少見的自身抗體。人類表皮提取物經過處理后期蛋白質分子通過電泳轉移到硝酸纖維素膜上，加入樣本血清和過氧化物酶結合的抗人抗體進行孵育，判讀最終顯色條帶位置即可確定相應的抗體[5,19-20]。一項對23 例天皰瘡患者的分析研究發(fā)現(xiàn)，PV 患者中92%可檢出抗Dsg3 抗體，PF 患者中90%可檢出抗Dsg1 抗體[18]。同時，Meijer 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在類天皰瘡疾病中IBT 的靈敏度和特異度分別達到70%和95%。然而，IBT的不足之處在于操作復雜耗時，且技術要求比較高。

2 實驗室診斷方法進展

2.1 生物芯片技術

傳統(tǒng)IIF需要專業(yè)技術人員的正確解讀，而重組底物可以簡化IIF 的判讀，通過選取抗原上的免疫活性表位，去除非特異性反應的區(qū)域，增加和該抗原結合的抗體數(shù)量，顯著提高檢測的靈敏度和特異度[9]。目前，重組底物可以分為2種類型。第一種是將靶抗原表達于人類HEK293 細胞，比如將經過轉染Dsg1、Dsg3 和未經過轉染Dsg1、Dsg3 的HEK293 細胞都包被在生物芯片上，如果是真陽性，則僅有經過轉染處理的細胞內出現(xiàn)均勻細致的熒光沉積；如果是假陽性，則在2種細胞中均出現(xiàn)熒光沉積[19,22]。第二種是將純化的重組抗原如BP180-NC16A-4X 直接包被在生物芯片上，如果試驗呈陽性，則會呈現(xiàn)特定的熒光沉積形態(tài)，如鉆石狀或環(huán)狀[9]。標準的生物芯片檢測是將不同的底物結合在一起放在同一個反應孔中進行自身抗體的篩選，能夠在孵育后一次性檢出不同的自身抗體，輔助診斷AIBD[9]。與傳統(tǒng)的多步驟檢測方法相比，生物芯片檢測的優(yōu)勢在于成本較低且高效，尤其是對于Dsg3和BP180的檢出率較高[23]，分別達到97%～100%和94%，僅有＜5%的患者需要通過傳統(tǒng)方法（如DIF 等）進一步診斷[24]。目前還有更多的微型抗原正在開發(fā)中，如Ⅶ型膠原的NC1 區(qū)域、BP180 胞外域、橋粘素蛋白1、2、3以及層粘連蛋白332、γ1等[25]。

2.2 EUROTide?孵育技術結合EUROPath 系統(tǒng)的新型自動化DIF技術

該檢查是取患者皮損周圍1～2 cm范圍內的正常皮膚，行冰凍切片。將組織冰凍切片放置在EUROPath 的生物芯片M14 上，對異硫氰酸熒光素標記的抗人抗體（包括IgA、IgM、IgG、C3c 和纖維蛋白原）進行梯度稀釋后與樣本在室溫下避光搖床孵育（EUROTideTM孵育技術），然后EUROPath 系統(tǒng)進行自動清洗，封片后熒光顯微鏡下觀察結果[26]。與傳統(tǒng)的手工DIF 方法相比，EUROTideTM孵育技術能夠避免熒光結合物的分布不均勻，加快抗原抗體反應速度，熒光更強，背景熒光更少。另外，該方法能夠在一次反應中同時完成1例患者的5種染色，更加高效。

2.3 MESACUP anti-Skin profile TEST(ASPT)

多參數(shù)抗原特異性ELISA 能夠在鄰近的反應孔內同時檢測多種抗體[27]，ASPT 可在不同的反應孔中同時包被Dsg1、Dsg3、BP180、BP230和VII型膠原重組抗原，則可以在一列共8 個ELISA 反應孔（包括陽性對照和陰性對照孔）中對所有抗體進行檢測，并且孵育時間相比傳統(tǒng)ELISA 縮短一半[27]。Orsolya N． HORV 'ATH 等研究發(fā)現(xiàn)，與單參數(shù)ELISA 相比，ASPT 可以達到88%的符合率，并且其對Dsg1、Dsg3、BP230 和Ⅶ型膠原的檢測特異度可以達到100%，對BP180 的特異度可以達到98%。另外，ASPT 對抗Dsg1、抗Dsg3、抗BP180、抗BP230 和抗Ⅶ型膠原抗體的檢測靈敏度分別達到92%、93%、66%、62%和81%，與傳統(tǒng)的單參數(shù)ELISA相比靈敏度更高[27]。除了能夠定量監(jiān)測抗體水平外，ASPT 還能夠在患者隨訪過程中檢測到抗原擴展現(xiàn)象[27]，但需要注意的是，ASPT 對BP180 和BP230 的檢測可能存在假陽性結果，應結合DIF 檢測結果以及臨床癥狀進行綜合判斷[22]。

2.4 LFIA

LFIA 是基于抗人抗體、His 標記Dsg3 和膠體金顆粒偶聯(lián)抗His 抗體，對患者樣本中的抗Dsg3 抗體進行檢測。此方法對PV 的檢測靈敏度和特異度分別達到73%和94%[28]。LFIA 的優(yōu)勢在于檢測時間短，可肉眼觀察結果，并且可以使用血清、血漿、唾液、尿液和全血等樣本。其不足之處在于缺少酶反應可能會降低反應的靈敏度，且無法給出定量或半定量結果，只適用于快速定性檢測，與傳統(tǒng)單參數(shù)ELISA相比，無法準確地描述抗體的滴度變化情況。

2.5 化學發(fā)光酶免疫技術

該技術是基于重組Dsg1、Dsg3 和BP180 包被的磁珠與堿性磷酸酶標記的多克隆IgG 抗體，對患者血清中的抗Dsg1、抗Dsg3 和抗BP180 抗體進行檢測，其檢出率分別為48%、65% 和86%，與ELISA 相比符合率可達到94%～99%[29]。此方法的優(yōu)勢在于抗原抗體為共價結合，因此檢測范圍相比物理結合的ELISA 更寬，目前已被廣泛應用于檢測類風濕性關節(jié)炎的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體[30]。與傳統(tǒng)手工ELISA 相比，該技術檢測時間短、自動化程度高，將有望成為檢測AIBD患者自身抗體的有力方法。

2.6 熒光疊加抗原定位-激光掃描共焦顯微鏡技術（Fluorescence overlay antigen mapping using laser-scanning confocal microscopy,FOAM-LSCM）

FOAM-LSCM 是指從患者皮損周圍的正常皮膚取樣，行冰凍切片，先對基底膜帶的抗原（如β4整合素、層粘連蛋白332、Ⅳ型膠原等）采用相應的鼠抗人抗體進行結合，清洗后使用Cy5 和異硫氰酸熒光素2 種熒光素分別標記的抗鼠和抗人抗體進行孵育，在對應的2 種熒光波長下對致密板和透明板的不同結構進行觀察[31-32]。與傳統(tǒng)手工DIF 檢測相比，F(xiàn)OAM 能夠一次性對基底膜帶的不同成分進行區(qū)別染色，效率更高且操作簡單。目前國際大皰病組織已經認可FOAM 作為診斷獲得性大皰性表皮松解癥的有力工具[33]。同時，LSCM 能夠解決傳統(tǒng)熒光顯微鏡在失焦區(qū)域的熒光干擾問題，可獲得更為清晰的熒光圖片[34]。FOAM-LSCM 聯(lián)合有助于臨床診斷黏膜類天皰瘡等在傳統(tǒng)方法下難以與BP或獲得性大皰性表皮松解癥區(qū)分的AIBD，對無法檢測出循環(huán)抗體的患者具有重要意義。

3 小結

AIBD 的實驗室診斷對于疾病的治療和預后都有著極其重要的作用。目前常規(guī)的組織病理學檢查、DIF 和血清學診斷法具有一定局限性，新型的生物芯片、自動化DIF、多參數(shù)抗原特異性ELISA、LFIA、化學發(fā)光酶免疫技術和FOAM-LSCM 技術的應用為診斷AIBD 提高了便捷性、特異度和靈敏度，但目前尚未廣泛應用于臨床。隨著對AIBD 發(fā)病機制的深入研究，及對生物檢測技術的進一步利用和開發(fā)，更為特異有效、便捷的抗體檢測手段將不斷涌現(xiàn)，為疾病的精確診斷提供更多更好的方法。

利益沖突說明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本文不涉及倫理批準及知情同意。

作者貢獻/Authors’Contributions

烏心怡撰寫，朱海琴收集資料，潘萌設計并審核論文。