天然產(chǎn)物應(yīng)用于蜜蜂病毒病防控的研究進(jìn)展

黃知楚，劉 瑤，周倪紅，黃 倫，鄭火青

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.四川省甘孜州蜂業(yè)管理站，四川 甘孜 626000）

1 前言

蜜蜂是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的傳粉者，約1/3 的農(nóng)作物依賴于蜜蜂授粉，其授粉服務(wù)使世界各地的農(nóng)作物增值約9.5%[1]。蜂產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展不僅關(guān)系著蜂產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量、農(nóng)作物的增產(chǎn)效益，也關(guān)系著生物多樣性維護(hù)和生態(tài)系統(tǒng)平衡。

盡管世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明近幾十年來(lái)全球蜂群總數(shù)增長(zhǎng)了45%[2]，但其授粉服務(wù)仍不能滿足日益增長(zhǎng)的世界人口數(shù)量和糧食產(chǎn)量需求[3]。蜜蜂面臨各種生物因素與非生物因素的侵?jǐn)_，每年仍有大量蜂群損失[4]。引起蜂群損失的因素是雙重的。在蜂群內(nèi)部，蜜蜂面臨營(yíng)養(yǎng)水平失衡[5]、蜂王生育性能下降[6]等挑戰(zhàn)，高密度的飼養(yǎng)管理模式下的蜜蜂也極易遭受細(xì)菌、真菌、病毒等病原體感染和寄生蟲侵?jǐn)_[7,8]；在蜂群外部，氣候和環(huán)境變化[9]、農(nóng)業(yè)中化學(xué)藥物的使用[10]、覓食地的減少與越冬損失[11]等都是影響蜂群健康的重要因素。

在前述眾多因素中，蜜蜂病毒感染很常見(jiàn)但又是在養(yǎng)殖過(guò)程中容易被忽視的問(wèn)題。因?yàn)槊鄯洳《揪哂袠O強(qiáng)的隱蔽性，以低濃度的隱性方式感染蜜蜂，只有少數(shù)病毒能夠產(chǎn)生可鑒別的臨床癥狀，難以引起養(yǎng)蜂人的重視。目前有二十多種蜜蜂病毒被分離鑒定并廣泛分布于世界各地的蜂群中，其中7 種病毒在蜂群中高度流行，分別是殘翅病毒（D eform ed W ing V irus,D W V）、急性蜜蜂麻痹病毒（A cute Bee Paralysis V irus, A BPV）、 囊 狀 幼 蟲 病 毒（Sacbrood Bee V irus,SBV）、黑蜂王臺(tái)病毒（Black Q ueen CellV irus,BQ CV）、以色列急性麻痹病毒（IsraeliA cute Paralysis V irus,IA PV）、慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic Bee Paralysis V irus,CBPV） 和克什米爾病毒（K ashm ir Bee V irus,K BV）。大多數(shù)種類蜜蜂病毒的遺傳物質(zhì)為正義單鏈R N A，歸屬仿小核糖核酸病毒目（Picorna-likevirus），僅有蜜蜂絲狀病毒（A pis M elliferaFilam entous V irus,A m FV） 和蜜蜂虹彩病毒（A pis iridescentvirus,A IV） 是D N A 病毒。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)的發(fā)展，又有越來(lái)越多的病毒從世界各地的蜂群中被發(fā)現(xiàn)，其中還包括一些負(fù)義單鏈R N A 和雙鏈R N A 病毒[12,13]。病毒通過(guò)食源性傳播、性傳播以及媒介傳播等水平途徑在同一代不同個(gè)體間傳播，或以垂直傳播方式借助蜜蜂的繁育行為從親代傳遞到子代[14]。蜜蜂病毒的宿主非常廣泛，并不僅限于蜜蜂種群內(nèi)，有些病毒能夠在其他膜翅目甚至非膜翅目的節(jié)肢動(dòng)物中檢測(cè)到[15]。

蜜蜂并非對(duì)病毒疾病沒(méi)有抵抗力[16]，在長(zhǎng)期進(jìn)化和自然選擇過(guò)程中也形成了與其周圍環(huán)境相適應(yīng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生活方式，具備了一套完善的防御體系以保護(hù)自身安全。在個(gè)體層面，蜜蜂通過(guò)Toll、Im d、JN K 和JA K/STA T 4 條主要的先天免疫通路調(diào)控神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)維持機(jī)體平衡[17]；而在群體層面，蜜蜂會(huì)更多地收集儲(chǔ)存植物的花蜜、花粉和樹脂（蜂膠），并采食其中特定的植物化學(xué)物質(zhì)，以此作為減少蜂群病原體負(fù)荷的一種手段[18-22]。

而在一些特定條件下，在蜜蜂病毒寄主體細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，感染程度超過(guò)蜂群可調(diào)節(jié)能力范圍時(shí)，即可表現(xiàn)出強(qiáng)烈的致病性，從而引發(fā)致死性蜜蜂病毒病的流行與爆發(fā)。由于病毒利用宿主細(xì)胞進(jìn)行繁殖和存活，目前還沒(méi)有研發(fā)出能夠殺滅病毒而不影響蜜蜂生理的特效療法。同時(shí)，蜂群中藥物的使用給蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)很大風(fēng)險(xiǎn)，因此，在科研和生產(chǎn)實(shí)踐中，人們期望尋求一種溫和、安全且可長(zhǎng)期使用的藥物以提高蜜蜂對(duì)病毒的抵抗力并延長(zhǎng)蜜蜂壽命，天然產(chǎn)物補(bǔ)充劑在蜂群疾病防控中的需求由此應(yīng)運(yùn)而生。

2 天然產(chǎn)物

天然產(chǎn)物，也稱次級(jí)代謝產(chǎn)物，是指動(dòng)物、植物或微生物等天然來(lái)源的具有藥理學(xué)或生物學(xué)活性的化合物或其代謝產(chǎn)物[23]。與生物體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的初級(jí)代謝產(chǎn)物不同，天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且僅出現(xiàn)在特定的物種、器官、組織或細(xì)胞中。天然產(chǎn)物對(duì)自身無(wú)具體的生理功能，主要作用是為生物體帶來(lái)某種形式的保護(hù)和益處，協(xié)助生物體適應(yīng)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，如作為引誘劑、驅(qū)避劑、拒食劑和抗生物質(zhì)等，調(diào)節(jié)與其他生物體的相互作用，從而有利于其生存[24,25]。

天然產(chǎn)物來(lái)源廣泛，結(jié)構(gòu)類型多樣，可通過(guò)已知結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)改造，或通過(guò)代謝工程等途徑生產(chǎn)，但最直接的獲取途徑仍是從生物體中提取分離。我國(guó)是植物資源大國(guó)，對(duì)中草藥利用歷史悠久，極大地推動(dòng)了天然植物提取物行業(yè)的發(fā)展，植物來(lái)源的天然產(chǎn)物資源尤其豐富。

3 天然產(chǎn)物與蜜蜂病毒病的防控

植物來(lái)源的天然產(chǎn)物也是蜜蜂最常接觸到的天然產(chǎn)物種類。在沒(méi)有人工管理的野外條件下，植物花蜜和花粉是蜜蜂唯一的碳水化合物和蛋白質(zhì)食物來(lái)源，蜜蜂通過(guò)采食富含天然產(chǎn)物的花蜜和花粉維持蜂群運(yùn)轉(zhuǎn)，根據(jù)植物中天然產(chǎn)物的濃度相應(yīng)地改變自己的覓食行為，在寄生蟲和疾病入侵時(shí)通過(guò)增加采集減少蜂群病原體負(fù)荷[26]。植物天然產(chǎn)物對(duì)蜂群幾種主要病毒病的防控效果將在下文進(jìn)行分類闡述。

3.1 殘翅病毒（D W V）

D W V 是世界范圍內(nèi)蜜蜂感染最普遍的傳染性軟腐病毒科（Iflaviridae） 病毒，于1977年在埃及從無(wú)癥狀的蜜蜂中分離出來(lái)。D W V最初感染西方蜜蜂蜂群時(shí)滴度低、致病力弱、危害小，沒(méi)有引起重視。而狄斯瓦螨在全世界西方蜜蜂蜂群廣泛傳播后，改變了D W V 流行程度及其多樣性，成為D W V 最主要的傳播媒介[27]。D W V 對(duì)不同性別和發(fā)育階段的蜜蜂均有影響，發(fā)病成蜂的典型癥狀包括翅殘缺或畸形、腹部萎縮、體色變暗且失去飛行能力，隱性感染D W V 的蜜蜂即使無(wú)發(fā)病癥狀也會(huì)導(dǎo)致壽命縮短。

Y oung 等人[28]測(cè)試了蜂群短期攝入7 種天然產(chǎn)物后對(duì)健康與免疫的影響，所有被測(cè)的天然產(chǎn)物都表現(xiàn)出對(duì)蜜蜂健康有益的方面，其中百里酚、地黃梓醇和尼古丁顯著降低了蜜蜂D W V 的感染水平，上調(diào)了Im d 和Toll通路調(diào)控的抗菌肽基因表達(dá)，增強(qiáng)了蜜蜂免疫。Parekh 等人[29]后續(xù)在實(shí)驗(yàn)室條件下也證明了百里酚能夠降低D W V 豐度，上調(diào)與免疫相關(guān)的關(guān)鍵R N A i基因、抗菌肽基因、卵黃蛋白原基因的表達(dá)，同時(shí)在一定程度上緩解了煙曲霉素和新煙堿農(nóng)藥對(duì)蜂群的負(fù)面作用。苦杏仁苷是存在于許多植物中的一種氰苷，水解后產(chǎn)生的氫氰酸毒性可致人或動(dòng)物死亡，但蜜蜂對(duì)杏仁苷有較高的耐受性[30,31]，且攝入杏仁苷的蜜蜂在不影響其他微生物和群體免疫基因表達(dá)的情況下還能降低D W V 的病毒滴度[32]。Stam ets等人[33]觀察到蜜蜂采食野生菌菇的現(xiàn)象，結(jié)合真菌提取物的抗病毒活性[34-36]，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蜜蜂攝入某些多孔菌菇提取物對(duì)D W V 具有抑制作用。

對(duì)D W V 的防控除了直接針對(duì)病毒自身以外，還可以通過(guò)防治狄斯瓦螨間接減少病毒載量。含有高濃度百里酚的百里香精油被證明具有良好的殺螨活性[37]，以百里酚為主要成分的天然殺螨劑產(chǎn)品如A piLife V ar、Thym ovar 和A piguard 等已被證明在生產(chǎn)實(shí)踐中具有較好的防控效果，可顯著降低蜂群內(nèi)成年工蜂的瓦螨感染率[38-44]。

3.2 囊狀幼蟲病毒（S B V）

SBV 是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的蜜蜂病毒，20 世紀(jì)30～40 年代在西方蜜蜂蜂群中爆發(fā)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，但現(xiàn)在西方蜜蜂已進(jìn)化出對(duì)SBV 較強(qiáng)的抗性，很少引起疾病或蜂群損失。1972 年首例SBV 感染中蜂在廣東被報(bào)道[45]，此后逐漸成為中蜂的主要致病病原。感染SBV的幼蟲包被特征性的液體囊袋，無(wú)法化蛹，封蓋后死亡率大大增加[46]。成蜂感染SBV 后采集能力下降或喪失，壽命縮短，對(duì)低溫更加敏感。春、秋季節(jié)是囊狀幼蟲病發(fā)生的高峰期，被污染的蜂蜜、花粉飼料和攜帶病毒的個(gè)體是主要傳染源[47]。

中草藥治療是我國(guó)中蜂養(yǎng)殖業(yè)中對(duì)抗SBV的常用方法。具有清熱解毒功效的中草藥在民間應(yīng)用廣泛，鄧位喜等人[48]搜集了民間用于SBV 防治的中草藥組方并加以改進(jìn)，篩選出包括貫眾、虎杖、千里光、金銀花、半枝蓮、地錦草、一枝黃花、板藍(lán)根等的中草藥復(fù)方“中囊消”組方。孫麗萍等人[49]進(jìn)一步證明了板藍(lán)根提取物可以抑制SBV 復(fù)制，調(diào)節(jié)蜜蜂免疫應(yīng)答，提高感染SBV 蜜蜂的存活率。Jovanovic等人[50]認(rèn)為給蜜蜂喂食富含復(fù)合維生素B 的植物補(bǔ)充劑能夠減少SBV 病毒負(fù)荷，改善蜜蜂健康，提高蜂群的生產(chǎn)性能。

3.3 黑蜂王臺(tái)病毒（B Q C V）

BQ CV 最初從死亡的蜂王幼蟲和封蓋王臺(tái)的預(yù)蛹中分離而來(lái)[51,52]。雖然BQ CV 在蜂群中傳播廣泛，但對(duì)普通工蜂和雄蜂沒(méi)有太大影響[53]，主要對(duì)王臺(tái)中的幼蟲產(chǎn)生危害。感染BQ CV 的蜂王在發(fā)育過(guò)程中死亡，形成一個(gè)類似于囊狀幼蟲病的硬質(zhì)囊，其壞死的殘余物將王臺(tái)內(nèi)壁染成黑色。BQ CV 主要通過(guò)蜂王產(chǎn)卵或蜜蜂交哺行為進(jìn)行傳播，感染的主要部位是蜜蜂的腸道或蜂王卵巢[14]，因此BQ CV 與蜜蜂腸道真菌寄生蟲微孢子蟲共同感染時(shí)會(huì)產(chǎn)生極強(qiáng)的致病性[54]，亞致死劑量的農(nóng)藥也會(huì)導(dǎo)致BQ CV 滴度和死亡率增加[55,56]。

由于BQ CV 主要危害蜂王，而蜂王又在蜂群中處于獨(dú)特地位，有關(guān)天然產(chǎn)物對(duì)BQ CV 或蜂王直接作用的研究較少，更多的研究集中在與其高度關(guān)聯(lián)的微孢子蟲防控上，目前市面上已經(jīng)有較多此類天然產(chǎn)物補(bǔ)充劑產(chǎn)品，如以大蒜和肉桂提取物為主要成分的A piH erb○R[57]、富含蘆丁、槲皮素和桉葉腦的Protofil○R[58]等。Chaim anee[59]和O zk1r1m[60]等人分別研究了番荔枝、羅勒、番石榴、蒲桃和小酸模、西洋蓍草、車前草、丹參、百里香、迷迭香、月桂等植物提取物對(duì)微孢子蟲的藥效，結(jié)果表明這些物質(zhì)的效果均與煙曲霉素相似甚至更優(yōu)。A urori等人[61]試驗(yàn)中單獨(dú)證明了月桂葉提取物在不影響卵黃蛋白原基因表達(dá)的情況下可以抑制工蜂體內(nèi)BQ CV 的復(fù)制。

3.4 以色列急性麻痹病毒（IA P V）

IA PV 屬雙順?lè)醋硬《究疲― icistroviridae）病毒[62]，發(fā)病癥狀與A BPV 相似，表現(xiàn)為染病的成年工蜂體色變暗，絨毛脫落，伴隨翅震顫麻痹癥狀，失去飛行能力，離巢后快速死亡。IA PV 的生物學(xué)特性和序列同源性與A BPV 和K BV 非常相近[63,64]。IA PV 于2004 年才在以色列被發(fā)現(xiàn)[65]，但因其在崩潰失調(diào)癥（Colony Collapse D isorder，CCD） 蜂群中的流行，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就引起廣泛關(guān)注。CCD 蜂群的典型特征是成年工蜂短時(shí)間內(nèi)突然消失，蜂巢內(nèi)外找不到蜜蜂尸體，蜂巢中僅剩下蜂王、卵、幼蟲和少量新出房工蜂[66]。CCD 爆發(fā)期間，美國(guó)約有23% 的蜂場(chǎng)受其影響，導(dǎo)致了近50% 的授粉服務(wù)和蜂產(chǎn)品損失[67]。宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)顯示IA PV 與CCD 蜂群之間的相關(guān)性高于其他可能的病原體，IA PV 序列在CCD 蜂群中的普遍存在，以及二者在時(shí)間和地理上的重疊都表明IA PV 與CCD 有密切相關(guān)性[68]，但I(xiàn)A PV 與CCD 的因果關(guān)系沒(méi)有得到廣泛認(rèn)同。

H sieh 等人發(fā)現(xiàn)感染IA PV 的蜜蜂攝入1.5×10-5（植物源常見(jiàn)的自然濃度） 的咖啡因可以顯著提高其存活率[69]?？Х纫蚴欠植甲顝V泛的植物次生代謝物之一[70,71]，蜜蜂在實(shí)驗(yàn)室里對(duì)含有咖啡因的蔗糖溶液表現(xiàn)出偏好性[72,73]，攝入咖啡因有助于提高蜜蜂對(duì)新事物的認(rèn)知能力，鞏固已習(xí)得的嗅覺(jué)記憶[74-76]，緩解新煙堿類殺蟲劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[77]。野外條件下受咖啡因刺激的蜜蜂舞蹈頻率增加，極大地提高覓食效率[78]。對(duì)香豆酸可以特異性上調(diào)蜜蜂p450家族基因[79]和抗菌肽基因[80]的表達(dá)，觸發(fā)解毒機(jī)制，調(diào)節(jié)免疫功能[81]。雖然在H sieh 等的試驗(yàn)中對(duì)香豆酸沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)IA PV 顯著的作用效果[69]，但先前的研究表明對(duì)香豆酸能夠抑制人類鼻病毒rhinovirus 的復(fù)制[82]，該病毒和IA PV 一樣同屬小核糖核酸病毒目，因此對(duì)香豆酸仍是未來(lái)防治IA PV 的潛力物質(zhì)。由于瓦螨也是IA PV 的病毒載體，因此對(duì)瓦螨具有防治作用的物質(zhì)在生產(chǎn)實(shí)踐中也可應(yīng)用于IA PV的防控。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，天然產(chǎn)物在蜂群幾種主要病毒病防控中表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用潛力。但由于病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜、變異迅速，天然產(chǎn)物種類繁多，二者產(chǎn)生的抗性機(jī)制、生理益處等作用原理尚不完全清楚。因此仍需要漫長(zhǎng)的研究過(guò)程，未來(lái)有潛力的研究方向可能在以下方面。首先，病毒感染對(duì)蜜蜂覓食行為的影響，尤其對(duì)可能有“療效”植物產(chǎn)品的偏好性；其次，天然產(chǎn)物對(duì)蜜蜂病毒的作用機(jī)制和原理，參考人體和其他動(dòng)物模型中天然產(chǎn)物的作用機(jī)制以及病毒結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行推導(dǎo)和試驗(yàn)驗(yàn)證；第三，天然產(chǎn)物的組合應(yīng)用，利用化合物間的拮抗與協(xié)同作用發(fā)揮天然產(chǎn)物的最佳效益；最后，完成實(shí)驗(yàn)室成果到田間試驗(yàn)再到生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用與推廣。以上研究將極大地提高人們對(duì)“天然產(chǎn)物- 蜜蜂- 病毒”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)重要性的理解，維護(hù)蜂產(chǎn)品的質(zhì)量安全與蜜蜂授粉服務(wù)，促進(jìn)蜂產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)于人類健康和生態(tài)環(huán)境保護(hù)也具有重要意義。