稀土元素鑭對剛毛藻生理特征及抗逆性的影響*

許國靜 華 華 周德柱 劉 煌 曹 琳 王圖錦

(1.招商局生態(tài)環(huán)保科技有限公司,重慶 400067;2.重慶交通大學河海學院,重慶 400074)

剛毛藻(Cladophora)是一種典型的大型絲狀藻,細胞結構呈分枝或不分枝的絲狀體,在淡水中分布廣泛。剛毛藻對營養(yǎng)鹽的利用范圍較廣,例如可溶性磷質量濃度為1.1～150.0 μg/L時,剛毛藻均可生長,因此從貧營養(yǎng)至富營養(yǎng)的水體中均有剛毛藻分布[9]。剛毛藻適度生長對于消耗水中營養(yǎng)鹽,維持水生態(tài)系統(tǒng)的平衡穩(wěn)定起積極作用,但是過度增殖則會抑制其他水生生物的生長,產(chǎn)生有害物質,破壞水質,給水生態(tài)系統(tǒng)帶來負面影響[10]。本研究以剛毛藻作為測試對象,分析鑭對剛毛藻生長代謝的影響,以及鑭對剛毛藻在不良環(huán)境中抗逆性的影響,以期為預測和評價鑭在水生態(tài)系統(tǒng)的殘留所造成的潛在生態(tài)影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

剛毛藻采自重慶市望月湖,經(jīng)鑒定為寡枝剛毛藻(Cladophoraoligoclona)。剛毛藻取回后先用自來水進行清洗,去除發(fā)黃變老部分,再置于光照培養(yǎng)箱中,使用望月湖湖水培養(yǎng)7 d后開展實驗,培養(yǎng)溫度為25 ℃,光照強度為4 000 lx,光暗比為12 h∶12 h。實驗用試劑均為分析純。

1.2 La3+對剛毛藻生長及代謝的影響實驗

參照HIGGINS等[11]的方法稱量剛毛藻鮮質量,稱量后向6個燒杯中分別放入4 g藻體,再加入1 L望月湖湖水,設置La3+質量濃度梯度分別為0.1、0.2、0.4、0.7、1.0 mg/L,另設置一組不添加La3+的對照組,每個處理設置3個平行。于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為25 ℃,光照強度為4 000 lx,光暗比為12 h∶12 h,每天定時調換燒杯在培養(yǎng)箱中的位置,使藻體受光照均勻。定時取樣測定葉綠素a(Chla)含量、光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)、可溶性糖和可溶性蛋白含量、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量。

1.3 La3+對剛毛藻抗逆性的影響實驗

La3+對剛毛藻抗強光特性的影響:向5個燒杯中分別放入4 g藻體,加入1 L望月湖湖水,設置La3+質量濃度為0.2 mg/L,光照強度梯度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 lx,光暗比為12 h∶12 h,另設置一組不添加La3+的對照組,每個處理設置3個平行。培養(yǎng)溫度為25 ℃,實驗周期為7 d,實驗結束時取樣測試藻細胞Chla含量和Fv/Fm。

La3+對剛毛藻抗過氧化氫特性的影響:向6個1 L的燒杯中分別放入4 g藻體,加入1 L望月湖湖水,設置La3+質量濃度為0.2 mg/L,過氧化氫梯度為0、0.2%(質量分數(shù),下同)、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%,另設置一組不添加La3+的對照組,每個處理設置3個平行。于光照培養(yǎng)箱中4 000 lx靜置培養(yǎng),光暗比為12 h∶12 h,培養(yǎng)溫度為25 ℃,實驗周期為7 d。實驗結束時取樣測試藻細胞Chla含量和Fv/Fm。

La3+對剛毛藻抗硫酸銅特性的影響:Cu2+梯度設置為0、2、4、6、8、10 mg/L。其余操作與抗過氧化氫特性的實驗相同。

1.4 指標測定

將所取剛毛藻放置于兩片吸水紙之間,均勻按壓吸去表面水分,稱量一定鮮質量的剛毛藻用于相關指標的測定。采用葉綠素熒光儀(Phyto-PAM)測定Fv/Fm;取30 mg剛毛藻,使用體積分數(shù)為90%的丙酮研磨破碎細胞后進行萃取,再采用分光光度法[12]測定Chla含量;取0.5 g剛毛藻加入5 mL生理鹽水,冰浴條件下研磨10 min制成勻漿液,轉移至離心管中于4 000 r/min離心10 min取上清液,再采用南京某生物工程公司的相應試劑盒測定可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量及CAT和POD活性。

2 結果與分析

2.1 La3+濃度對Chla含量的影響

Chla作為高等植物進行光合作用的主要光合色素,其含量直接反映了光合作用的強弱[13]。La3+對剛毛藻Chla的影響如圖1所示,低濃度La3+處理剛毛藻對其光合色素的合成具有一定的促進作用,0.2 mg/L La3+處理7 d,剛毛藻Chla含量比初始值提高29%,顯著高于對照組(P<0.05)。當使用較高質量濃度La3+(0.7、1.0 mg/L)處理后,尤其是1.0 mg/L的La3+處理后,藻體顏色發(fā)生明顯變化,初始藻體呈現(xiàn)鮮綠色,7 d后藻體色澤褪化,出現(xiàn)黃化現(xiàn)象;Chla含量也呈現(xiàn)明顯下降趨勢?？梢?La3+對剛毛藻生長的影響呈現(xiàn)“低促高抑”的毒物興奮效應。低濃度稀土元素可促進植物光合色素的合成,而高濃度稀土元素則呈現(xiàn)出顯著的重金屬毒性效應,光合色素含量顯著下降。

注:A0、A1、A2、A3、A5、A7分別為實驗開始后0、1、2、3、5、7 d的樣品編號,圖2至圖5同。圖1 La3+對剛毛藻Chla的影響Fig.1 Effect of La3+ on Chla content of Cladophora

2.2 La3+濃度對Fv/Fm的影響

Fv/Fm是植物光系統(tǒng)Ⅱ光合作用性能的重要參數(shù),是表征光合作用效率的重要指標[14]。La3+對剛毛藻Fv/Fm的影響如圖2所示,低濃度La3+對剛毛藻的光合作用效率具有一定提高促進作用,當La3+質量濃度為0.2 mg/L時,培養(yǎng)7 d剛毛藻的Fv/Fm比初始值提高了37%,顯著高于對照組(P<0.05);當使用較高質量濃度La3+(0.7、1.0 mg/L)處理后Fv/Fm明顯下降。通常低濃度鑭可促進植物體光系統(tǒng)Ⅱ蛋白復合體的活性,加快光合電子傳遞的速率,而高濃度鑭的毒性效應則抑制了光合作用效率[15]。

圖2 La3+對剛毛藻Fv/Fm的影響Fig.2 Effect of La3+ on Fv/Fm of Cladophora

2.3 La3+對可溶性糖和可溶性蛋白的影響

植物的糖代謝和光合作用密切相關,可溶性糖是光合作用的重要產(chǎn)物,是胞內有機物累積、儲存和運輸?shù)闹饕问?。同時可溶性糖具有維持胞內外滲透壓平衡、調控基因表達等重要功能,其含量能夠反映植物對不良環(huán)境的抵抗力水平[16]。植物可溶性蛋白大多是參與新陳代謝的酶蛋白,可溶性蛋白含量是評價藻類代謝功能的重要指標[17]。本研究中La3+對剛毛藻的可溶性糖和可溶性蛋白的影響如圖3所示,隨La3+濃度升高,可溶性糖含量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢,La3+質量濃度為0.2～0.4 mg/L時,藻細胞可溶性糖含量顯著高于對照組(P<0.05);La3+質量濃度為0.2 mg/L時,剛毛藻培養(yǎng)7 d后的可溶性糖含量比初始值提高37%,La3+濃度繼續(xù)升高,可溶性糖含量呈現(xiàn)下降趨勢。低濃度La3+的加入同樣提高了剛毛藻可溶性蛋白含量,La3+為0.2 mg/L時,可溶性蛋白最高可達6.6 mg/g,比初始值提高了21%?？梢?低濃度La3+對剛毛藻可溶性糖和可溶性蛋白的合成具有一定促進作用,該結論與文獻報道的稀土元素對高等植物和浮游藻類的常見生物效應一致[18],這種促進作用可能與稀土元素能夠刺激植物體內各種重要酶的活性,協(xié)調植物對營養(yǎng)元素的吸收,促進鈣調蛋白編碼基因的表達等因素有關[19-20]。

圖3 La3+對剛毛藻可溶性糖和可溶性蛋白的影響Fig.3 Effect of La3+ on soluble sugar and soluble protein content of Cladophora

2.4 La3+對CAT和POD活性的影響

CAT和POD是植物胞內的抗氧化酶,是清除胞內活性氧的重要成分,然而當植物受到嚴重脅迫時,抗氧化酶活性受到抑制,導致活性氧無法及時被清除,對植物細胞的生理功能造成危害甚至導致死亡[21]。因此,CAT和POD活性被用于反映植物抵抗逆境的能力。分析添加La3+對剛毛藻CAT和POD活性的影響,結果如圖4所示,0.1～0.4 mg/L La3+提高了CAT和POD活性。La3+質量濃度為0.2 mg/L時,剛毛藻培養(yǎng)7 d后CAT和POD活性分別為23.35、43.67 U/g,比初始值分別提高94%和78%。1.0 mg/L的La3+對CAT和POD活性均具有抑制效應,7 d后CAT和POD活性比初始值分別降低73%和54%。

圖4 La3+對剛毛藻CAT和POD活性的影響Fig.4 Effect of La3+ on CAT and POD activities of Cladophora

2.5 La3+對MDA的影響

MDA是植物細胞膜脂過氧化反應過程中一種重要產(chǎn)物,其含量高低表明過氧化程度,MDA常被用作反映植物體生理狀況和衰老的指標,通過測定MDA含量可評判細胞膜受損傷程度及受脅迫程度[22]。如圖5所示,0.1～0.2 mg/L的低質量濃度La3+處理后MDA含量隨培養(yǎng)時間延長有所降低,La3+質量濃度為0.2 mg/L時,剛毛藻培養(yǎng)7 d后MDA含量下降27%。1.0 mg/L La3+處理時MDA含量相比對照組顯著升高(P<0.05),培養(yǎng)7 d后MDA含量是對照組的2.4倍。結果表明,低濃度La3+能夠通過提高抗氧化酶活性,從而抑制了膜脂過氧化反應,MDA含量降低,細胞抗逆性得到增強;而高濃度La3+處理剛毛藻時,由于抗氧化酶活性降低,細胞膜脂過氧化作用加強,產(chǎn)生并積累了大量MDA,細胞膜脂過氧化作用對細胞正常生理功能將造成一定損傷,藻細胞抗逆能力減弱。

圖5 La3+對剛毛藻MDA的影響Fig.5 Effect of La3+ on MDA content of Cladophora

2.6 生理指標相關性分析

對0.2 mg/L La3+處理下剛毛藻的各項生理指標進行相關性分析,結果見表1。Fv/Fm、Chla含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、CAT活性和POD活性這些指標兩兩之間呈現(xiàn)不同程度的顯著正相關關系,MDA含量與其余指標大體呈現(xiàn)顯著負相關關系(P<0.05)?？梢?0.2 mg/L La3+對于藻細胞新陳代謝有著重要的積極影響,且各項生理指標的變化趨勢密切關聯(lián)。0.2 mg/L La3+作用下,藻細胞抗逆性提升,受損狀況減弱,有利于光合作用效率、蛋白質和糖的合成代謝功能提升。

表1 各生理指標相關性1)Table 1 Correlation of physiological indexes

2.7 La3+作用下剛毛藻抗逆性變化特征

光照強度是剛毛藻光合作用效率及光合色素合成的重要影響因素之一,對剛毛藻吸收氮、磷營養(yǎng)鹽的性能關系密切,剛毛藻對強光照敏感,強光照通常會對剛毛藻的生長代謝產(chǎn)生抑制作用,造成藻體黃化及機體功能的退化[23]。添加0.2 mg/L La3+對剛毛藻抗強光特性的影響如圖6所示,不同光照強度下,剛毛藻Chla含量和光合作用效率呈現(xiàn)差異。其中,在2 000～4 000 lx光照強度內,對照組剛毛藻的Chla含量和光合作用效率整體較為穩(wěn)定,藻體呈鮮綠色。而在光照強度高于4 000 lx時,Chla含量和光合作用效率隨光照強度的增強出現(xiàn)大幅下降,尤其是在10 000 lx強光照下,對照組Chla含量和Fv/Fm相比2 000 lx光照下分別降低39%和32%,藻體偏黃綠色。而添加La3+處理組中,不同光照強度下剛毛藻Chla含量和光合作用效率整體較為穩(wěn)定,即使在10 000 lx強光照下,Chla含量和Fv/Fm相比2 000 lx光照下分別降低22%和17%,Chla含量和Fv/Fm整體顯著高于對照組(P<0.05),藻體維持鮮綠色?？梢娞砑?.2 mg/L La3+能夠顯著增強剛毛藻對強光的抗性。

圖6 La3+對強光照脅迫下剛毛藻Chla和Fv/Fm的影響Fig.6 Effect of La3+ on Chla content and Fv/Fm of Cladophora under strong light stress

過氧化氫是一種環(huán)境友好型殺藻劑,在水環(huán)境中過氧化氫產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)具有強氧化性,與藻細胞接觸能夠氧化細胞膜脂、蛋白分子及光合色素等,從而殺傷藻細胞[24]。La3+對剛毛藻抗過氧化氫氧化特性的影響如圖7所示,過氧化氫處理 7 d,各濃度下對照組剛毛藻的生長均表現(xiàn)出抑制效應,且過氧化氫濃度越高,抑制作用越明顯;1.0%過氧化氫處理7 d對剛毛藻的抑制率最高,Chla含量和Fv/Fm相比未添加過氧化氫時分別降低72%和81%。0.2 mg/L La3+能夠明顯提高剛毛藻對過氧化氫的抗性,緩解過氧化氫對剛毛藻的殺傷作用,Chla含量和Fv/Fm相對穩(wěn)定。添加La3+能夠顯著提高CAT和POD這兩種抗氧化酶活性,從而迅速清除過氧化氫,降低過氧化氫對細胞的氧化破壞作用,從而提高了剛毛藻對過氧化氫的抗性。

圖7 La3+對過氧化氫脅迫下剛毛藻Chla和Fv/Fm的影響Fig.7 Effect of La3+ on Chla content and Fv/Fm of Cladophora under hydrogen peroxide stress

Cu2+對細胞生長代謝具有強烈的抑制作用,其作用機理復雜,通常對細胞質膜的轉運功能、光合作用、核酸代謝、碳氫化合物代謝以及光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞途徑均有著強烈的干擾效應,因此硫酸銅常被用作殺藻劑以控制水中藻類的過度生長[25]。Cu2+對剛毛藻的影響如圖8所示,2 mg/L Cu2+對對照組剛毛藻的生長具有一定的促生作用,而更高濃度的Cu2+對剛毛藻的Chla含量和光合作用效率均表現(xiàn)出抑制效應,且Cu2+濃度越高,抑制效果越明顯;10 mg/L Cu2+處理對剛毛藻的抑制率最高,Chla含量和Fv/Fm相比未添加硫酸銅時分別下降63%和69%。添加0.2 mg/L La3+條件下,2 mg/L Cu2+處理組對剛毛藻的生長仍舊具有一定的促生作用,而更高濃度的Cu2+呈現(xiàn)的抑制效應也強于對照組?？梢?添加La3+未能提高剛毛藻對高濃度Cu2+的抗性,甚至產(chǎn)生更強的抑制作用,這可能與La3+與Cu2+疊加的重金屬毒性效應以及Cu2+復雜的抑制機制有關。

圖8 La3+對硫酸銅脅迫下剛毛藻Chla和Fv/Fm的影響Fig.8 Effect of La3+ on Chla content and Fv/Fm of Cladophora under copper sulfate stress

3 結 論

(1) La3+對剛毛藻生長的影響呈現(xiàn)低濃度促進高濃度抑制的毒物興奮效應。采用0.2 mg/L的低質量濃度La3+處理剛毛藻7 d,剛毛藻的Chla含量、Fv/Fm、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、CAT活性和POD活性比初始值分別提高29%、37%、37%、21%、94%和78%,MDA下降27%。

(2) 0.2 mg/L La3+處理后剛毛藻各項生理指標的變化具有聯(lián)動性,Fv/Fm、Chla含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、CAT活性和POD活性之間呈不同程度的顯著正相關關系,上述指標與MDA含量大體呈顯著負相關關系(P<0.05)。

(3) 不同逆境下低濃度La3+對剛毛藻的抗逆性具有差異化影響,0.2 mg/L La3+能夠明顯增強剛毛藻對強光照(6 000～10 000 lx)和過氧化氫(0.2%～1.0%)的抗性,而在高質量濃度Cu2+(4～10 mg/L)下,0.2 mg/L的La3+導致剛毛藻所受到的損傷增強。