急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平變化及其與病情進(jìn)展的關(guān)系

李彥岑,龍志鵬,張 毅,馮剛?cè)A

急性腦梗死(ACI)是以局部腦組織出現(xiàn)缺血性壞死或軟化為主要特征的突發(fā)性疾病,目前臨床上主要采取急性期血管再通方案,通過盡快建立側(cè)支循環(huán)以挽救缺血半暗帶(ischemic penumbra,IP)區(qū)域大量處于休眠或半休眠狀態(tài)的腦細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞,達(dá)到改善病人神經(jīng)損傷的目的[1]。側(cè)支循環(huán)的形成機(jī)制較為復(fù)雜,與多種血管生成因子及相關(guān)信號軸有關(guān)[2]。其中血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)是目前已知的由內(nèi)皮細(xì)胞分泌、維持正常血管內(nèi)皮功能并參與血管重塑過程必不可少的一種調(diào)節(jié)因子[3],在缺血性腦卒中的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后過程中都扮演著重要角色[4]。但是血清Ang-1易受年齡、激素分泌、基礎(chǔ)性疾病等客觀因素的影響,作為急性腦梗死診斷和病情判斷指標(biāo)尚存在一定的局限性。miRNAs是真核生物細(xì)胞中普遍存在的一類具有保守序列和穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)的非編碼單鏈RNA分子,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成等過程。有研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)微小RNA(miR)-132表達(dá)可改善大鼠模型腦組織缺血性損傷,其機(jī)制可能與促進(jìn)Ang-1/Tie2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)缺血腦組織血管再生有關(guān)[5]。本研究擬觀察血清miR-132和Ang-1在急性腦梗死病人中表達(dá)水平的變化,探討二者與急性腦梗死疾病發(fā)生風(fēng)險及疾病進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2020年1月在我院進(jìn)行治療的105例急性腦梗死病人作為急性腦梗死組,其中合并高血壓48例,糖尿病32例,血脂異常50例,缺血性心臟病23例。納入標(biāo)準(zhǔn):1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[6],經(jīng)過頭顱CT/磁共振成像(MRI)證實(shí),按照TOAST法進(jìn)行分型;2)發(fā)病時間<72 h;3)入組前未接受相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):1)合并惡性腫瘤、心肌梗死、嚴(yán)重感染性疾病、肺源性心臟病者;2)既往有短暫腦缺血發(fā)作、腦梗死、腦外傷或神經(jīng)功能缺損者。同時選取同期在本院進(jìn)行體檢的健康志愿者90人作為對照組。急性腦梗死組中男72例,女33例;年齡37～75(53.18±12.21)歲。對照組中男56人,女34人;年齡40～68(50.75±11.03)歲。本研究經(jīng)過本地醫(yī)學(xué)倫理委員會同意,并且獲得病人或家屬自愿簽署的知情同意書。

1.2 分組方案

1.2.1 根據(jù)梗死面積分組

105例急性腦梗死病人依據(jù)梗死面積分組,≤1.5 cm2為小面積梗死亞組(55例),>1.5～3.0 cm2且累及1個解剖部位的小血管供血區(qū)為中面積梗死亞組(31例),>3.0 cm2且累及≥2個解剖部位的大血管供血區(qū)為大面積梗死亞組(19例)。

1.2.2 根據(jù)神經(jīng)功能缺損程度分組

依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院神經(jīng)功能缺損評分(National Institute Health Stroke Scale,NIHSS)[7]評定,≤15分為輕度亞組(43例),>15～30分為中度亞組(47例),>30分為重度亞組(15例)。

1.3 血清樣本收集

采集急性腦梗死組及對照組受試者的空腹肘靜脈血5 mL,以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min后,收集上層清液,置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測血清miR-132的表達(dá)水平

采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的miRNA Vana PA RIS試劑盒,按照說明書提取血清總RNA。采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的TaqMan miRNA試劑盒,對提取得到的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到cDNA。通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(miScript SYBR?Green PCR kit,德國QIAGEN公司)檢測miR-132的表達(dá)水平,內(nèi)參選擇小分子U6。通過2-△△Ct法測定miR-132的RNA相對表達(dá)量。

1.5 Ang-1表達(dá)水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清Ang-1的表達(dá)水平。人Ang-1試劑盒均購于美國R&D 公司,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較

急性腦梗死組與對照組受試者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、吸煙史、冠心病史比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),急性腦梗死組中飲酒史、高血壓和糖尿病均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組觀察對象臨床資料比較

2.2 兩組血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平比較

與對照組比較,急性腦梗死組病人血清miR-132[(0.77±0.39)與(1.00±0.38)]和Ang-1[(1.11±0.35)ng/mL與(1.41±0.40)ng/mL]表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 多因素Logistic回歸分析急性腦梗死發(fā)病的危險因素

以發(fā)生急性腦梗死作為因變量,將單因素分析存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入回歸方程,經(jīng)多因素Logistic回歸分析,高血壓病史和血清miR-132和Ang-1水平降低是急性腦梗死發(fā)病的危險因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析急性腦梗死發(fā)病的危險因素

2.4 急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平的關(guān)系

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析,急性腦梗死組病人血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.488,P<0.001)。詳見圖1。

圖1 血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平的相關(guān)性

2.5 急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平與疾病進(jìn)展的關(guān)系

隨著腦組織梗死面積增加,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平則逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著神經(jīng)功能缺損程度加重,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平則逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平與腦梗死面積和神經(jīng)功能缺損程度的關(guān)系

2.6 血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平對急性腦梗死的診斷價值

經(jīng)ROC曲線分析顯示,miR-132和Ang-1對急性腦梗死病人與健康人群具有一定的區(qū)分能力。miR-132作為診斷急性腦梗死病人生物標(biāo)志物的曲線下面積(AUC)為0.835[95%CI(0.762,0.910),P<0.05],敏感度為78.67%,特異度為73.64%;Ang-1作為診斷急性腦梗死病人生物標(biāo)志物的AUC為0.716[95%CI(0.616,0.735),P<0.05],敏感度為68.50%,特異度為59.60%。詳見圖3。

3 討 論

急性腦梗死屬于局部腦組織缺血性疾病,發(fā)病率、致死率和致殘率均較高,尤其是對于合并高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)性疾病病人,急性腦梗死發(fā)病風(fēng)險均高于健康人群[8]。本研究對納入的105例急性腦梗死病人疾病危險因素進(jìn)行初步評估,發(fā)現(xiàn)急性腦梗死組中飲酒史比例、高血壓病人比例和糖尿病病人比例均高于對照組,尤其是高血壓是急性腦梗死疾病發(fā)生的獨(dú)立危險因素。除此以外,血栓的形成、栓子脫落、血管壁斑塊形成、頸動脈狹窄等都與急性腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)[9]。急性腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,深入闡述急性腦梗死發(fā)病機(jī)制對于早期診斷、臨床治療和預(yù)后評估都有重大意義。

Astrup等[10]提出了“缺血半暗帶”理論,為日后急性腦梗死的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。由于缺血半暗帶區(qū)域存在大量待激活狀態(tài)的神經(jīng)元細(xì)胞,通過促進(jìn)側(cè)支循環(huán),改善局部病灶組織血流灌注,進(jìn)而達(dá)到改善病人預(yù)后的目的。近幾年,逐漸有學(xué)者提出了“神經(jīng)血管單元”的概念,由神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦細(xì)胞外基質(zhì)等組成,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、偶聯(lián)機(jī)制等共同參與神經(jīng)血管重塑[11]。同時多種細(xì)胞因子和miRNAs在其中也發(fā)揮著重要作用。血管生成素是一族分泌型的促血管生成因子,主要由血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞等血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞所分泌,可促使內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞間連接,在維持新生血管正常功能與結(jié)構(gòu)的同時,還可以重塑血管,增加分支,增大管徑,促使其成熟[12]。韋俊杰等[13]通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),Ang-1在急性腦梗死發(fā)病早期呈降低趨勢,缺血后3 d開始升高,持續(xù)時間約2周,該結(jié)果表明Ang-1主要參與急性腦梗死的中晚期血管生成。閆薪如等[14]研究表明,Ang-1的表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度以及90 d預(yù)后密切相關(guān)。近年來,研究顯示Ang-1可以通過多種途徑改善腦血流灌注,拯救缺血半暗帶神經(jīng)元,恢復(fù)腦缺血后神經(jīng)功能[15]。在本研究中,急性腦梗死組病人血清Ang-1水平低于對照組,并且隨著腦梗死面積的增加和神經(jīng)功能缺損程度的加重,急性腦梗死病人血清Ang-1表達(dá)水平逐漸降低。說明Ang-1在急性腦梗死發(fā)病初期以及疾病進(jìn)展過程中都發(fā)揮著重要作用,可以作為急性腦梗死早期診斷的參考指標(biāo)之一。miRNA表達(dá)水平失調(diào)與急性腦梗死的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān),由于多數(shù)miRNA位于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游,且具有穩(wěn)定的保守序列,組織表達(dá)特異性高,因此,有望成為多種疾病的早期診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。其中miR-132位于人第17號染色體,屬于內(nèi)皮細(xì)胞特異性miRNA,可誘導(dǎo)血管新生。陳澎等[5]研究表明,上調(diào)miR-132表達(dá)可以通過激活 Ang-1/Tie2信號軸促進(jìn)血管新生,從而改善腦缺血大鼠腦組織缺血性損傷。在本研究中急性腦梗死組病人血清miR-132水平低于對照組,隨著腦梗死面積的增加和神經(jīng)功能缺損程度的加重,急性腦梗死病人血清miR-132表達(dá)水平逐漸降低。推測可能是由于急性腦梗死病人出現(xiàn)急性局灶性腦組織缺血后,miR-132表達(dá)量降低可能是抑制Ang-1分泌或生物活性的重要原因。說明miR-132與急性腦梗死病情進(jìn)展也密切相關(guān)。經(jīng)ROC曲線分析,miR-132和Ang-1都有望成為急性腦梗死診斷的早期生物標(biāo)志物。但是尚需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,并對其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

綜上所述,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達(dá)水平均降低,且隨著腦梗死面積的增加和神經(jīng)功能缺損程度的加重,兩者表達(dá)水平逐漸下降,本研究可為選取有望成為急性腦梗死早期輔助診斷指標(biāo)提供依據(jù),以期為靶向治療藥物的開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。