lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人血清中的表達(dá)及其臨床意義

李文俊,王瑜芬

病毒性心肌炎是由病毒引起的原發(fā)性心肌炎癥,會(huì)導(dǎo)致心臟生理功能發(fā)生改變,包括心肌泵送力降低和心律異常,其臨床表現(xiàn)為非特異性,表現(xiàn)為乏力、呼吸急促、胸痛等,有時(shí)也表現(xiàn)出急性心力衰竭或室性心律失常等[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn),病毒性心肌炎病理表現(xiàn)主要為心肌呈彌漫性、炎性病變[2]。有研究報(bào)道,病毒性心肌炎初始表現(xiàn)為急性期,經(jīng)臨床治療后,病毒可被清除,但病毒感染介導(dǎo)的自身免疫性炎癥可能持續(xù)存在,導(dǎo)致病人發(fā)展為心力衰竭,甚至病情急劇惡化導(dǎo)致病人死亡[3]。因此,早期診斷病毒性心肌炎對(duì)于該病治療有十分重要的意義。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),非編碼RNA,包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA),在疾病的病理變化中扮演關(guān)鍵角色[4]。母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)已被確定是心臟纖維化的誘導(dǎo)因子[5]。微小RNA-223(microRNA-223,miR-223)已被證實(shí)涉及心肌細(xì)胞肥大、心臟纖維化等不同心臟病理過(guò)程[6]。Xue等[7]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3在病毒性心肌炎小鼠心臟組織中由于可抑制M2巨噬細(xì)胞極化而加重炎癥反應(yīng),此過(guò)程是通過(guò)下調(diào)miR-223表達(dá)來(lái)完成的。目前,lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人中是否發(fā)揮同樣作用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探究lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人血清中的表達(dá)情況并探討其對(duì)病毒性心肌炎的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年9月—2021年9月本院收治的急性期病毒性心肌炎病人43例為病毒性心肌炎組,男25例,女18例,年齡20～42(32.05±6.53)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):1)符合2001年版《關(guān)于成人急性病毒性心肌炎診斷參考標(biāo)準(zhǔn)》[8];2)入組前未接受激素治療;3)病人及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):1)患有心源性休克者;2)患有先天性心臟病、心瓣膜病者;3)患有肺、腎、肝系統(tǒng)疾病或血液系統(tǒng)疾病者;4)患有其他惡性腫瘤者。選擇同期在本院體檢的46名健康者為對(duì)照組,男26名,女20名,年齡20～40(31.85±6.21)歲。病毒性心肌炎組、對(duì)照組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

采集健康體檢者體檢當(dāng)日和病毒性心肌炎病人入院檢查時(shí)清晨空腹靜脈血6 mL,離心(4 ℃,3 500 r/min,15 min),留上清,凍存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血清中l(wèi)ncRNA MEG3和miR-223的mRNA表達(dá)

取上清液樣本于冰上解凍,用北京索萊寶科技有限公司的總RNA提取試劑盒提取總血清RNA,用日本Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit按照20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。美國(guó)ABI公司的7300 qRT-PCR儀對(duì)lncRNA MEG3和miR-223及內(nèi)參β-actin、U6進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。建立25 μL熒光反應(yīng)體系,每組樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,40 s;38個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt計(jì)算lncRNA MEG3和miR-223的mRNA相對(duì)表達(dá)量,引物購(gòu)自上海吉瑪合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)

用ELISA法檢測(cè)血清中肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)及白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)水平,操作步驟依據(jù)美國(guó)Abcam公司的CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)詳細(xì)步驟執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清lncRNA MEG3、miR-223的mRNA水平比較

與對(duì)照組比較,病毒性心肌炎組血清lncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)水平較高(P<0.05),miR-223相對(duì)表達(dá)水平較低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組血清lncRNA MEG3、miR-223的mRNA水平比較

2.2 兩組血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平比較

與對(duì)照組比較,病毒性心肌炎組血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平較高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 兩組血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平比較

2.3 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示,lncRNA MEG3與miR-223呈負(fù)相關(guān)(r=-0.647,P<0.05)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223相關(guān)性分析

2.4 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223與IL-1β、IL-6的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示,lncRNA MEG3與IL-1β、IL-6呈正相關(guān)(P<0.05),miR-223與IL-1β、IL-6呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 血清lncRNA MEG3、miR-223與IL-1β、IL-6相關(guān)性分析

2.5 血清cTnI、CK-MB、lncRNA MEG3、miR-223表達(dá)診斷病毒性心肌炎的診斷價(jià)值

ROC曲線顯示,cTnI、CK-MB診斷病毒性心肌炎的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.782[95%CI(0.683,0.880)]、0.757[95%CI(0.653,0.862)],其敏感度分別為79.10%、76.70%,特異度分別為76.10%、73.90%;血清lncRNA MEG3診斷病毒性心肌炎的AUC為0.902[95%CI(0.841,0.963)],其敏感度、特異度分別為90.70%、76.10%;血清miR-223診斷病毒性心肌炎的AUC為0.790[95%CI(0.696,0.885)],其敏感度、特異度分別為88.40%、60.90%;lncRNA MEG3與miR-223聯(lián)合診斷病毒性心肌炎的AUC為0.903[95%CI(0.841,0.966)],其敏感度、特異度分別為88.40%、82.60%,其中l(wèi)ncRNA MEG3與miR-223聯(lián)合診斷的AUC值高于cTnI、CK-MB、miR-223單獨(dú)診斷的AUC值(Z分別為2.056,2.377,1.977,P<0.05)。詳見(jiàn)圖2。

3 討 論

病毒性心肌炎主要是由腸道病毒、上呼吸道病毒等侵入心臟引起免疫反應(yīng)而造成心肌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的心肌炎性疾病[9]。隨著環(huán)境污染加重,病毒性心肌炎的發(fā)病率也逐年上升[10]。目前,病毒性心肌炎診斷主要依據(jù)病毒感染史、臨床特征、血清中心肌酶含量,但敏感性較低,臨床上診斷病毒性心肌炎的金標(biāo)準(zhǔn)為內(nèi)膜心肌活檢,但疾病早期階段很難獲得準(zhǔn)確的診斷[11]。當(dāng)心肌細(xì)胞受到病毒等因素侵犯時(shí),心肌組織受到損傷,心肌細(xì)胞中CK-MB、cTnI會(huì)迅速進(jìn)入血液中,使血清中CK-MB、cTnI升高[12]。本研究顯示病毒性心肌炎組血清cTnI、CK-MB水平較高于對(duì)照組,提示病毒性心肌炎病人存在心肌損傷。病毒性心肌炎病理變化為心肌細(xì)胞炎性浸潤(rùn)及壞死,有學(xué)者認(rèn)為其與病毒持續(xù)性感染、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等有關(guān)[13]。另有研究顯示,巨噬細(xì)胞極化在調(diào)節(jié)柯薩奇病毒B3(CVB3)誘導(dǎo)的病毒性心肌炎的心肌炎癥中起著至關(guān)重要的作用,抑制CVB3感染引起的M1型巨噬細(xì)胞的活化,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化發(fā)展,可改善病毒性心肌炎的心功能[14]。IL-1β、IL-6可由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,與機(jī)體炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)[15]。本研究顯示,病毒性心肌炎組血清IL-1β、IL-6水平明顯升高,提示病毒性心肌炎病人體內(nèi)存在炎癥。

lncRNA MEG3可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖,目前發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3可介導(dǎo)炎癥性腸病的免疫炎性反應(yīng)[16-17]。Xie等[18]研究顯示,腦出血的大鼠腦組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平明顯上升,lncRNA MEG3高表達(dá)通過(guò)抑制miR181b表達(dá)促進(jìn)腦出血引起的腦組織炎癥反應(yīng)。Li等[19]研究顯示,在肺部細(xì)菌感染小鼠肺上皮細(xì)胞中,lncRNA MEG3通過(guò)促進(jìn)IL-1β表達(dá)水平以促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)。本研究顯示,病毒性心肌炎組血清lncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組,且與IL-1β、IL-6呈正相關(guān),提示lncRNA MEG3可能參與急性期病毒性心肌炎發(fā)生。綜合上述研究推測(cè)lncRNA MEG3通過(guò)某種機(jī)制在急性期病毒性心肌炎中發(fā)揮促炎作用,影響急性期病毒性心肌炎的發(fā)生。miRNA可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及宿主-病原體反應(yīng)等,不僅在維持心臟組織功能發(fā)揮關(guān)鍵作用,也可與不同靶點(diǎn)結(jié)合,調(diào)控病毒誘導(dǎo)的心肌炎中病毒的復(fù)制和病毒感染細(xì)胞的存活能力[20]。miR-223是先天免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑,其表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致炎癥性疾病[21]。miR-223是巨噬細(xì)胞極化和活化的有效調(diào)節(jié)劑。Yuan等[22]研究顯示,miR-223高表達(dá)可通過(guò)直接靶向PBX/Knotted 1 Homeobox 1(Pknox1)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化,降低肥胖小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng),但伴隨著miR-223表達(dá)下降,其促使轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)蛋白表達(dá)水平增加,又導(dǎo)致IL-6表達(dá)增加,并放大炎癥反應(yīng)。Dang等[23]研究顯示,miR-223過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)顯示出抗炎特性,阻止脂多糖誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞極化,減輕敗血癥引起的小鼠心臟損傷。Zhang等[24]研究顯示,結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織miR-223上調(diào)會(huì)抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路,降低IL-6表達(dá)水平,抑制結(jié)腸炎。本研究顯示,病毒性心肌炎組血清miR-223相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組,且與IL-1β、IL-6呈負(fù)相關(guān),提示miR-223可能參與急性期病毒性心肌炎發(fā)生。血清lncRNA MEG3聯(lián)合miR-223診斷病毒性心肌炎的AUC為0.903,其敏感度、特異度分別為88.40%、82.60%,高于血清cTnI、CK-MB、miR-223診斷病毒性心肌炎的AUC,提示lncRNA MEG3聯(lián)合miR-223對(duì)病毒性心肌炎具有較好的診斷價(jià)值,且優(yōu)于血清cTnI、CK-MB指標(biāo)。Zhang等[25]研究顯示,lncRNA MEG3高表達(dá)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),并促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙,其可作為miR-223內(nèi)源性海綿來(lái)抑制miR-223表達(dá),從而發(fā)揮促炎作用。本研究顯示lncRNA MEG3與miR-223呈負(fù)相關(guān),提示lncRNA MEG3可能與miR-223作用,共同影響急性期病毒性心肌炎的發(fā)生。

綜上所述,病毒性心肌炎病人血清中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)上調(diào),miR-223表達(dá)下調(diào),lncRNA MEG3與miR-223具有密切關(guān)系,且二者均與炎性因子相關(guān),lncRNA MEG3聯(lián)合miR-223對(duì)病毒性心肌炎具有較好的診斷價(jià)值。但本研究尚未探究lncRNA MEG3、miR-223與急性期病毒性心肌炎發(fā)生機(jī)制的關(guān)系,后續(xù)仍需深入探究。