恒清Ⅴ號方對戊四唑誘導癲癇模型小鼠癲癇發(fā)作及神經細胞變性損傷的作用機制

鄧楚珺,孟勝喜,陳慧澤

癲癇(elilepsy,EP)是以反復性、發(fā)作性、短暫性、刻板性的中樞神經系統(tǒng)功能失常為特征的腦部神經元高度同步化且常具自限性的異常放電所導致的綜合征。由于異常放電神經元的位置不同,放電和擴散的范圍不等,病人發(fā)作可表現(xiàn)為感覺、運動、意識、精神、行為、自主神經功能障礙或兼而有之[1-2]。目前,全球約有7 000萬例以上的癲癇病人[3],我國約有900萬例以上的癲癇病人,其中活動性癲癇病人有500萬～600萬例,同時每年新發(fā)癲癇病人65萬～70萬例[4]。恒清Ⅴ號方是本課題組經過長期臨床實踐總結、歸納和驗證研發(fā)的治療癲癇中藥經驗復方?；谇捌谘芯砍晒?本實驗驗證中藥復方恒清Ⅴ號方的抗癲癇作用,并進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器

XY-1B系列精密電子天平(上海奕宇電子科技有限公司);5811型低溫高速離心機(Eppen-dorf公司);Epoch酶標儀(BioTek公司);超微量紫外可見分光光度計(Thermo Scientific公司);正置熒光顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司]。

1.1.2 藥物與試劑

丙戊酸鈉緩釋片[商品名:德巴金,生產企業(yè):賽諾菲(杭州)制藥有限公司,規(guī)格:500 g×30片,國藥準字H20010595,lot:BHG0357)];戊四唑(pentylenetetrazole,PTZ,上海源葉生物科技有限公司,lot:S48261);谷氨酸(Glu)試劑盒(lot:A089-1-1)和谷氨酰胺合成酶(GS)測定試劑盒(lot:A089-1-1),均購自南京建成生物工程研究所。超敏C反應蛋白(hs-CRP)、熱休克蛋白70(HSP-70)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海初態(tài)生物科技有限公司。GFAP、Fos抗體及免疫組織化學試劑盒,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。恒清Ⅴ號方組方:膽南星15 g,僵蠶10 g,全蝎2 g,石菖蒲15 g,蟬蛻10 g,川芎15 g。由上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院中藥房提供。按處方比例稱取以上中藥藥材,加10倍量水,浸泡0.5 h,煎煮3次,每次40 min,過濾,合并以上3次濾液,37 ℃水浴加熱濃縮,根據臨床實際用藥情況對藥液進行濃縮處理,并以中質量濃度匹配臨床的實際用藥濃度。中質量濃度濃縮至0.535 g/mL,恒清Ⅴ號方低劑量為0.267 g/mL,恒清Ⅴ號方中劑量為0.535 g/mL,恒清Ⅴ號方高劑量為1.070 g/mL,分別置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實驗動物

無特定病原體(SPF)級,雄性C57BL/6J小鼠110只,體質量(23±3)g,購自上海靈暢生物科技有限公司,動物生產許可證號:SCXK(滬)2018-003。飼養(yǎng)于上海吉凱基因化學技術有限公司動物房,全部動物預飼養(yǎng)2周,分別單籠喂養(yǎng)。光照/黑暗:12 h/12 h,隨意飲水和進食,溫度(22±2)℃,相對濕度(60±5)%。

1.2 方法

1.2.1 癲癇小鼠模型的建立

采用戊四唑(PTZ)點燃、的方法制備癲癇小鼠模型[5]。將112只C57BL/6J小鼠隨機分為正常組(18只)和造模組(94只)。造模組以35 mg/kg腹腔注射戊四唑,每2 d 1次。根據Racine分級表評估小鼠的癲癇發(fā)作級別[6](見表1)。連續(xù)3次注射戊四唑后,小鼠癲癇發(fā)作為4級或5級,提示為點燃成功。共點燃造模成功90只小鼠,將90只小鼠隨機分為模型組、恒清Ⅴ號方低劑量組、中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組,每組18只。

表1 Racine分級

1.2.2 給藥

丙戊酸鈉組給予丙戊酸鈉緩釋片溶液(丙戊酸鈉緩釋片加入生理鹽水中配制而成)灌胃,恒清Ⅴ號方低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予0.267、0.535、1.070 g/mL劑量的恒清Ⅴ號方灌胃,均為每日 2次。丙戊酸鈉緩釋片溶液濃度或恒清Ⅴ號方給藥濃度依據人和動物體表面積折算系數(shù)進行換算[7],計算結果為14.8 g/kg。正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,每日2次,各組均持續(xù)灌胃30 d。在灌胃給藥的過程中,除正常組外,其他各組繼續(xù)以35 mg/kg腹腔注射戊四唑,每5 d 1次。

1.2.3 癲癇發(fā)作級別與發(fā)作潛伏期

分別于治療后10 d、治療后20 d、治療后30 d時,觀察小鼠的癲癇發(fā)作級別和發(fā)作潛伏期。觀察方法:注射戊四唑后把小鼠放入透明箱中,連續(xù)觀察30 min,記錄小鼠的癲癇發(fā)作級別和癲癇發(fā)作潛伏期。癲癇發(fā)作潛伏期記錄為戊四唑注射完成后到2級發(fā)作的時間,若30 min內未發(fā)作,則潛伏期記為1 800 s;同時記錄最高癲癇發(fā)作級別。

1.2.4 血清hs-CRP和HSP-70水平

分別于治療前1 d、治療后30 d,將各組小鼠麻醉后,尾靜脈取血,離心后取其上清液,采用hs-CRP、HSP-70的ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中的hs-CRP和HSP-70水平。

1.2.5 Fluoro-Jade B(FJB)染色檢測海馬神經元損傷

治療30 d后,每組小鼠中隨機選取6只,然后麻醉、多聚甲醛灌注、取腦、固定、切片、脫蠟、水洗、加入FJB綠色熒光探針、DAPI染核、沖洗、吹干、透明、封片、切片,待熒光顯微鏡觀察,采集圖像以Image J軟件計數(shù)FJB陽性神經元數(shù)量。

1.2.6 大腦皮層及海馬Glu含量等水平

治療30 d后,各組余下的小鼠中均隨機選取6只。然后麻醉,冰上去除嗅球、小腦及低位腦干,分離大腦皮層、海馬-80 ℃冰箱保存。按體質量1∶9加入提取液,4 000 r/min離心10 min,取上清于冰上待測。分別按照Glu和GS試劑盒說明書測定小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量和GS活性。治療30 d后,各組余下的6只小鼠,麻醉取腦分離海馬組織,沖洗干凈后平均分為2部分。一部分用多聚甲醛固定石蠟包埋、切片、烤片等。采用GFAP、Fos抗體及免疫組織化學試劑盒進行染色冰封片。40×倍鏡下觀察、拍照。參照相關標準[8]的內容進行陽性評價,并計算陽性得分,最終得分=顏色得分+陽性細胞占比得分。余下的另外一部分制備成組織勻漿,采用hs-CRP、HSP-70的ELISA試劑盒檢測各組小鼠海馬組織中的hs-CRP和HSP-70水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠給藥后不同時間點癲癇發(fā)作級別及癲癇發(fā)作潛伏期比較

給藥10 d時,與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05)。分別在給藥20、30 d時,與模型組比較,各用藥組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05)。詳見表2、表3。

表2 各組小鼠給藥后不同時間點癲癇發(fā)作級別比較 單位:級

表3 各組小鼠給藥后不同時間點癲癇發(fā)作潛伏期比較 單位:s

2.2 各組小鼠給藥前后血清hs-CRP、HSP-70水平比較

與給藥前比較,各用藥組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組小鼠給藥前后血清hs-CRP、HSP-70水平的比較

2.3 各組小鼠給藥后30 d海馬組織GFAP、Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平比較

與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組給藥后30 d海馬組織GFAP、Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平比較

2.4 各組小鼠給藥后30 d海馬CA1區(qū)神經元變性情況比較

與正常組比較,模型組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量增多(P<0.01);與模型組比較,各用藥組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量均減少(P<0.05或P<0.01)。與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組給藥后30 d海馬CA1區(qū)神經元變性情況比較 單位:個

2.5 各組小鼠給藥30 d后大腦皮層、海馬Glu含量及GS活性比較

與正常組比較,模型組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量升高,GS活性下降(P<0.01);與模型組比較,各用藥組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01)。與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05)。詳見表7。

表7 各組給藥后30 d大腦皮層、海馬Glu含量和GS活性比較

3 討 論

癲癇在中醫(yī)學中隸屬于“癲疾”“癇證”等范疇,其病因與痰、火、驚、風、氣關系密切,特別是以痰邪作祟為主。肝風內動、痰瘀互結是癲癇的宿根,因此,息風化痰、活血化瘀應作為本病的主要治法。

癲癇的發(fā)生與炎癥機制密切相關,hs-CRP可作為癲癇的生物學標志物之一[9]。熱休克蛋白(HSP)與癲癇進展有關,癲癇病人神經細胞受損后,其變性蛋白質可誘導HSP-70的生成[10],在癲癇發(fā)作時也可見到HSP-70的聚集[11]。Glu是中樞神經系統(tǒng)中主要神經遞質,被星形膠質細胞攝取并轉化成無神經元毒性的谷氨酰胺,谷氨酰胺重新被運回到神經元,可作為神經遞質合成的前體物質[12],谷氨酰胺合成酶活性降低則可造成細胞外液中Glu的蓄積,從而誘發(fā)癲癇。

恒清Ⅴ號方是經過長期臨床實踐總結、歸納和驗證的治療癲癇療效確切的中藥經驗復方,恒清Ⅴ號方全方共同起到息風化痰、定驚、活血化瘀之效,從而有效治療癲癇。本研究結果顯示,與給藥10 d時比較,給藥20 d時的恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均縮短(P<0.05或P<0.01);與給藥20 d時比較,給藥30 d時的恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均漸縮短(P<0.05或P<0.01)。給藥10、20、30 d時,在相同的給藥時間,與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均縮短(P<0.05)。這表明恒清Ⅴ號方給藥時間越長,癲癇模型小鼠的癲癇發(fā)作級別越低,癲癇發(fā)作潛伏期越長;恒清Ⅴ號方給藥劑量越大,癲癇模型小鼠的癲癇發(fā)作級別越低,癲癇發(fā)作潛伏期越長。

與模型組比較,各用藥組小鼠的血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平、海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分均降低,海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少,大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平、海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分均降低,海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少,大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平、海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分均降低,海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少,大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01)。結果表明,恒清Ⅴ號方可以降低模型小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP和HSP-70水平,升高GS活性,促進Glu的轉化,降低Glu的含量。其作用與劑量有一定關系。

恒清Ⅴ號方可以改善戊四唑誘發(fā)的癲癇模型小鼠癥狀,減輕其海馬CA1區(qū)神經細胞變性損傷,其作用與劑量呈正相關,作用機制可能是與恒清Ⅴ號方促進癲癇小鼠腦組織Glu的轉化、降低血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平有關。