心安Ⅰ號膠囊對動脈粥樣硬化模型大鼠血管炎癥及PI3K/AKT/GRP78信號通路的作用機(jī)制研究

王久和,張 晶,李彬彬,王慧敏

動脈粥樣硬化(AS)是炎性因子及趨化因子等表達(dá)升高導(dǎo)致的一系列病理改變[1]。炎癥反應(yīng)存在于AS疾病發(fā)生發(fā)展的各個階段,核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)在AS疾病中表達(dá)升高,其激活可以加快脂質(zhì)因子、炎性細(xì)胞因子表達(dá),提高血管炎癥水平,促進(jìn)斑塊進(jìn)展[2]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是目前研究較廣泛的信號通路,該信號通路可參與AS的發(fā)生發(fā)展,且通過抑制PI3K/AKT激活可有效減少AS的形成[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)可貫穿AS發(fā)展的始終,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的新生肽鏈中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78抗原(GRP78)表達(dá)激活后可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。ERS可通過增加巨噬細(xì)胞凋亡而加重AS斑塊的形成[5]。因此,減少AS過程中的ERS對于改善疾病意義重大。中醫(yī)學(xué)中無AS之稱,但根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸屬于“眩暈”“健忘”“癡呆”“胸痹”等范疇,病機(jī)與氣血失養(yǎng)、腎精虧虛及情志失調(diào)等相關(guān),建議采用健脾益氣、滋陰養(yǎng)血及補(bǔ)益肝腎為主的方法治療[6]。心安Ⅰ號膠囊是用于治療冠心病心律失常的中成藥,具有活血、養(yǎng)陰、通絡(luò)的作用[7]。本研究探討心安Ⅰ號膠囊對AS大鼠血管炎癥及PI3K/AKT/GRP78信號通路的影響,為AS疾病的治療及機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(中國天津安諾瑞康生物,批號:208180418),二氨基聯(lián)苯胺3(DBA)顯色液(中國北京索萊寶科技,批號:20181120),磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Santa Curz),增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒(中國上海碧云天生物,批號:82417170930),辣根酶標(biāo)記羊抗兔抗體IgG(中國北京中山金橋生物,批號:136080),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗(中國上海生工生物,批號:1914526843);PI3K單抗、AKT單抗及GRP78單抗(中國武漢博歐特生物科技有限公司,批號:orb137259,10763-T16,102056-T40-50),C2500-R-230V型微型高速離心機(jī)(美國labnet);DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYCZ-40型電泳儀電源(中國北京六一儀器廠生產(chǎn))。

1.2 藥物

心安Ⅰ號膠囊為我院院內(nèi)制劑,由黃芪、炙甘草、麥冬、丹參、玉竹組成,經(jīng)水提取、濃縮、干燥后低溫保存,每克含有生藥2.5 g;阿司匹林購自廣東九明制藥有限公司,每片0.3 g,國藥準(zhǔn)字:H44021139。

1.3 動物模型的構(gòu)建

60只4～5周齡健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量180～200 g,購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,動物許可證號:SYXK(粵)2020-0011。5只1籠,在23 ℃、濕度50%左右環(huán)境中飼養(yǎng)。大鼠飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為假手術(shù)對照(Sham)組、AS組、心安Ⅰ號膠囊低劑量組、心安Ⅰ號膠囊中劑量組、心安Ⅰ號膠囊高劑量組、阿司匹林組。參考文獻(xiàn)[8]構(gòu)建AS動物模型,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,于頸部中段開3 mm切口,暴露左側(cè)頸部總動脈,2根4號絲線結(jié)扎頸部遠(yuǎn)端動脈,結(jié)扎處做V形切口,將球囊沿著切口處插入主動脈,擴(kuò)張球囊,放松絲線保證血流暢通,抽離球囊,結(jié)扎動脈近端,抽去絲線,確保血流暢通后檢測頸動脈是否充盈搏動良好。碘附消毒后縫合皮膚,腹腔注射青霉素16×104U以預(yù)防感染。術(shù)后7 d內(nèi)喂養(yǎng)普通飼料,術(shù)后第8～14 d給予高脂飼料,Sham組僅結(jié)扎遠(yuǎn)端頸部動脈。飼養(yǎng)6周后,大鼠總膽固醇(TC)及三酰甘油(TG)水平升高及HE染色出現(xiàn)粥樣硬化斑塊,說明造模成功[7,9]。

1.4 干預(yù)方法

建模成功后,心安Ⅰ號膠囊低劑量組、心安Ⅰ號膠囊中劑量組、心安Ⅰ號膠囊高劑量組分別給予0.47、0.94、1.88 g/kg的心安Ⅰ號膠囊藥液灌胃。阿司匹林組給予0.25 g/kg阿司匹林藥液灌胃,Sham組及AS組大鼠灌胃等量蒸餾水,每日1次,連續(xù)灌胃7 d。

1.5 ELISA檢測各組大鼠血清炎性因子水平

采集各組大鼠尾靜脈血1.5 mL,分3次抽取,每次0.5 mL,3 500 r/min,離心10～15 min,離心半徑12 cm,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,檢測白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)及血管內(nèi)皮黏附分子-1(VCAM-1)的含量。

1.6 各組大鼠血脂水平檢測

采集各組大鼠尾部靜脈血1 mL,采用AU400全自動生化分析儀檢測TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。

1.7 頸動脈病理學(xué)變化

處死大鼠后迅速取出損傷部位動脈組織,使用4%的多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脫水,包埋劑處理后切片,蘇木精染色3 min,清水沖洗2 min至返藍(lán),1%鹽酸處理后采用伊紅試劑復(fù)染3 min,清水沖洗2 min,梯度乙醇脫水,透明處理,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.8 免疫組化檢測頸動脈組織NF-κB及NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)

取頸部動脈組織,石蠟切片,常規(guī)脫蠟脫水后,采用PBS沖洗3次,間隔5 min,37 ℃下用羊血清封閉60 min,加入NF-κB(1∶500)及NF-κB p65(1∶500)一抗,4 ℃下孵育24 h,加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000),孵育30 min,沖洗后加入50 μL的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物,DBA顯色,沖洗,終止顯色,透明、封片,選擇5個不重復(fù)視野觀察陽性細(xì)胞數(shù),細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.9 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測頸動脈組織PI3K、AKT、GRP78蛋白表達(dá)

取冰凍頸動脈組織,4 ℃解凍后,冰上勻漿提取蛋白,雙辛可寧酸(BCA)法檢測蛋白。取100 μg蛋白進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜,加入1抗PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、GRP78(1∶500)及內(nèi)參GAPDH(1∶2 500),4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫孵育3 h,增強(qiáng)發(fā)光法染色,ECL化學(xué)發(fā)光試系統(tǒng)JY-Clear分析蛋白值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清炎性因子水平比較

與Sham組比較,AS組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1水平升高(P<0.05);與AS組比較,心安Ⅰ號膠囊低、中、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1水平降低(P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05);心安Ⅰ號膠囊高劑量組與阿司匹林組TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清炎性因子水平比較

2.2 各組大鼠血脂水平比較

與Sham組比較,AS組大鼠血清TG、TC及LDL-C水平升高,HDL-C水平降低(P<0.05);與AS組比較,心安Ⅰ號膠囊低、中、高劑量組TG、TC及LDL-C水平降低,HDL-C水平升高(P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05);心安Ⅰ號膠囊高劑量組與阿司匹林組TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血脂水平比較 單位:mmol/L

2.3 各組大鼠頸動脈組織病理形態(tài)比較

Sham組大鼠頸部動脈壁未見增厚,未見斑塊形成及損傷脫落;AS組大鼠動脈壁有斑塊蓄積,同時出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶、血管內(nèi)皮損傷及壞死組織沉積;心安Ⅰ號膠囊低劑量組存在稍許的動脈壁增厚,細(xì)胞排列整齊度較差;心安Ⅰ號膠囊中劑量組未見壞死細(xì)胞,增生纖維組織有所改善;心安Ⅰ號膠囊高劑量組及阿司匹林組未見壞死細(xì)胞,排列整齊,結(jié)構(gòu)完整。詳見圖1。

圖1 各組大鼠頸動脈組織病理形態(tài)變化(HE染色,×400)

2.4 各組大鼠頸動脈組織NF-κB及NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)比較

與Sham組比較,AS組大鼠NF-κB、NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05);與AS組比較,心安Ⅰ號膠囊低、中、高劑量組NF-κB、NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05);心安Ⅰ號膠囊高劑量組與阿司匹林組NF-κB、NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3、圖2。

圖2 各組大鼠頸動脈組織NF-κB及NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)(DAB染色,×400)

表3 各組大鼠頸動脈組織NF-κB及NF-κB p65陽性細(xì)胞數(shù)比較 單位:%

2.5 各組大鼠PI3K、AKT、GRP78蛋白水平比較

與Sham組比較,AS組大鼠PI3K、AKT、GRP78蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與AS組比較,心安Ⅰ號膠囊低、中、高劑量組PI3K、AKT、GRP78蛋白表達(dá)降低(P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05);心安Ⅰ號膠囊高劑量組與阿司匹林組PI3K、AKT、GRP78蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4、圖3。

圖3 各組大鼠PI3K、AKT、GRP78蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組大鼠PI3K、AKT、GRP78蛋白表達(dá)比較

3 討 論

AS屬于血管炎性疾病,是脂質(zhì)因子及炎性細(xì)胞大量聚集損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,損傷的內(nèi)皮細(xì)胞釋放化學(xué)物質(zhì),吸引白細(xì)胞和血小板進(jìn)入血管壁,并逐漸沉積在損傷的部位促進(jìn)血管管腔狹窄[10]。本研究結(jié)果顯示,AS大鼠外周血中TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1水平升高,與動脈內(nèi)壁的炎性細(xì)胞浸潤相關(guān),并可促進(jìn)疾病進(jìn)展,而采用不同劑量的心安Ⅰ號膠囊干預(yù)后均降低,表明心安Ⅰ號膠囊具有較好的抗炎作用,且療效隨藥物劑量的升高而增加。AS導(dǎo)致的血管狹窄與局部炎癥紊亂有關(guān),TNF-α、IL-6、IL-1β為常見的炎性因子,在AS發(fā)生發(fā)展過程中均呈高表達(dá)狀態(tài),并可通過激活NF-κB增加炎癥反應(yīng)[11]。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答密切相關(guān),激活的NF-κB可以誘導(dǎo)IL-6、TNF-α、黏附分子等的產(chǎn)生,這些炎性因子可引起動脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、炎性細(xì)胞的浸潤以及斑塊的形成,進(jìn)一步加劇AS的發(fā)展[12]。阿司匹林作為一種非甾體抗炎藥,主要通過抑制環(huán)氧化酶和前列腺素的合成發(fā)揮抗炎作用,還可以抑制血小板聚集,從而防止血栓形成,研究發(fā)現(xiàn),阿司匹林可以通過抑制NF-κB炎癥通路發(fā)揮抗炎作用[13]。心安Ⅰ號膠囊是在經(jīng)典古方甘草湯及生脈飲的基礎(chǔ)上衍生的中藥制劑,主要由黃芪、炙甘草、麥冬、丹參、玉竹等組成,其中,黃芪滋補(bǔ)正氣,炙甘草補(bǔ)氣、散寒,麥冬養(yǎng)陰生津、安神,玉竹潤肺、養(yǎng)胃生津[13]。心安Ⅰ號膠囊中黃芪為君藥,化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,包含皂苷類、多糖類及黃酮類等,生物學(xué)活性較廣,對心血管疾病的應(yīng)用價值較高。梁榮壽等[14]研究顯示,在損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中采用黃芪注射液干預(yù)后,IL-6及ICAM-1等炎性因子表達(dá)降低,推測是通過抑制炎性因子水平而發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。炙甘草湯是治療陰血陽氣虛弱、心脈失養(yǎng)的經(jīng)典方,研究表明,心肌纖維化大鼠外周血TNF-α過表達(dá)可減少心臟成纖維細(xì)胞的增殖,進(jìn)而抑制心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展,其機(jī)制與炙甘草湯可下調(diào)NF-κB表達(dá)相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,AS大鼠外周血TG、TC及LDL-C水平升高,HDL-C降低,而采用心安Ⅰ號膠囊干預(yù)后,TG、TC及LDL-C水平降低,HDL-C升高,說明心安Ⅰ號膠囊可改善血脂紊亂。Nakagawa等[16]研究表明,AS與血脂水平異常相關(guān),表現(xiàn)為TG、TC、LDL-C升高,HDL-C降低。AS病人機(jī)體血脂紊亂,TG、TC、LDL-C升高,HDL-C降低,當(dāng)脂質(zhì)紊亂改善后,斑塊的產(chǎn)生及脫落將減少。心安Ⅰ號膠囊中丹參可抑制血小板聚集,改善血液循環(huán)[17];炙甘草可抗血脂并擴(kuò)張血管而抑制斑塊形成[18];黃芪中的黃酮類可抗氧化減輕氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮損傷[19]。

PI3K/AKT是一條重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路,參與調(diào)控多種細(xì)胞生理功能和代謝過程。研究表明,PI3K/AKT通路能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,參與調(diào)控炎性因子的產(chǎn)生和釋放,從而促進(jìn)AS的發(fā)生[20]。AS發(fā)生過程中PI3K/AKT可與NF-κB結(jié)合而加快病理損傷,并認(rèn)為抑制PI3K/AKT/NF-κB活性可減輕血管炎癥反應(yīng)[21]。心安Ⅰ號膠囊對PI3K/AKT/NF-κB具有抑制作用。閻卉芳等[22]研究表明,在球囊導(dǎo)管損傷導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增加,PI3K/AKT激活而加快動脈損傷,單獨(dú)使用黃芪或與當(dāng)歸配伍均可以抑制PI3K/AKT磷酸化而改善血管內(nèi)皮損傷,從而發(fā)揮血管內(nèi)皮保護(hù)作用。GRP78是一種分子伴侶蛋白,廣泛存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。GRP78能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,參與動脈內(nèi)膜的增厚和斑塊形成,抑制其表達(dá)而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[23]。牛曉峰等[24]研究表明,黃芪總黃酮可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,降低GRP78表達(dá)而改善心肌炎小鼠的心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,心安Ⅰ號膠囊可通過抑制PI3K/AKT/GRP78活性,降低AS大鼠血管炎癥損傷及脂質(zhì)紊亂且呈隨劑量依賴性。