特應(yīng)性皮炎外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征及其在度普利尤單抗療效預(yù)測(cè)中的應(yīng)用

王鈺，李巍

作者單位：200040 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

1 背景

特應(yīng)性皮炎是一種高度異質(zhì)性的炎癥性皮膚病[1]，其特征為Th2細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[2]，其他Th細(xì)胞亞群(如Th1、Th17和Th22細(xì)胞)也有不同程度的參與[3-6]。除T細(xì)胞外，2型先天淋巴樣細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞也參與了AD的發(fā)病[7-8]。深入探討AD分子表型可以為闡明發(fā)病機(jī)制、評(píng)估預(yù)后和預(yù)測(cè)治療反應(yīng)提供線索。

2 方法

本研究納入來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院門診56例中重度成年AD患者，根據(jù)Hanifin &Rajka標(biāo)準(zhǔn)診斷[9]AD?；颊呔邮芏绕绽葐慰怪委煟唧w給藥方法為在負(fù)荷劑量600 mg后，每隔一周自行皮下給予度普利尤單抗300 mg治療。采用濕疹面積及嚴(yán)重程度指數(shù)(eczema area and severity index，EASI)和特應(yīng)性皮炎嚴(yán)重程度評(píng)分(Scoring Atopic Dermatitis，SCORAD)評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度。在基線和治療16周后，對(duì)患者進(jìn)行疾病嚴(yán)重度評(píng)估并收集血液樣本。此外，本研究招募了30名無(wú)特應(yīng)性或其他疾病史的健康志愿者作為健康對(duì)照。

對(duì)35例來(lái)自AD患者基線和16周度普利尤單抗后的PBMCs樣本，以及30名健康對(duì)照的PBMCs樣本進(jìn)行RNA測(cè)序，針對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行差異基因分析及富集分析。并使用WGCNA分析探尋對(duì)度普利尤單抗療效有預(yù)測(cè)作用的基因，在另外21例AD患者中進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩個(gè)基因的預(yù)測(cè)能力。

3 結(jié)果

3.1 AD患者PBMCs轉(zhuǎn)錄組特征分析

將進(jìn)行測(cè)序的100例樣本分為健康對(duì)照組(NC組)，AD患者基線組(AD組)及AD患者度普利尤單抗治療后組(AD-dupi組)，使用IPA分析(ingenuity pathway analysis)進(jìn)行富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD的失調(diào)通路主要與免疫和炎癥通路有關(guān)。與NC組相比，AD組表現(xiàn)出增強(qiáng)的2型炎癥，具體表現(xiàn)為Th2通路及IL-13信號(hào)通路的上調(diào)；此外，還發(fā)現(xiàn)AD患者IL-8信號(hào)通路上調(diào)，而NK細(xì)胞信號(hào)通路下調(diào)。度普利尤單抗治療后，Th2通路和IL-8信號(hào)通路在AD-dupivs.NC中不再富集(圖1)。

圖1 差異基因鑒定及通路富集分析A.NC組與AD組(左)、AD組與AD-dupi組(右)之間的差異基因火山圖；B.基于NC、AD和AD-dupi組所有檢測(cè)基因的主成分分析；C，D.NC組與AD組(C)、AD組與AD-dupi組(D)之間的前20條IPA富集通路NC：正常對(duì)照；AD：特應(yīng)性皮炎組；AD-dupi：度普利尤單抗治療組

還使用GSVA(gene set variation analysis)方法定量分析三組中各Th信號(hào)通路及NK細(xì)胞信號(hào)通路。發(fā)現(xiàn)在AD組中Th2/Th22通路、Th17抗菌肽相關(guān)基因以及天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)豐度上調(diào)，而TGF-β信號(hào)和NK細(xì)胞信號(hào)下調(diào)。度普利尤單抗治療后，Th2細(xì)胞因子受體表達(dá)的增加被逆轉(zhuǎn)，而Th2細(xì)胞因子表達(dá)量并沒(méi)有顯著變化。另外Treg相關(guān)IL-10信號(hào)通路及Tr1細(xì)胞豐度在治療后存在一定程度回升(圖2)。

3.2 AD患者PBMCs轉(zhuǎn)錄組WGCNA分析

為了從復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中探尋與度普利尤單抗療效相關(guān)的基因，使用WGCNA分析將35例AD患者治療前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分組為基因共表達(dá)模塊。一共鑒定出10個(gè)基因模塊，其中2個(gè)基因模塊在度普利尤單抗治療后發(fā)生顯著變化，且與度普利尤單抗療效相關(guān)：黑色模塊基因在治療后表達(dá)顯著升高，其基線表達(dá)量與基線嚴(yán)重程度及度普利尤單抗療效呈負(fù)相關(guān)，而綠色模塊的結(jié)果正好相反。重點(diǎn)分析這兩個(gè)基因模塊，使用這兩個(gè)模塊內(nèi)的基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，選擇在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)內(nèi)且與療效指標(biāo)具有較強(qiáng)相關(guān)性的核心基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。由此篩選出了黑色模塊的核心基因MAP2K3和綠色模塊核心基因UBE2L3進(jìn)行具體分析驗(yàn)證(圖3)。

圖3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析A.模塊特征基因與外部臨床特征的關(guān)系；B.黑色模塊(上)和綠色模塊(下)與EASI75基因顯著性的相關(guān)性散點(diǎn)圖；C.黑色模塊(上)和綠色模塊(下)內(nèi)基因的信號(hào)通路富集

3.3 MAP2K3和UBE2L3具有一定度普利尤單抗療效預(yù)測(cè)價(jià)值

在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中，MAP2K3和UBE2L3與療效指標(biāo)具有較強(qiáng)相關(guān)性：基線MAP2K3表達(dá)量與治療后EASI評(píng)分的下降百分比呈顯著負(fù)相關(guān)，而基線UBE2L3表達(dá)量與治療后EASI評(píng)分的下降百分比呈顯著正相關(guān)(MAP2K3：r=-0.44，P=0.009；UBE2L3：r=0.41，P=0.015)。以EASI75為結(jié)局變量進(jìn)行ROC分析，這兩個(gè)基因均具有較高AUC值(MAP2K3：AUC=0.819；UBE2L3：AUC=0.796)。進(jìn)一步以EASI評(píng)分下降百分比為結(jié)局變量進(jìn)行線性回歸也證實(shí)，較低水平的MAP2K3基線表達(dá)量或較高水平的UBE2L3基線表達(dá)量的患者更容易獲得度普利尤單抗治療較好的療效(MAP2K3：β=-0.41，P=0.021；UBE2L3：β=0.41，P=0.027)(圖4)。

圖4 度普利尤單抗療效相關(guān)模塊分析A、B.利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的黑色模塊(A)和綠色模塊(B)的核心基因(Hubgene)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)；C.黑色模塊中核心基因MAP2K3基線表達(dá)量與EASI減少百分比的散點(diǎn)圖；D.MAP2K3預(yù)測(cè)EASI75的ROC曲線；E.綠色模塊中核心基因UBE2L3基線表達(dá)量與EASI減少百分比的散點(diǎn)圖；F.UBE2L3預(yù)測(cè)EASI75的ROC曲線；G.以EASI減少百分比為結(jié)局變量的MAP2K3及UBE2L3的線性回歸分析(經(jīng)SCORAD調(diào)整)ROC：受試者工作特征曲線；AUC：曲線下面積

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，在其余21例AD患者中使用qPCR的方法檢測(cè)MAP2K3和UBE2L3的基線表達(dá)量，并將其與療效指標(biāo)進(jìn)行分析。同樣發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因基線表達(dá)量與療效顯著相關(guān)，ROC分析中兩基因均具有較高AUC值，線性回歸分析也證實(shí)了以上兩基因具有一定的療效預(yù)測(cè)能力。

圖5 MAP2K3和UBE2L3在另外21例AD患者中作為度普利尤單抗療效預(yù)測(cè)因子的qRT-PCR驗(yàn)證A.EASI75和未達(dá)到EASI75的患者M(jìn)AP2K3基線表達(dá)量的比較；B.MAP2K3基線表達(dá)量與EASI減少百分比的散點(diǎn)圖；C.MAP2K3預(yù)測(cè)EASI75的ROC曲線；D.UBE2L3基線表達(dá)量在EASI75和未達(dá)到的患者中的比較；E.UBE2L3基線表達(dá)量與EASI減少百分比的散點(diǎn)圖；F.UBE2L3預(yù)測(cè)EASI75的ROC曲線；G.以EASI減少百分比為結(jié)局變量的MAP2K3及UBE2L3的線性回歸分析(經(jīng)SCORAD調(diào)整)

4 討論

本研究首次報(bào)道AD患者PBMCs轉(zhuǎn)錄組特征，及其在度普利尤單抗治療后的變化，為揭示AD發(fā)病機(jī)制提供線索；同時(shí)，本研究也利用WGCNA分析，發(fā)掘了兩個(gè)可能對(duì)度普利尤單抗療效有預(yù)測(cè)作用的分子。然而，本研究也具有一定的局限性，PBMCs作為血液中單個(gè)核細(xì)胞的混合物，包括了T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞，通過(guò)PBMCs轉(zhuǎn)錄組辨別其中細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組特征較困難；另外，本研究測(cè)序隊(duì)列及驗(yàn)證隊(duì)列樣本量都較小，所挖掘的預(yù)測(cè)分子需要在更大的隊(duì)列進(jìn)一步驗(yàn)證其療效預(yù)測(cè)能力。