大別山特有種都支杜鵑的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)1)

趙凱 章偉 裴亞麗 翟偉

(安慶師范大學,安慶,246011) (安徽大學) (安慶師范大學)

杜鵑花屬(Rhododendron)植物因其花繁葉茂、綺麗多姿成為世界著名的木本花卉[1-2],自從19世紀被大量發(fā)現(xiàn)并引種到歐洲以來,就在園藝學上占據(jù)了相當重要的地位[3]。都支杜鵑(RhododendronshanniFang)隸屬于杜鵑花科杜鵑花屬常綠亞屬植物,具有極佳的觀賞特性[4-6]。該種現(xiàn)僅分布于我國大別山區(qū)岳西縣、霍山縣及英山縣的三縣交界處,生于海拔1 400 m以上的山坡或山脊上,分布區(qū)面積不足110 km2,種群總占地面積不到1.2 km2[7-8],是亟需保護且具有較高開發(fā)價值的狹域片段化分布的瀕危物種[7-9]。

目前,對都支杜鵑的研究主要集中在形態(tài)解剖學和種群生態(tài)學[7,10-11],而基于分子數(shù)據(jù)對都支杜鵑的研究還相對缺乏,僅見趙凱等[11]基于ISSR分子標記分析了都支杜鵑的遺傳多樣性,Pan et al.[9]篩選了都支杜鵑24對多態(tài)性EST-SSR引物,但這些研究并沒有清楚地揭示都支杜鵑的遺傳結(jié)構(gòu)特征。EST-SSR是基于表達序列標簽開發(fā)微衛(wèi)星的一種新型分子標記,與基因組SSR相比,EST-SSR具有在植物物種之間可轉(zhuǎn)移性的優(yōu)點,目前已被廣泛應(yīng)用于植物基因組學研究,如遺傳多樣性評價、種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)發(fā)育與進化研究等方面[12]。鑒于此,本研究利用24對多態(tài)性EST-SSR引物,進一步對瀕危物種都支杜鵑自然種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行研究,旨在揭示都支杜鵑的遺傳多樣性和遺傳背景,為瀕危植物都支杜鵑的保護和合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年5月在都支杜鵑的分布區(qū)域內(nèi)選取了5個具代表性的自然種群進行采樣,共采集158個個體,其中白馬尖(BMJ)種群33個個體、天河尖(THJ)種群30個個體、都支尖(DZJ)種群33個個體、石壁溝(SBG)種群26個個體、坨尖(TJ)種群36個個體。采樣時每株采集5～10片嫩葉于硅膠中干燥后帶回實驗室,植株間的間隔大于50 m。采樣點之間最近直線距離4.01 km,最遠直線距離為11.29 km(圖1)。

圖1 都支杜鵑采樣點位分布圖

1.2 DNA提取與擴增結(jié)果檢測

采用改良CTAB法進行樣品DNA提取。利用Pan et al.[9]開發(fā)的24對都支杜鵑EST-SSR引物對每個樣品進行PCR擴增,擴增后的產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,檢測合格的樣品送至生物科技公司進行測序分析。使用GeneMarker 1.85對分型的結(jié)果進行分析讀數(shù),獲取微衛(wèi)星基因型數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在遺傳多樣性上,使用Popgene 3.2軟件進行期望雜合度和觀測雜合度的計算。使用FASTA 2.9.3軟件計算各居群的平均等位基因數(shù)和種群近交系數(shù)。使用GenALEx 6.5軟件進行遺傳分化系數(shù)、遺傳距離和地理距離的計算,同時利用公式Nm=0.25(1-Fst)/Fst計算種群間的基因流(式中,Nm代表基因流,Fst代表遺傳分化系數(shù))。利用Ntsys軟件進行Mantel檢驗分析種群間遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性。在遺傳結(jié)構(gòu)上,使用Powermaker軟件計算居群間的Nei’s遺傳距離并使用MEGA 7.0軟件繪制居群間的UPGMA聚類樹[13]。使用Structure 2.3軟件對所有個體單獨聚類,K值設(shè)置為2～8,重復15次;burn-in設(shè)置為100 000,run-length設(shè)置為1 000 000,運行完成后用Structure Harvester分析STRUCTURE運行結(jié)果得到最佳分組的K值[14-16]。使用GenALEx 6.5軟件進行主坐標(PCoA)分析并制圖[17]。最后,使用Arlequi 3.5軟件進行AMOVAs分析[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 都支杜鵑種群的遺傳多樣性

采用24對EST-SSR引物對都支杜鵑5個天然種群158個個體的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示該物種的遺傳多樣性水平較高(表1),平均等位基因的均值為7.602,期望雜合度(HE)的均值0.665,觀測雜合度(HO)的均值為0.712。其中SBG種群的遺傳多樣性最低(平均等位基因=6.38,HE=0.589,HO=0.649),BMJ種群的HE最高為0.700,DZJ種群的HO最高為0.759,TJ種群的平均等位基因最高為8.333。此外,所有種群的觀測雜合度均大于期望雜合度。近交系數(shù)分析結(jié)果表明,都支杜鵑5個種群的Fis值均小于0,說明大別山地區(qū)的都支杜鵑種群主要為遠交種群。

表1 都支杜鵑的遺傳多樣性和近交系數(shù)

2.2 都支杜鵑種群的遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳分化系數(shù)(Fst)計算結(jié)果顯示都支杜鵑5個種群間的遺傳分化系數(shù)均較低,均值為0.041,變化范圍為0.024～0.059(表2),表明都支杜鵑在種群水平上的分化程度較低?；蛄?Nm)計算結(jié)果顯示,都支杜鵑5個種群間基因流大小在3.976～10.327波動,均值為6.40,表明都支杜鵑各種群間存在比較頻繁的基因交流,這與都支杜鵑種群間遺傳分化小的結(jié)果相一致。Mantel檢驗結(jié)果表明:都支杜鵑各種群間的遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性系數(shù)為R2=0.157(P=0.666),表明都支杜鵑各種群間的遺傳距離與地理距離無相關(guān)性。

UPGMA聚類分析結(jié)果顯示:在Nei’s遺傳距離0.105處,都支杜鵑的5個天然種群可以分為兩個集群,其中,DZJ種群為一個集群,剩下的4個種群個體(BMJ、THJ、SBG、TJ)聚為一個集群(圖2)?；赟tructure軟件的遺傳聚類分析結(jié)果表明,ΔK的峰值給出的最佳結(jié)果為K=2。當K=2時,5個都支杜鵑種群可以被分為兩個譜系,其中DZJ種群的大部分個體聚為紅色譜系,剩下的4個種群個體(BMJ、THJ、SBG、TJ)聚為綠色譜系(圖3)。主坐標分析(PCoA)結(jié)果顯示,都支杜鵑5個種群的158個個體可以明顯聚為兩類,其中DZJ種群的大部分個體聚為一類,剩下的4個種群個體(BMJ、THJ、SBG、TJ)聚為一類(圖4),這一結(jié)果與主坐標分析Structure軟件結(jié)果基本一致。進一步的分子方差(AMOVA)分析結(jié)果表明,兩個譜系間的遺傳變異占總體變異的2.43%,譜系內(nèi)種群間變異占總體變異的4.60%,而種群內(nèi)部變異占總體變異的92.97%(P<0.001),說明都支杜鵑種群的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)(表3)。

表3 都支杜鵑5個種群的分子方差分析

圖2 基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的5個都支杜鵑居群間的UPGMA聚類樹

BMJ為白馬尖種群;DZJ為都支尖種群;SBG為石壁溝種群;THJ為天河尖種群;TJ為坨尖種群。

圖4 都支杜鵑5個種群的主坐標分析(PcoA)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究基于24個多態(tài)性EST-SSR位點對都支杜鵑5個野生種群的158個個體進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果顯示各種群均具有較高的遺傳多樣性(5個種群的等位基因數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度均值分別為7.602、0.712和0.665),這與趙凱等[11]2013年基于ISSR數(shù)據(jù)分析都支杜鵑的遺傳多樣性結(jié)果相反。趙凱等[11]2013的研究中ZTJ、DYJ、BMJ 3個種群地理距離較近(BMJ種群距離ZTJ和DYJ分別為0.88和0.069 km),且ZTJ和DYJ種群均只包含幾十株個體。本研究將這3個種群并為BMJ一個種群(未采集ZTJ和DYJ的樣品),新增了THJ和TJ兩個種群,這兩個種群數(shù)量分別為1 000、2 000株,占了都支杜鵑野生個體總數(shù)的60%?？紤]到本次采樣范圍更全面、樣點設(shè)置更具代表性,加上新型分子標記EST-SSR的應(yīng)用,本研究揭示的都支杜鵑遺傳多樣性應(yīng)該更能反應(yīng)真實情況。

多數(shù)研究表明,對于狹域分布的瀕危物種通常具有較低的遺傳多樣性[19-20],也有部分物種保持了較高的遺傳多樣性,如毛果木蓮(Manglietiaventii,H=0.654)[21]、銀縷梅(Parrotiasubaequalis,Ho=0.520,He=0.558)[22]、長果安息香(Changiostyraxdolichocarpa,Ho=0.594,He=0.643)等[22]。一般認為,遺傳多樣性高的瀕危種在歷史上可能有廣泛的分布,后期經(jīng)歷的某種地質(zhì)氣候事件導致其種群規(guī)模的快速減小,使其豐富的遺傳多樣性仍保留在有限的居群和個體內(nèi)[23-24],這可能也是都支杜鵑擁有較高遺傳多樣性的原因。此外,都支杜鵑各居群的自交系數(shù)均為負數(shù)(均值為-0.005),表明其為典型的遠交物種,這也可能是其維持較高遺傳多樣性的原因之一。

對于種群規(guī)模近期快速減小且呈島嶼狀分布的物種,它們種群間的遺傳分化一般較小,遺傳變異主要存在種群內(nèi)[23-24]。本研究對都支杜鵑5個種群間的遺傳分化系數(shù)分析表明,其種群間的遺傳分化系數(shù)范圍為0.024～0.059,均較小。此外,分子方差分析結(jié)果表明種群內(nèi)的遺傳變異占總體變異的92.97%。這些結(jié)果均支持都支杜鵑的種群規(guī)模是近期快速減小的假設(shè),即現(xiàn)在的種群規(guī)模和種群分布式樣可能是近期形成的,各種群內(nèi)部都保留了其祖先種群高的遺傳多樣性,且在短期內(nèi)沒有發(fā)生明顯的遺傳變異。UPGMA聚類分析、Structure軟件聚類分析和主坐標分析(PCoA)結(jié)果基本一致,均顯示研究的5個種群可以分為兩個譜系,即DZJ種群的大部分個體聚為一個譜系,剩下的所有個體聚為另一個譜系。而分子方差(AMOVA)分析卻顯示兩個譜系間的遺傳變異很小,且不存在差異顯著性。從地理分布來看,DZJ種群處于相對中間的地理位置,與其他種群間較大的基因流(Nm均值5.20)可能是導致譜系間遺傳變異占比小的原因,DZJ種群獨特的遺傳結(jié)構(gòu)可能與遺傳漂變有關(guān)。在現(xiàn)存的都支杜鵑種群中,DZJ種群占地面積最小,數(shù)量也最少(僅存不到100株),這加劇了遺傳漂變。同時也有可能與其生境有關(guān),現(xiàn)存都支杜鵑基本都生存在海拔1 500 m以上的陡峭懸崖之上,DZJ種群周圍距離最近的類似生境最近直線距離在3 km以上,這加劇了DZJ種群的孤島效應(yīng)。

盡管都支杜鵑的遺傳多樣性較高,但是其現(xiàn)存成年個體僅有5 400株左右,且主要呈島嶼狀分布在大別山區(qū)江淮分水嶺的高海拔地區(qū)、生存環(huán)境惡劣[7],受當代氣候波動,特別是全球氣候變化的影響仍然很大。所以對都支杜鵑的保護應(yīng)該以就地保護為主,同時對一些小種群可以采用人工輔育的方式進行種群恢復。此外,位于岳西縣鷂落坪多枝尖的DZJ種群與其它種群在遺傳上有一定程度的分化,且該種群是該種模式產(chǎn)地之一,僅存100株左右,建議應(yīng)特別注意對該種群的保護。后續(xù)還應(yīng)加強對都支杜鵑全面采樣,基于基因組水平的研究為其提供更準確、合理的保護意見。