一株海洋假單胞菌降解有機鹵代物特性及酶學性質(zhì)*
2023-11-24 09:18:30王亞月李佳瑞裴冬麗
環(huán)境污染與防治 2023年11期
王亞月 向 巧 李佳瑞 郭 晴 裴冬麗#
(1.商丘師范學院生物與食品學院,河南 商丘 476000;2.河南師范大學生命科學學院,河南 新鄉(xiāng) 453007)
有機鹵代物因其優(yōu)良的導(dǎo)熱性、耐熱性、絕緣性、親脂性和生物活性[1-2],在合成去油劑、殺蟲劑、有機溶劑、滅火劑以及多聚化合物等方面發(fā)揮重要作用,被廣泛應(yīng)用于工、農(nóng)、醫(yī)等生產(chǎn)領(lǐng)域[3-5]。隨著有機鹵代物的大量生產(chǎn)和廣泛使用,該類物質(zhì)逐漸在湖泊、飲用水、地下水、海水和土壤等環(huán)境中積累,致使生態(tài)環(huán)境惡化[6-8]。此外,有機鹵代物可以通過食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)中不斷地遷移、轉(zhuǎn)化、富集,導(dǎo)致生物體基因突變、畸形、癌癥,極大地威脅人類健康[9-11]。因此,如何實現(xiàn)有機鹵代物的有效降解是當前亟待解決的問題。
近年來,微生物降解法由于具有降解效率高、降解底物廣譜、菌株適應(yīng)性強的特點,已成為去除環(huán)境中多種污染物的有效方法之一,而生長在被有機鹵代物污染環(huán)境中的微生物通常具有轉(zhuǎn)化這些化合物的潛在能力[12-13]。目前已有不少關(guān)于有機鹵代物降解菌菌種資源的報道,但是,大多數(shù)脫鹵微生物分離自陸生環(huán)境,降解效率不高且催化底物譜范圍較窄,應(yīng)用時受到限制[14]10。不同分離環(huán)境的差異,可對微生物法處理有機鹵代物的工藝及處理效果產(chǎn)生影響。因此,嘗試從其他環(huán)境分離可降解有機鹵代物的微生物菌株,拓展降解有機鹵代物的微生物分離范圍,并提高有機鹵代物降解效率及拓寬其催化底物譜很有必要。海洋環(huán)境由于其壓強高、含鹽量高、營養(yǎng)成分少、溫度低等特點,使得生活在其中的微生物生理生化特征、代謝途徑與陸生微生物有所差異,是發(fā)現(xiàn)新型酶的重要資源庫[15]。目前已報道的有機鹵代物降解菌僅有少數(shù)來自于海洋環(huán)境,包括紅桿菌屬(Rhodobactersp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、副球菌屬(Paracoccussp.)、冷單胞菌屬(Psychromonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)、氨基桿菌屬(Aminobactersp.)與賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillussp.)中的一些菌株[16],[17]1791,[18]91,[19-21]。
本研究以前期從大連海域繁茂膜海綿中篩選出的一株能夠降解2-氯丙酸(2-CPA)的菌株56為試驗對象,根據(jù)其形態(tài)、生理生化特征及16S rRNA序列分析鑒定其種屬,并考察了其在15種不同有機鹵代物作為唯一碳源條件下的生長情況以及對15種有機鹵代物降解能力,進一步表征了菌株56胞內(nèi)脫鹵酶催化特性,包括脫鹵酶催化D-2-氯丙酸(D-2-CPA)與L-2-氯丙酸(L-2-CPA)脫氯的最適溫度和溫度耐受性、最適pH和pH耐受性及底物譜等,為該菌用于有機鹵代物污染環(huán)境的生物修復(fù)及手性中間體的綠色合成提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 株
菌株56在-80 ℃下保存于20%(質(zhì)量分數(shù))的甘油中。
1.1.2 主要試劑
單氯乙酸(MCA,純度>99.0%)、單溴乙酸(MBA,純度>99.0%)、單碘乙酸(MIA,純度>99.0%)、二氯乙酸(DCA,純度>97.0%)、2-氟丙酸(2-FPA,純度>95.0%)、2-CPA(純度>98.0%)、L-2-CPA(純度>98.0%)、D-2-CPA(純度>98.0%)、2-溴丙酸(2-BPA,純度>99.0%)、2-溴-2-甲基丙酸(2-BMPA,純度>98.0%)、2-氯丁酸(2-CBA,純度>97.0%)、2-溴丁酸(2-BBA,純度>99.0%)、氯乙酰胺(CAA,純度>98.0%)等均采購自英國Alfa Aesar;2,2-二氯丙酸(2,2-DCPA,純度>95.0%)、2-溴丙酰胺(2-BPAD,純度>99.0%)采購自美國Sigma Aldrich;3-氯丙酸(3-CPA,純度>98.0%)采購自日本TCI;2-氯丙酰胺(2-CPAD,純度>98.0%)采購自德國Acros;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.3 主要儀器
高壓蒸汽滅菌鍋(Panasonic MLS-3781L-PC);恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Index-1);恒溫振蕩培養(yǎng)箱(Thermo Scientific MAXQ4000);聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)儀(ABI-2720);紫外可見分光光度計(MAPADA S1020);精密pH儀(Mettler Toledo S220);高效液相色譜(HPLC)儀(Agilent Technologies 1260)。
1.1.4 培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母浸粉5.0 g,NaCl 10 g,調(diào)pH為7.2,去離子水定容至1 000 mL,121 ℃滅菌20 min。
無機鹽基礎(chǔ)(MM)培養(yǎng)基:NaCl 30 g,Na2HPO4·12H2O 12 g,(NH4)2SO42 g,NaH2PO4·2H2O 1 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,酵母浸粉0.1 g,10倍微量元素母液10 mL,調(diào)pH為7.2,去離子水定容至1 000 mL,121 ℃滅菌20 min。固體MM培養(yǎng)基是在每升MM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入18 g瓊脂。
10倍微量元素母液:CaCl2530 mg,FeSO4·7H2O 200 mg,CuSO4·5H2O 40 mg,MnSO4·5H2O 20 mg,ZnSO4·7H2O 20 mg,CoCl24 mg,NaMoO4·2H2O 4 mg,H3BO33 mg,濃H2SO41 mL,加去離子水定容至1 000 mL。
鹵代物培養(yǎng)基:1 L MM培養(yǎng)基中加入終摩爾濃度為10 mmol/L的有機鹵代物。氯丙酸固體培養(yǎng)基則是在1 L 固體MM培養(yǎng)基中加入終摩爾濃度為10 mmol/L的2-CPA。
1.2 方 法
1.2.1 菌株56的生理生化特征
顯微鏡觀察分離純化后的菌株56形態(tài)特征,參照文獻[22]和文獻[23]對菌株56進行生理生化特征鑒定。
1.2.2 菌株56的分子鑒定
對分離純化后的菌株56進行脫氧核糖核酸(DNA)提取。使用細菌通用引物27F和1492R擴增其16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系(50 μL):模板10 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,酶與4種核苷酸混合物25 μL和雙蒸水13 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,擴增產(chǎn)物送至天津金唯智生物科技有限公司測定基因序列,序列結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析,通過MEGA version 6.0軟件對菌株56構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。
1.2.3 菌株56的有機溶劑耐受性
取保存于甘油中的菌株56接入LB液體培養(yǎng)基,37 ℃過夜培養(yǎng)即為種子液。取1 mL種子液分別接入100 mL含有有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、乙腈)的LB液體培養(yǎng)基中,每種有機溶劑體積分數(shù)分別為1%、2%、3%、5%、8%,37 ℃培養(yǎng)2 d,每個處理3個重復(fù),分別將不接入種子液的處理與接入種子液不加有機溶劑的處理作為陰性對照組與陽性對照組。有機溶劑處理組培養(yǎng)液和陽性對照組一樣明顯變渾濁的認為可以耐受,若與陰性對照組一樣澄清則認為不可以耐受。
1.2.4 菌株56對不同有機鹵代物的降解能力
分別在100 mL MM培養(yǎng)基中添加終摩爾濃度為10 mmol/L的MCA、MBA、MIA、2-FPA、2-CPA、2-BPA、2-BMPA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、DCA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD和2-BPAD作為唯一碳源,1∶100(體積比)接種,30 ℃、220 r/min下培養(yǎng),每個處理3個重復(fù),以100 mL不接種種子液的MM培養(yǎng)基作為相應(yīng)的空白對照,間隔24 h取樣,取樣至168 h時,分別在未降解完全的鹵代物培養(yǎng)基中加入終摩爾濃度為10 mmol/L的葡萄糖溶液,并繼續(xù)取樣至240 h。分光光度計測600 nm處吸光度值(OD600),監(jiān)測菌株生長情況。同時取上述培養(yǎng)液12 000 r/min離心10 min后取上清液備用,運用HPLC儀檢測其中有機鹵代物含量。
檢測色譜柱:C546250-U Cloversil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);紫外檢測器,檢測波長210 nm;流動相A為乙腈,流動相B為0.015 mol/L H3PO4-KH2PO4緩沖液(pH 2.2),流速1 mL/min;柱溫30 ℃,檢測體積10 μL。CAA檢測流動相A、B以5∶95(體積比)等度洗脫,2,2-DCPA檢測流動相A、B以10∶90等度洗脫,其余有機鹵代物檢測流動相A、B均以15∶85等度洗脫。
1.2.5 菌株56粗酶液制備
在MM培養(yǎng)基中,添加終摩爾濃度為20 mmol/L 的2-CPA作為唯一碳源培養(yǎng)菌株56,待培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期時,4 ℃、8 000 r/min下,離心10 min收集菌體。沉淀用50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH 7.5)洗滌3次后,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ【w,每克菌體用20 mL上述緩沖液重懸。冰浴中超聲破碎菌體,超聲條件:200 W工作2 s,間隙2 s,200個循環(huán),4 ℃、12 000 r/min下,離心30 min,上清液即為粗酶液(下文簡稱酶液)。
1.2.6 脫鹵酶活性檢測
脫鹵酶活性檢測反應(yīng)體系為1.0 mL,包括100 μL 100 mmol/L有機鹵代物,500 μL 0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH 10.0)與400 μL酶液。30 ℃反應(yīng)1 h,10 μL H3PO4(質(zhì)量分數(shù)85%)終止反應(yīng)。12 000 r/min下,離心10 min去除沉淀,取上清液,HPLC儀檢測有機鹵代物含量。定義每分鐘催化轉(zhuǎn)化1 μmol 底物所需要的酶量為1個活力單位(U)[18]92。
1.2.7 脫鹵酶的底物譜檢測
同1.2.6節(jié)中方法,檢測底物包括MCA、MBA、MIA、2-FPA、2-CPA、2-BPA、2-BMPA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、DCA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD和2-BPAD,終摩爾濃度為10 mmol/L,30 ℃反應(yīng)30 min,檢測有機鹵代物含量,定義底物為2-CPA時的酶活性為100%,計算酶對其他有機鹵代物的相對活性。
1.2.8 最適反應(yīng)溫度及其熱穩(wěn)定性檢測
分別以L-2-CPA與D-2-CPA作為底物,測定酶液在0、20、30、40、50、60 ℃反應(yīng)條件下的酶活性,確定其中脫鹵酶最適反應(yīng)溫度。將酶液在上述不同溫度下孵育30 min,檢測剩余酶活性,確定其熱穩(wěn)定性。以所測最高酶活性為100%,計算酶在其他溫度下的相對活性。
1.2.9 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性檢測
檢測pH范圍為4.0～12.0,pH 4.0～7.5用200 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液,pH 8.0～9.5用200 mmol/L Tris-硫酸鹽緩沖液,pH 10.0～12.0用100 mmol/L Glycine-NaOH緩沖液,分別以L-2-CPA與D-2-CPA作為底物,測定酶在不同pH緩沖液中的酶活力,以確定兩個對映體底物最適脫鹵pH。將酶液在上述緩沖液中以1∶10體積比稀釋,4 ℃放置1 d,檢測酶殘留活性,確定其pH耐受性。以所測最高酶活為100%,計算酶在其他pH條件下的相對活性。
2 結(jié)果與討論
2.1 菌株56的鑒定
2.1.1 形態(tài)特征
如圖1所示,菌株56在氯丙酸固體培養(yǎng)基上形成扁平、大小不一、表面光滑濕潤、呈黃褐色的圓形菌落,顯微鏡下觀察呈短桿狀,不產(chǎn)芽孢。
圖1 菌株56菌落形態(tài)與革蘭氏染色觀察Fig.1 The colony morphology observation and Gram staining observation of strain 56
2.1.2 生理生化特征
由表1可見,菌株56為革蘭氏陰性菌,甲基紅、V-P試驗、H2S試驗呈陰性,不能水解淀粉和色氨酸,能夠水解精氨酸、尿素,明膠液化、過氧化氫酶、氧化酶呈陽性,還原硝酸鹽,可以利用葡萄糖、木糖、甲酸鈉、乙酸鈉、丙二酸鈉、肌醇與硫氰酸鈉,不能利用蔗糖、乳糖、半乳糖與檸檬酸鈉。根據(jù)文獻[23]進行比對,并結(jié)合菌株56菌落形態(tài)與顯微形態(tài),初步確定菌株56為假單胞菌屬。
表1 菌株56的主要生理生化特征1)Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain 56
2.1.3 分子鑒定
所測16S rRNA基因序列經(jīng)BLAST比對,下載相關(guān)同源序列,借助MEGA軟件以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示,對菌株56進行系統(tǒng)發(fā)育分析,該菌株與PseudomonaskunmingensisYL-233同聚一枝,且同源性為100%,結(jié)合其生理生化特征,進一步確定菌株56為昆明假單胞菌(Pseudomonaskunmingensis),菌株56的16S rRNA基因序列已上傳至GenBank,登錄號為ON306908。
注:以軟件中的Kimura-Parameter Distance模型計算進化距離,1 000次隨機抽樣,計算Bootstrape以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。圖2 菌株56的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain 56
2.2 菌株56有機溶劑耐受能力
對有機溶劑具有耐受能力的菌株在全細胞催化轉(zhuǎn)化、工業(yè)酶制劑開發(fā)與環(huán)境污染物的生物降解等領(lǐng)域具有重大應(yīng)用價值。對于脫鹵微生物,由于其降解底物較差的水溶性,則更要求菌株具有一定的有機溶劑耐受能力[14]10。如表2所示,菌株56可以耐受1%～5%的甲醇、乙醇、丙酮和乙腈及8%的乙醇,然而不能耐受8%的甲醇、丙酮和乙腈。綜上,菌株56對乙醇有良好的耐受能力,對低濃度甲醇、丙酮與乙腈也表現(xiàn)出耐受,具有開發(fā)應(yīng)用潛力。
表2 菌株56對不同有機溶劑的耐受能力1)Table 2 The tolerance of strain 56 against organic solvent
2.3 菌株56降解有機鹵代物特性
由于不同有機鹵代物的結(jié)構(gòu)、毒性、降解難易程度及在環(huán)境中的豐度等性質(zhì)的差異,不同生境分離出的菌株亦表現(xiàn)出不同的利用特性。如圖3所示,菌株56可以利用鹵代乙酸(MCA、MBA、MIA)、鹵代丙酸(2-CPA、2-BPA、2-BMPA、3-CPA)、鹵代丁酸(2-CBA、2-BBA)、二鹵代酸(DCA、2,2-DCPA)和鹵代酰胺(CAA、2-CPAD、2-BPAD)作為唯一碳源進行生長,但不能利用鹵代丙酸中的2-FPA。菌株以MBA、2-BPA、2-BMPA、DCA為唯一碳源時生長較快,其中在2-BMPA培養(yǎng)基中生長最快,OD600最大為0.807,其次依次為2-BPA、MBA、DCA,OD600最大值分別為0.555、0.310、0.308;以MCA、MIA、2-CPA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD、2-BPAD作為唯一碳源時生長較慢,120 h時OD600最大值僅0.209(2-CPA為唯一碳源),168 h加入輔助碳源葡萄糖后菌株迅速生長,240 h時OD600最大值可達1.742(2-BBA)。綜上,15種有機鹵代物中,僅2-FPA不能作為菌株56的碳源,剩余14種有機鹵代物均可作為碳源,其中2-BMPA、2-BPA、 MBA和DCA為較易利用的碳源。
注:箭頭表示添加葡萄糖。圖3 菌株56的生長曲線及有機鹵代物的降解曲線Fig.3 The growth curve of strain 56 and the degradation curve of organic halogenated compounds
相應(yīng)地,菌株56對MBA、DCA、2-BPA、2-BMPA的降解速度也較快,分別在72、72、96、120 h內(nèi)降解完全;對MCA、MIA、2-CPA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD與2-BPAD的降解較慢,168 h時降解率分別為48.2%、71.4%、82.3%、27.1%、34.2%、46.7%、20.4%、9.8%、6.6%、15.9%,加入葡萄糖后這些有機鹵代物繼續(xù)降解,216 h時2-CPA已全部降解,240 h時MCA、MIA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD和2-BPAD降解率分別可達70.7%、89.4%、45.6%、55.5%、69.2%、35.0%、20.1%、10.4%和26.2%。綜上可知,以有機鹵代物作為唯一碳源時,菌株56對有機鹵代物的降解能力大小依次為MBA>DCA>2-BPA>2-BMPA>2-CPA>MIA>MCA>2-BBA>2-CBA>3-CPA>2,2-DCPA>2-BPAD>CAA>2-CPAD。
氯代、溴代丙酸的低毒性及其在自然界中高豐度特性,使得其容易被大多數(shù)菌株降解,而氟代酸較高的毒性及其C—F鍵的高穩(wěn)定性使得其不易被降解[18]94,菌株56亦表現(xiàn)出此特性。菌株56不僅能降解MCA,而且對DCA表現(xiàn)出更高降解能力,與已報道菌株相比,表現(xiàn)出高效降解能力,如Arthrobactersp. strain D2、Pseudomonas sp. strain CBS3和BurkholderiacepacianMBA4能降解MCA,但對DCA幾乎沒有降解能力;Burkholderiasp. strain CL-1能高效利用MCA,但對DCA降解率較菌株56 低了約10%[25-27]。2,2-DCPA與3-CPA作為比較難降解的鹵代酸,已報道的能夠同時降解這兩種有機鹵代物的菌株也甚少,如AgrobacteriumtumefaciensRS4、XanthomonasmaltophiliaRS6、ComamonasacidovoransRS7、AchromobacterxylosoxidansRS9、Rhizobiumsp. RC1和Pseudomonasalcaligenes能降解2,2-DCPA,卻不能降解3-CPA[28-30];BacilluscereusWH2、Bacillussp. CGMCC no. 4196、RhodococcusrhodochrousNCIMB13064雖然能降解3-CPA,卻不能降解2,2-DCPA[31-33]。然而,菌株56不僅可以同時降解2,2-DCPA與3-CPA,還能降解鹵代酰胺類化合物,極大地擴展了假單胞菌屬菌株在治理有機鹵代物污染環(huán)境中的應(yīng)用。
2.4 菌株56中脫鹵酶性質(zhì)表征
2.4.1 底物譜
目前已報道的鹵代酸脫鹵酶多偏好于碳鏈小于3個碳原子的氯代與溴代的2-鹵代酸,不能催化氟代與C3位置取代的鹵代酸脫鹵反應(yīng)[14]3。然而,菌株56中脫鹵酶卻表現(xiàn)出優(yōu)良的脫鹵性能,可催化MCA、MBA、MIA、2-CPA、2-BPA、2-BMPA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、DCA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD和2-BPAD的脫鹵,不能作用于2-FPA,其中對2-CPA脫鹵酶活性最高(見圖4)。對于2-有機鹵代物,酶活性依次為2-鹵代丙酸>2-鹵代丁酸>2-鹵代酰胺,如對2-CPA的酶活性分別是2-CBA、2-CPAD的66.8、138.4倍,對2-BPA的酶活性分別是2-BBA、2-BPAD的16.0、81.9倍;對單鹵代酸的酶活性高于二鹵代酸,如對MCA的酶活性是DCA的1.7倍;對于不同鹵素的有機鹵代物,其酶活性為MCA
圖4 菌株56鹵代酸脫鹵酶底物譜Fig.4 Substrate profile of haloacid dehalogenase from strain 56
2.4.2 最適反應(yīng)溫度及其熱穩(wěn)定性
如圖5(a)所示,菌株56中鹵代酸脫鹵酶催化L-2-CPA和D-2-CPA脫氯的最適反應(yīng)溫度均為40 ℃,與PseudomonasstutzeriDEH130中脫鹵酶相同[17]1794。0～30 ℃時,隨著溫度的升高,酶活性逐漸上升,30～40 ℃時,脫鹵酶活性急劇上升,來源于Paracoccussp. DEH99[18]94、Pseudomonassp. DEH138A[34]140和Pseudomonasputidastrain AJ1/23[35]883中的酶也表現(xiàn)出相似特性。40～60 ℃時,隨著溫度的升高,酶活性逐漸降低。如圖5(b) 所示,當酶液在0～40 ℃條件下孵育30 min時,酶相對穩(wěn)定,酶活性可保留80%以上;隨著溫度的繼續(xù)升高,酶穩(wěn)定性降低,60 ℃時,對D-2-CPA、L-2-CPA的酶活性分別保留52.5%、24.6%?？梢娋?6產(chǎn)生的鹵代酸脫鹵酶具有一定程度的熱穩(wěn)定性。
圖5 溫度對鹵代酸脫鹵酶反應(yīng)活性的影響Fig.5 Effect of temperature on haloacid dehalogenase activity
2.4.3 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性
鹵代酸脫鹵酶最適反應(yīng)pH多偏堿性,如Pseudomonasputidastrain AJ1/23[35]883和PseudomonasstutzeriDEH130[17]1796中的脫鹵酶在pH 9.5條件下酶活性最高,Pseudomonassp. DEH138A[34]140的最適pH為9.0,Paracoccussp. DEH99[18]93的最適反應(yīng)pH為10.0。如圖6(a)所示,菌株56中脫鹵酶催化D-2-CPA和L-2-CPA脫氯的最適反應(yīng)pH均為9.0;在堿性條件下(pH 8.0～10.0)具有較高的反應(yīng)活性,pH<8.0和pH>10.0反應(yīng)活性降低;過酸和過堿環(huán)境會導(dǎo)致酶喪失反應(yīng)活性,pH為4.0和12.0時,酶催化D-2-CPA與L-2-CPA脫氯的酶活性均低于40%。如圖6(b) 所示,在pH 4.0～12.0條件下孵育24 h后,酶在pH 7.0的環(huán)境中最穩(wěn)定;緩沖液pH為5.0～9.0時,酶可保留高于70%的酶活性;當pH<5.0和pH>9.0時,酶活性逐漸降低,pH為4.0時,酶催化D-2-CPA與L-2-CPA脫氯酶活性分別保留89.1%與57.0%,而pH為12.0時,脫氯活性分別保留34.3%與5.6%,可見菌株56中鹵代酸脫鹵酶具有一定的耐酸性。
圖6 pH對鹵代酸脫鹵酶反應(yīng)活性的影響Fig.6 Effect of pH on haloacid dehalogenase activity
綜上,根據(jù)菌株56中鹵代酸脫鹵酶在不同溫度和pH條件下對兩種手性氯丙酸的降解情況,推測該菌株中脫鹵酶的組成可能有3種情況:一是細胞中有兩種脫鹵酶,分別為 D-2-鹵代酸脫鹵酶、L-2-鹵代酸脫鹵酶,它們在微生物細胞內(nèi)共同起作用,并且具有相同的最適反應(yīng)溫度和pH;二是菌株細胞中只存在一種脫鹵酶,即DL-2-鹵代酸脫鹵酶;三是存在D-2-鹵代酸脫鹵酶和/或L-2-鹵代酸脫鹵酶以及DL-2-鹵代酸脫鹵酶。然而,這需要進一步對其中鹵代酸脫鹵酶進行分離純化。
3 結(jié) 論
(1) 從大連海域繁茂膜海綿中分離獲得2-CPA降解菌株,經(jīng)生理生化表征與16S rRNA序列分析鑒定為昆明假單胞菌(Pseudomonaskunmingensis),該菌株對有機溶劑甲醇、乙醇、丙酮和乙腈表現(xiàn)出一定的耐受性。
(2) 菌株56可利用MCA、MBA、MIA、2-CPA、2-BPA、2-BMPA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、DCA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD與2-BPAD作為唯一碳源進行生長,不能利用2-FPA。
(3) 菌株56中脫鹵酶可催化MCA、MBA、MIA、2-CPA、2-BPA、2-BMPA、3-CPA、2-CBA、2-BBA、DCA、2,2-DCPA、CAA、2-CPAD與2-BPAD的脫鹵,其中對2-CPA與2-BPA具有較高酶活性,不能作用于2-FPA;其最適反應(yīng)溫度為40 ℃,在低于40 ℃的環(huán)境中,有良好的熱穩(wěn)定性,隨著溫度的升高,酶活性降低;最適反應(yīng)pH為9.0,在pH 5.0～9.0能夠較好保持活性。
(4) 菌株56不僅具有有機溶劑耐受性及降解多種有機鹵代物的能力,且其產(chǎn)生的脫鹵酶也具有較寬的底物譜、一定程度的熱穩(wěn)定性及良好的耐酸性,在有機鹵代物的生物降解中具有工業(yè)應(yīng)用潛力。
