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    歐前胡素抑制人腎癌786-O細胞增殖并促進其凋亡

    2023-11-24 03:17:48景紅梅樊海燕黃小勇慕明濤史海燕
    山西醫(yī)科大學學報 2023年10期
    關鍵詞:數據庫實驗

    景紅梅,樊海燕,黃小勇,杜 娟,張 靜,慕明濤,史海燕*

    (1延安大學醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心,延安 716000;2延安市寶塔區(qū)人民醫(yī)院兒科;3榆林市第一醫(yī)院檢驗科;*通訊作者,E-mail:shihaiyan@yau.edu.cn)

    腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC),又稱為腎腺癌,起源于腎小管上皮,大約70%的腎癌是由透明細胞構成的[1]。腎癌分別占男性和女性所有成人惡性腫瘤的5%和3%,是男性第七大常見癌癥,女性第十大常見癌癥,是泌尿系統惡性腫瘤患者死亡的第二大原因[2]。在過去10年中,大多數國家的RCC發(fā)病率呈上升趨勢,在我國平均年變化百分比達到了7.6%,其中約四分之一患者初診時已有轉移,而轉移患者的5年生存率不足10%[3,4]。目前臨床腎細胞癌的主要治療方法包括根治性腎切除術或部分腎切除術及熱消融技術,而對于發(fā)生轉移的腎癌患者,療效欠佳[5]。近年來有研究表明,我國傳統藥物在腫瘤防治方面具有獨特的優(yōu)勢[6]。歐前胡素(imperatorin)是一種具有抗菌、抗炎、平喘及抗過敏等多種生物活性的呋喃香豆素,來源廣泛,在一些中草藥中含量豐富,主要用于散風除濕、消膿排腫[7,8]。有研究報道,歐前胡素抗腫瘤作用較顯著,并且對改善腫瘤耐藥有著積極的作用[9,10]。但目前,歐前胡素在腎癌中的研究報道較少見。

    隨著大數據時代的到來,網絡藥理學被廣泛應用在中醫(yī)藥研究中?;诰W絡藥理學的方法和整合策略,可以初步預測中藥潛在靶點及其可能的作用機制[11]。本研究擬采用生物學實驗與網絡藥理學方法相結合,從細胞分子水平初步探索歐前胡素治療腎癌的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞系 人腎透明細胞腺癌細胞(786-O)購自北京北納創(chuàng)聯生物技術研究院,并保存于延安大學醫(yī)學院醫(yī)學實驗研究中心。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 腎癌細胞786-O常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

    1.2.2 CCK-8實驗檢測細胞增殖活力及藥物IC50786-O細胞以每孔3×103細胞數接種于96孔板中,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后加入不同濃度的歐前胡素(0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200 μmol/L),同時設置空白組(僅含有溶劑、細胞培養(yǎng)液和試劑),分別培養(yǎng)24,48,72 h后每孔加入10 μl的CCK-8試劑,37 ℃,5% CO2避光培養(yǎng)1 h,使用酶標儀在450 nm處檢測各處理組OD值,以0 μmol/L為對照組計算細胞存活率。細胞存活率%=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。使用GraphPad Prism7分別計算作用24,48 h歐前胡素對786-O細胞的半數抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)。以log10[歐前胡素濃度(μmol/L)]為橫坐標,細胞抑制率為縱坐標,繪制IC50曲線圖。細胞抑制率(%)=100%-細胞存活率(%)。

    1.2.3 細胞形態(tài)學觀察 收集處于對數生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數,以每孔1×104細胞數接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入0,40,80 μmol/L歐前胡素,以0 μmol/L為對照組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,在明場條件下,使用倒置生物學顯微鏡放大100倍觀察各組細胞形態(tài)變化,并拍照。

    1.2.4 細胞克隆形成實驗檢測細胞增殖 收集處于對數生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數,以每孔800個細胞數接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度歐前胡素(0,40,80 μmol/L),每2 d換液一次。2周后,用PBS洗滌,4%聚合甲醛固定細胞20 min,并用0.1%結晶紫染色15 min,PBS洗滌后拍照。加入二甲基亞砜處理細胞,并在570 nm處測量上清液的吸光度。

    1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集處于對數生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數,以每孔1×104個細胞接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入0,40,80 μmol/L歐前胡素,培養(yǎng)48 h后,用不含EDTA的胰酶消化細胞,收集細胞懸液,使用Annexin Ⅴ/PI雙染色試劑盒進行染色,2 h內于流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

    1.2.6 實時熒光定量PCR分析Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2 mRNA的表達 收集處于對數生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數,以每孔1×104細胞數接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入0,40,80 μmol/L歐前胡素,培養(yǎng)24 h后,Trizol法提取各組總RNA,按照Removal and cDNA Synthesis實驗操作流程將RNA逆轉錄成cDNA,以該cDNA為模板,使用KAPA SYBR FAST Universal熒光定量試劑盒及Cobas z 480操作手冊進行擴增檢測,反應采用兩步法,第一步:95 ℃,10 min,1個循環(huán);第二步:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環(huán),各組均設3個復孔,結果采用相對定量法2-ΔΔCt進行分析。各引物由西安奧科鼎盛生物公司合成,引物序列見表1。

    表1 實驗中所用到的引物序列

    1.2.7 Western blot檢測Fas、Caspase-8、Caspse3、Bcl-2的蛋白表達情況 用含有1%全蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解細胞,提取上清,采用BCA法測定各組蛋白質濃度。分別取20 μg蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜,與特異性一抗(抗人Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2,比例均為1∶1 000)孵育,4 ℃過夜。洗膜后與二抗室溫孵育1 h,洗膜后與ECL化學發(fā)光劑作用,進行曝光和顯影。GAPDH為內參蛋白,用Image J軟件進行蛋白印記的定量分析。

    1.2.8 歐前胡素相關靶點及藥物-疾病共同靶點獲取 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php/)及中藥高通量實驗和參考數據庫(HERB,Herb.ac.cn)收集歐前胡素主要作用靶點[12]。通過UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫將靶點蛋白名稱轉化為相應的基因名稱,并去除重復項。通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/),以“renal cell carcinoma”為關鍵詞檢索腎癌相關疾病靶點,并刪除重復項。將腎癌疾病靶點與歐前胡素作用靶點取交集后,導入Bioinformatics &Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/Venn/)系統,繪制韋恩圖,獲得歐前胡素治療腎癌的潛在作用靶點。

    1.2.9 蛋白相互作用網絡構建 利用STRING數據庫(https://stringdb.org/)將篩選得到的歐前胡素治療腎癌的潛在作用靶點進行PPI網絡構建。其中參數Organism選擇“Homo sapiens”,“Minimum required interaction score”選擇“Medium confidence(0.400)”,并隱藏網絡中未連接的節(jié)點,其他參數保持默認數值,篩選PPI網絡中的核心作用靶點。

    1.3 統計學分析

    2 結果

    2.1 歐前胡素作用786-O細胞的IC50

    歐前胡素作用786-O細胞24 h和48 h的IC50分別為94.36 μmol/L和65.66 μmol/L(見圖1)。

    A.歐前胡素作用24 h B.歐前胡素作用48 h

    2.2 歐前胡素對腎癌細胞形態(tài)的影響

    歐前胡素對腎癌細胞作用24 h后,結果顯示,隨著藥物濃度的增加,細胞體積變小、皺縮,形態(tài)由梭形變得細長,同時細胞密度減少(見圖2)。

    圖2 倒置顯微鏡觀察歐前胡素對786-O細胞形態(tài)學的影響 (×100)

    2.3 歐前胡素可抑制腎癌細胞786-O的增殖

    CCK-8實驗結果顯示,在同一時間點,隨著歐前胡素濃度的增加,786-O細胞活力降低;在同一濃度作用下,隨著時間的延長,786-O細胞活力降低,呈現濃度依賴性和時間依賴性(見圖3A)。細胞克隆形成實驗結果顯示,與對照組相比,實驗組786-O細胞的克隆形成能力降低,差異具有統計學意義(P<0.01,見圖3B)。

    圖3 歐前胡素對786-O細胞增殖能力的影響

    2.4 歐前胡素促進腎癌細胞786-O凋亡

    流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示,與0 μmol/L組相比,40 μmol/L組和80 μmol/L組細胞凋亡率均升高(P<0.01);與40 μmol/L組相比,80 μmol/L組細胞凋亡率升高(P<0.01,見圖4)。

    圖4 歐前胡素對786-O細胞凋亡的影響

    2.5 歐前胡素對腎癌細胞786-O凋亡相關分子mRNA表達水平的影響

    RT-qPCR實驗結果表明,與0 μmol/L組相比,40 μmol/L組和80 μmol/L組Fas、Caspase-8、Caspase-3在mRNA水平相對表達量均升高(P<0.01),而Bcl-2表達水平上無明顯變化(見圖5)。Western blot實驗結果表明,與0 μmol/L組相比,40 μmol/L組和80 μmol/L組Fas、Caspase-8、Caspase-3在蛋白水平相對表達量均升高(P<0.05),而Bcl-2表達水平上無明顯變化(P>0.05,見圖6)。

    與0 μmol/L組相比,**P<0.01,***P<0.001

    與0 μmol/L組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

    2.6 歐前胡素治療腎癌靶點的獲取

    通過TCMSP數據庫共檢索歐前胡素(MOL001941)作用于8個靶點蛋白。HERB數據庫中檢索歐前胡素作用于15個靶點。整合2個數據庫平臺篩選得到的所有靶點,刪除重復靶點,共獲得歐前胡素17個靶點基因,結果見表2。利用GeneCards數據庫獲得腎癌的靶點2 406個。將歐前胡素作用靶點與腎癌疾病靶點通過韋恩圖取交集,得到14個交集靶點,即為歐前胡素治療腎癌的潛在作用靶點(見圖7)。

    圖7 歐前胡素作用腎癌潛在靶點

    表2 TCMSP及HERB獲得歐前胡素靶點基因

    2.7 歐前胡素治療腎癌潛在作用靶點的PPI網絡圖及核心靶點篩選

    將歐前胡素與腎癌的14個共同靶標導入STRING數據庫,限定物種為“Homo sapiens”,并以置信度≥0.4進行篩選。PPI網絡共有14個節(jié)點,35條邊。該網絡節(jié)點連接度的中位數是5,因此選擇“Degree≥5”的節(jié)點作為候選靶點。共篩選出7個核心靶點,分別為GSK3β、CDK2、PPARG、ESR1、MAPK14、AR、PTGS2(見圖8),提示其可能是歐前胡素治療腎癌的關鍵靶點。

    淺藍色線條代表來源精選的數據庫;粉色線條代表經實驗確認;綠色代表相鄰基因;紅色線條代表融合基因;藍色代表共生基因;淺黃色代表文本挖掘基因;黑色代表共表達基因;紫色代表同源性蛋白質

    3 討論

    在治療癌癥中,中醫(yī)藥的使用日益廣泛。大量研究表明,中醫(yī)不僅能緩解癌癥患者的癥狀(如疲勞、慢性疼痛、厭食/惡病質、失眠等),提高生活質量,還可以減少化療、放療或靶向治療引起的不良反應和并發(fā)癥,提高患者生存質量,而且相對于化療藥物,其具有不良反應小、費用低等優(yōu)勢[6]。中藥白芷具有祛病除濕、消腫排膿、活血止痛等功能,其中含有大量歐前胡素[15],國內外多項研究表明歐前胡素在抗腫瘤方面具有巨大潛力,例如,歐前胡素可以逆轉肝癌細胞對順鉑類藥物的耐藥性[16];在結腸癌中,歐前胡素可以通過抑制缺氧誘導因子HIF-1的活化,引起人結腸癌細胞周期的阻滯,進而抑制腫瘤細胞生長,并阻斷腫瘤血管形成[17]。抑制腫瘤細胞增殖,誘導其凋亡一直是腫瘤治療的一個重要思路[18]。本研究發(fā)現,不同濃度的歐前胡素干預后均能抑制腎癌細胞株786-O細胞的增殖,并呈濃度和時間依賴性。同時本研究發(fā)現,40 μmol/L和80 μmol/L的歐前胡素作用24 h后786-O細胞的凋亡率分別達到了27.18%和45.7%,說明歐前胡素可以誘導786-O細胞凋亡,這與Yi等[19]在結腸癌細胞中的研究結果一致。本研究的發(fā)現可為歐前胡素在腎癌中的應用提供一定的理論依據。

    細胞凋亡主要有線粒體和死亡受體兩條途徑,死亡受體途徑起始于外部凋亡信號,受跨膜受體的調節(jié)[20],Fas作為Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子受體家族成員,具有信號傳遞功能,當與其配體FasL結合后,由死亡受體介導的細胞凋亡通路被激活[21],與Fas相關的死亡結構蛋白(FADD)通過死亡效應結構域與Caspase-8前體結合,形成死亡誘導信號復合物(death-inducing signaling complex,DISC),Caspase-8被激活,緊接著凋亡的效應因子Caspase-3被激活,觸發(fā)凋亡執(zhí)行[22]。本研究發(fā)現經歐前胡素作用后,786-O細胞中Fas、Caspase-8和Caspase-3表達均增強,而Bcl-2卻沒有明顯變化。所以我們認為歐前胡素可能是通過Fas/Caspase-8/Caspase-3信號通路誘導786-O細胞凋亡。但有文獻報道,由枳殼中提取的歐前胡素和檸檬苦素聯合作用肝癌細胞和結腸癌細胞,可下調其抗凋亡基因Bcl-2,促進肝癌細胞和結腸癌細胞的凋亡[23]。這與本研究的結果不一致,猜測原因可能是歐前胡素的提取原材料不同,也有可能是在不同腫瘤細胞中歐前胡素通過不同凋亡途徑發(fā)揮作用。

    系統生物學的快速發(fā)展衍生出了網絡藥理學以及多種算法、工具、平臺和軟件[12]。這些基于網絡藥理學的方法在中醫(yī)藥相關研究中得到了廣泛的應用。本研究利用TCMSP和HERB數據庫收集歐前胡素作用靶點。通過GeneCards數據庫獲取腎癌相關靶點。篩選共同靶點后,使用STRING數據庫構建蛋白互作網絡,并篩選出歐前胡素治療腎癌的7個核心靶點,分別是GSK3β、CDK2、PPARG、ESR1、MAPK14、AR、PTGS2。有文獻報道,高劑量GSK3β抑制劑可通過上調Caspase-8、p38α和Fas-Daxx的表達,促進小鼠運動神經元-神經母細胞瘤雜合細胞(NSC-34)凋亡[14]。基于生物學實驗、網絡藥理學結果及文獻支持,得出以下結論,歐前胡素可能通過靶向GSK3β調控死亡受體途徑,進而抑制腎癌細胞增殖,并促進其凋亡。

    綜上所述,本實驗提示了歐前胡素具有誘導腎癌細胞凋亡的生物活性,為腎癌的治療提供了新的途徑和理論依據。然而,對于歐前胡素誘導調控腎癌凋亡的具體作用機制仍未完全闡明。未來研究中我們將會對歐前胡素抗癌的作用機制進行深入的探究。

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