平文麗,孫計(jì)平,郭梅燕,孫 煥,張雪珂,李雪君*
1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,河南省許昌市青梅路與永昌大道交叉口 4610002.煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州市金水區(qū)花園路116 號 4500023.項(xiàng)城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,河南省周口市項(xiàng)城市光武大道 466200
轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)又名反式作用因子,是一類可通過與DNA順式作用元件結(jié)合激活或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控植物生長發(fā)育的蛋白,在植物調(diào)控基因表達(dá)、響應(yīng)外界刺激的過程中發(fā)揮重要作用[1]。植物中與響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、bZIP、WRKY、NAC 和AP2/ERF 5 個(gè)家族[2-7]。其中,MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員最多。MYB 轉(zhuǎn)錄因子由位于N端的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain)、調(diào)控激活結(jié)構(gòu)域(Transcriptional activation domain)以及負(fù)調(diào)控區(qū)(Negative regulatory region)組成。根據(jù)包含保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量,MYB 轉(zhuǎn)錄因子被分為1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB 和4R-MYB 4類[3-6]。其中,R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多。研究發(fā)現(xiàn),R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子中的AtMYB102 可參與調(diào)控?cái)M南芥對鹽脅迫、干旱脅迫、機(jī)械傷害、滲透脅迫、菜青蟲取食的響應(yīng),并能調(diào)控?cái)M南芥正常生長與響應(yīng)脅迫之間的動(dòng)態(tài)平衡[6-14],水稻、番茄等其他植物中MYB102 也有相似功能。Zhu 等[15]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將AtMYB102基因在擬南芥中過量表達(dá)獲得過表達(dá)(MYB102-OX)株系,通過對比過表達(dá)株系和缺失突變體(myb102)株系接種蚜蟲后內(nèi)源乙烯含量、單株蚜蟲數(shù)、NtMYB102基因及乙烯生物合成基因等的相對表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AtMYB102基因可導(dǎo)致擬南芥易受蚜蟲為害;Piao等[16]發(fā)現(xiàn)水稻中OsMYB102基因可通過下調(diào)脫落酸合成延緩葉片衰老,在擬南芥中過表達(dá)OsMYB102基因可導(dǎo)致擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫更敏感;Zhang 等[17]在番茄中過表達(dá)SlMYB102基因,發(fā)現(xiàn)SlMYB102基因受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)后可提高番茄對鹽脅迫的抗性。然而,煙草中NtMYB102基因的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。為此,同源克隆NtMYB102基因,使用在線工具預(yù)測NtMYB102 蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)域以及NtMYB102基因上游順式作用元件;下載NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù),分析煙草接種青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum,青枯病病原菌)后NtMYB102基因的表達(dá)量,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法分析煙草接種蚜蟲后NtMYB102基因的相對表達(dá)量變化,以期為煙草抗病蟲育種提供依據(jù)。
序列克隆中使用的煙苗(煙草品種K326)于LRH-800-GSI 型光照培養(yǎng)箱(廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司)中培養(yǎng),條件設(shè)置為溫度25 ℃,光照8 h/d。接種蚜蟲試驗(yàn)中的供試煙苗(煙草品種中煙100)按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 25241.1—2010[18]中漂浮育苗的方法培養(yǎng)于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育苗大棚中。
1.2.1NtMYB102基因的克隆
在擬南芥信息資源中心(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥AtMYB102 蛋白的氨基酸序列,并將下載的序列在NCBI 和茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net)中分別進(jìn)行BLAST比對,獲得與AtMYB102 蛋白相似度最高的煙草NtMYB102基因序列,根據(jù)序列設(shè)計(jì)NtMYB102基因特異引物102F(5'-ATGGGAAGAGCTCCTTGTTGTG-3')和102R(5'-GACTTACATAAATTCATTAGTGG-3')。使用RealPure 普通植物RNA 提取試劑盒[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]提取K326幼苗的mRNA后,使用All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix(with dsDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京密碼子生物科技有限公司)合成cDNA 并將其作為模板,以102F和102R 作為擴(kuò)增引物,使用2×SanTaq PCR Mix 試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR 產(chǎn)物。將PCR 產(chǎn)物送交生工生物工程(上海)股份有限公司,由該公司采用Sanger 測序法獲取NtMYB102基因的CDS序列。
1.2.2NtMYB102基因及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析
使用在線工具Translate(https://web.expasy.org/translate)將NtMYB102基因的CDS 序列翻譯為蛋白序列,并使用在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和在線工具ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白理化性質(zhì)。從茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫中下載NtMYB102基因上游2 000 bp 的序列。使用在線工具NNPP(Neural Network Promoter Prediction,https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)分析NtMYB102基因上游2 000 bp 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);使用在線工具NSITE-PL(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=nsitep&group=programs&subgroup=promoter)與順式作用元件數(shù)據(jù)庫PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分別分析NtMYB102基因上游2 000 bp 的啟動(dòng)子順式作用元件。使用在線工具 SignalP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0)預(yù)測蛋白信號肽。使用在線工具TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域。使用在線工具M(jìn)otif search(https://www.genome.jp/tools/motif/)和在線工具InterProScan(https://www.ebi.ac.uk/interpro/about/interproscan/)分析蛋白的結(jié)構(gòu)域、基序(Motif)和所屬家族。其中,在線工具M(jìn)otif search 的檢索范圍為Pfam、NCBI-CDD、Prosite profile 3 個(gè)網(wǎng)站。使用蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)、在線工具PredictProtein(https://predictprotein.org)和SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org)分析蛋白二級結(jié)構(gòu)和3D 結(jié)構(gòu)。使用在線工具NetPhos 3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)預(yù)測蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)。從茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫及本氏煙基因組數(shù)據(jù)庫(http://benthgenome.qut.edu.au/)下載獲得番茄、茄子、馬鈴薯和本氏煙等茄科植物的MYB102 蛋白序列,并采用最大似然(Maximum Likelihood)法使用MEGA 11.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.2.3 煙草接種青枯雷爾氏菌后NtMYB102基因的表達(dá)量分析
使用SRA-Toolkit 軟件(https://github.com/ncbi/SRA-tools)從NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫中下載抗煙草青枯病品種巖煙97 和感煙草青枯病品種紅花大金元接種青枯雷爾氏菌后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRA ID 為SRP423092)。將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)的FASTQ格式文件后,使用fastp軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控[19]。使用HISAT2 軟件將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)映射至煙草參考基因組,參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)[20]。使用SAMtools 軟件對映射結(jié)果進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換、排序,并使用StringTie 軟件對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝和量化[21-22];使用StringTie 軟件的Python 腳本prepDE.py(https://ccb.jhu.edu/software/StringTie/dl/prepDE.py)獲得原始reads 計(jì)數(shù)[22]。使用Ballgown 軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)量[TPM(Transcripts Per Million)值][23]。提取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中NtMYB102基因的TPM 值,分析煙草接種青枯雷爾氏菌后12、24、36 和120 h 感病品種和抗病品種中NtMYB102基因的表達(dá)量與0 h 的差異。
1.2.4 煙草接種蚜蟲后NtMYB102基因的相對表達(dá)量分析
供試煙苗(中煙100)在育苗大棚中采用漂浮育苗法培養(yǎng)至3~4 片真葉時(shí),移栽到花盆中培養(yǎng),每盆1 株,接種18 株。至7~8 片真葉時(shí),選擇整齊一致的煙苗,外罩防蟲網(wǎng)(孔徑0.15 mm),在煙苗最頂部的3 片葉上接種蚜蟲,每株接種4 齡無翅成蚜20 頭。在接種蚜蟲后0、6、12 和24 h 取接種葉片,分析NtMYB102基因的相對表達(dá)量變化,試驗(yàn)設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù),RNA 提取使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 試劑盒(日本TaKaRa公司)、cDNA 合成使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa 公司)。根據(jù)ABI 7500 Fast 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems 公司)操作說明及TB Green?PremixEx TaqTM試劑盒(日本TaKaRa 公司)的說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。以NtActin基因作為內(nèi)參,采用2-△△CT法[24]計(jì)算NtMYB102基因相對表達(dá)量。用于分析NtMYB102基因相對表達(dá)量的引物序列為q-F(5'-GCTGGACTTCAAAGGTGTGG-3')和q-R(5'-GCAGCAATAGCAGACCACTT-3')。使用DPS 14.5 軟件對相對表達(dá)量進(jìn)行方差分析,采用LSD 法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性檢驗(yàn)。
以K326幼苗cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR 產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)PCR 產(chǎn)物的長度約為1 100 bp(圖1)。Sanger 測序的結(jié)果表明,NtMYB102基因CDS 序列全長1 131 bp,序列與NCBI和茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫中一致。
圖1 NtMYB102基因CDS區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis map for CDS region in NtMYB102 gene
使用在線工具Translate 將NtMYB102基因的CDS 區(qū)翻譯為蛋白,發(fā)現(xiàn)該基因無內(nèi)含子,編碼的蛋白由376 個(gè)氨基酸組成。使用在線工具ProtParam 對NtMYB102 蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白分子量為42.817 kDa,理論等電點(diǎn)為5.77,分子式為C1859H2874N534O596S18,由5 881個(gè)原子組成,不穩(wěn)定指數(shù)為50.35,在植物體內(nèi)為不穩(wěn)定的蛋白。根據(jù)在線工具ProtScale對NtMYB102蛋白疏水性的分析結(jié)果,NtMYB102蛋白的親水區(qū)域(疏水性標(biāo)度值為負(fù)值)多于疏水區(qū)域(疏水性標(biāo)度值為正值),表明NtMYB102蛋白是一種親水蛋白(圖2)。
圖2 NtMYB102蛋白的疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.2 Predicted hydrophobicity of NtMYB102 protein
使用在線工具NNPP 對NtMYB102基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)NtMYB102基因啟動(dòng)子序列為5'-ATCCTCCCTATATATATACCCCCTCCCCTTAT TCTTAATCTCCAGCAATA-3',其中加下劃線的T為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。使用在線工具Nsite-PL及數(shù)據(jù)庫PlantCare 對NtMYB102基因上游2 000 bp 順式作用元件進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)在NtMYB102基因的上游存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。其中,-1 607 bp 至-1 614 bp 為依賴 ABA 的脅迫響應(yīng)元件 ABRE(TACGTGGC);-1 577 bp 至-1 585 bp 及-188 bp至-196 bp 為與防御和脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件TC-rich repeats(GTTTTCTTAC);-1 304 bp至-1 310 bp為參與調(diào)控植物抗病相關(guān)基因表達(dá)的元件GCC-box(AGCCGCC);-521 bp 至-526 bp 為響應(yīng)水分脅迫、鹽脅迫、滲透脅迫及ABA 的元件Myba(CGGTTG);-205 bp 至-210 bp 為真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件W-box(TTGACC)。
在線工具SignalP 6.0 對NtMYB102 蛋白的預(yù)測結(jié)果表明,該蛋白不存在信號肽。在線工具TMHMM 對跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明,NtMYB102蛋白無跨膜區(qū)。使用在線工具M(jìn)otif search 和InterProScan 對NtMYB102 蛋白的結(jié)構(gòu)域、基序和所屬家族進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3所示。Prosite profile網(wǎng)站中檢索到1 個(gè)具有DNA 結(jié)合位點(diǎn)特征的HTH_MYB motif,NBCI-CDD 網(wǎng)站中檢索到9 個(gè)具有DNA 結(jié)合功能的SANT/MYB motif,Pfam 網(wǎng)站中檢索到4個(gè)具有DNA結(jié)合功能的Myb_DNA-bingding motif。在線工具InterProScan對NtMYB102蛋白的分析發(fā)現(xiàn),該蛋白為DNA結(jié)合蛋白,屬于MYB 家族,具有2 個(gè)Myb_DNA-binding保守結(jié)構(gòu)域。
圖3 NtMYB102蛋白的結(jié)構(gòu)域及基序預(yù)測結(jié)果Fig.3 Predicted domains and motifs of NtMYB102 protein
使用Phyre2軟件對NtMYB102蛋白的二級結(jié)構(gòu)和3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該蛋白存在α螺旋,無β折疊鏈;蛋白的3D 結(jié)構(gòu)中有多個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)(圖4)。使用在線工具PredictProtein 和SWISS MODEL 對NtMYB102 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和3D 結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果與Phyre2軟件的預(yù)測結(jié)果一致。
圖4 NtMYB102蛋白的二級結(jié)構(gòu)和3D結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure and 3D structure of NtMYB102 protein
對NtMYB102 蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該蛋白存在大量可被磷酸化的位點(diǎn)(圖5)。其中,評分最高的3 個(gè)磷酸化位點(diǎn)為位于第71、355 和347 個(gè)氨基酸的絲氨酸,評分分別為0.998、0.996 和0.994 分。NtMYB102 蛋白可能通過上述位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾的方式參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
圖5 NtMYB102蛋白中磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果Fig.5 Predicted phosphorylation sites in NtMYB102 protein
對NtMYB102 蛋白序列以及本氏煙、茄科其他近緣種(辣椒、茄子等)和棉屬植物等的MYB102 同源蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)NtMYB102 蛋白與本氏煙中NbMYB102 蛋白的親緣關(guān)系最近,與辣椒和茄子等其他茄科作物MYB102 蛋白的親緣關(guān)系較近,與擬南芥、大豆、棉花和茶樹等其他植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。
圖6 MYB102蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of MYB102 protein
接種青枯雷爾氏菌后,抗病和感病煙草品種的NtMYB102基因表達(dá)量(TPM 值)變化如圖7 所示??共煵萜贩N巖煙97 接種青枯雷爾氏菌后12 hNtMYB102基因的表達(dá)量高于0 h,但差異未達(dá)顯著水平;接菌后24、36 和120 hNtMYB102基因的表達(dá)量均低于0 h。其中,接菌后36 hNtMYB102基因的表達(dá)量與0 h 比差異顯著(P<0.05)。感病品種紅花大金元接種青枯雷爾氏菌后12和24 hNtMYB102基因的表達(dá)量高于0 h。其中,接菌后24 hNtMYB102基因的表達(dá)量與0 h差異達(dá)顯著(P<0.05)水平;接菌后36和120 hNtMYB102基因的表達(dá)量與0 h無顯著差異。
圖7 接種青枯雷爾氏菌后巖煙97及紅花大金元中NtMYB102基因表達(dá)量Fig.7 Expression level of NtMYB102 gene in Yanyan 97 and Honghuadajinyuan after being infected by R.solanacearum
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法分析煙草接種蚜蟲后NtMYB102基因的相對表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)接種4齡無翅成蚜后6、12 和24 h,煙草NtMYB102基因的相對表達(dá)量均極顯著(P<0.01)高于0 h(圖8)。接種后6 h,NtMYB102基因的相對表達(dá)量為4.58;接種后12 h,相對表達(dá)量為5.00;接種后24 h,相對表達(dá)量為6.46。接種后24 h,NtMYB102基因的相對表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于接種后0、6 和12 h;接種后6 和12 h 的相對表達(dá)量間無顯著差異。綜上,NtMYB102基因能夠在接種蚜蟲后6~24 h 快速響應(yīng),相對表達(dá)量顯著上調(diào),表明該基因在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)蚜蟲取食,可能參與煙草抗蟲性的調(diào)控。
圖8 接種蚜蟲后煙草NtMYB102基因的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression of NtMYB102 gene in tobacco after aphids infestation
本研究中發(fā)現(xiàn)NtMYB102基因上游2 000 bp 包含了多種響應(yīng)逆境脅迫以及調(diào)控植物中與病原菌侵染誘導(dǎo)和防御相關(guān)基因的順式作用元件(ABRE、TC-rich repeat、GCC box、BREB 和W-box),表明該基因可能受病原侵染和逆境脅迫的誘導(dǎo),這與擬南芥、水稻和番茄等植物中關(guān)于MYB102基因功能研究的結(jié)果一致[25-27]。根據(jù)對NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)的分析結(jié)果,抗煙草青枯病品種接種青枯雷爾氏菌后36 h,NtMYB102基因的表達(dá)量顯著(P<0.05)低于0 h,這與劉徹等[28]的研究結(jié)果一致。接種青枯雷爾氏菌后,抗病和感病煙草品種NtMYB102基因的表達(dá)量變化趨勢不同,表明NtMYB102基因是抗病和感病煙草品種中響應(yīng)病原菌侵染的差異表達(dá)基因,可能在調(diào)控?zé)煵輰η嗫莶】共⌒灾衅鹬匾饔谩:罄m(xù)研究可采用基因組編輯技術(shù)對NtMYB102基因的表達(dá)量進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控,驗(yàn)證NtMYB102基因功能,然后使用基因組編輯技術(shù)對感青枯病煙草品種進(jìn)行定向改良。此外,中煙100 接種蚜蟲后6、12 和24 h,NtMYB102基因的相對表達(dá)量持續(xù)上調(diào),且均顯著(P<0.05)高于0 h,該趨勢與擬南芥被蚜蟲取食后AtMYB102基因的表達(dá)變化規(guī)律一致[15],推測NtMYB102基因可能參與煙草響應(yīng)蚜蟲取食,可作為抗蚜蟲育種的候選基因。
從煙草K326中克隆了擬南芥AtMYB102的同源基因NtMYB102。煙草NtMYB102基因的CDS 全長1 131 bp,編碼376 個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,NtMYB102基因的上游2 000 bp 存在多個(gè)響應(yīng)脅迫、響應(yīng)真菌誘導(dǎo)和與防御相關(guān)的順式作用元件。接種青枯雷爾氏菌后36 h,抗病煙草品種中NtMYB102基因的表達(dá)量顯著下調(diào),表明該基因可能在煙草響應(yīng)青枯雷爾氏菌侵染中起調(diào)控作用。煙草接種蚜蟲后6~24 h,NtMYB102基因的相對表達(dá)量顯著提高,表明該基因可能在煙草響應(yīng)蚜蟲取食中起調(diào)控作用。