煙草番茄環(huán)紋斑點病毒快速檢測試紙條的研制及應(yīng)用

姜 寧，夏振遠，盧燦華，黃昌軍，馬俊紅，劉春明，蓋曉彤*

1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明市五華區(qū)圓通街33 號 6500212.云南省煙草公司紅河州公司，云南省紅河州彌勒市溫泉路 652399

番茄環(huán)紋斑點病毒（tomatozonatespotvirus，TZSV）屬于正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），是正番茄斑萎病毒屬的一個新種，于2005 年在我國云南省的番茄和辣椒產(chǎn)區(qū)中被發(fā)現(xiàn)，由Dong 等［1］分離并正式命名。TZSV 自然條件下可侵染番茄（Lycopersicumesculentum）、辣椒（Capsicumannuum）、普通煙草（Nicotianatabacum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、文殊蘭（Crinumasiaticum）、蜘蛛蘭（Hymenocallislittoralis）、鳶尾（Iristectorum）、鬼針草（Bidenspilosa）等20多種植物，目前主要分布在我國的云南、廣西等地［1-8］。TZSV 主要以西花薊馬（Frankliniellaoccidentalis）、棕櫚薊馬（Thripspalmi）、煙薊馬（T.tabaci）等多種薊馬為介體，通過持久增殖型的方式進行傳播，同時還可以通過嫁接和汁液摩擦傳播［1，9-12］。該病毒可引起多種經(jīng)濟作物斑萎病，常與其他病毒復(fù)合侵染加重癥狀，嚴重時甚至絕收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大經(jīng)濟損失［13-14］。TZSV 在寄主上引起的癥狀主要與品種、寄主生育時期、環(huán)境條件等因素有關(guān)。受TZSV侵染的烤煙煙株在發(fā)病初期，葉片上會出現(xiàn)同心環(huán)紋或細小壞死斑點，隨后壞死范圍擴大，葉片上出現(xiàn)大量壞死環(huán)斑或連片壞死，主葉脈扭曲，植株頂芽壞死萎蔫，在團棵期以前發(fā)病的煙株常整株壞死［13，15-16］。根據(jù)于海芹等［2］的報道，云南省煙草斑萎病發(fā)病煙株中，27%以上由TZSV 引起，TZSV 已成為云南煙區(qū)煙草斑萎病的主要病原，嚴重影響烤煙生產(chǎn)。然而，其在煙草上引起的癥狀與番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）等正番茄斑萎病毒屬病毒在煙草上引起的癥狀相似，通過肉眼難以辨別。目前，檢測TZSV 的方法主要有電子顯微鏡檢測［17］、分子生物學(xué)檢測［4，18］、血清學(xué)檢測等［19-21］。電鏡檢測、分子生物學(xué)檢測，以及血清學(xué)檢測中的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測耗時長，且需要專業(yè)檢測設(shè)備和技術(shù)嫻熟的專業(yè)人員，成本高，不適合田間病害的快速檢測［22］。目前，國內(nèi)科研人員制備了TZSV 的單克隆抗體［19-21］，并在此基礎(chǔ)上制備了TZSV 的膠體金免疫層析試紙條（colloidal gold immunochromatographic strip，GICA），然而目前國內(nèi)外市場上并沒有商品化的TZSV檢測試紙條。為此，制備了TZSV N蛋白單克隆抗體，并研制了能夠快速檢測TZSV 的膠體金試紙條，旨在實現(xiàn)煙葉生產(chǎn)中TZSV的快速檢測鑒定，為煙草斑萎病的有效防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

試劑耗材：酵母提取物、胰蛋白胨、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷［IPTG（英國OXOID公司）］；BL21 感受態(tài)（自制）；預(yù)染蛋白Marker、蛋白濃度定量試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；牛血清白蛋白BSA（美國Merck 公司）；碳酸氫鈉、無水碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鉀、Tris、檸檬酸、氯金酸、檸檬酸三鈉、蔗糖、海藻糖、氫氧化鈉、吐溫-20、甲醇等（國產(chǎn)分析純）；NC膜（德國Sartouris公司）。

儀器：超聲波細胞破碎儀（美國Branson 公司）；全溫度振蕩培養(yǎng)箱（上海旻泉儀器有限公司）；高速冷凍離心機、低溫高速離心機、可調(diào)微量加樣器、小型臺式離心機（德國Eppendorf公司）；恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（德國Binder 公司）；純水儀（美國Millipore 公司）；水平搖床（太倉華利達實驗設(shè)備有限公司）；pH 計（瑞士Mettler Toledo 公司）；噴金劃膜機、切條機、壓卡機、封口機（杭州峰航科技有限公司）。

病毒材料：采自云南植煙區(qū)玉溪、紅河、昆明、麗江、臨滄、普洱、文山、昭通、曲靖等州（市）的田間發(fā)病煙葉樣品131個，樣品經(jīng)PCR檢測為TZSV陽性后用于試紙條的檢測。煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）、TSWV、南美紅辣椒脈斑駁病毒（chilli veinal mottle virus，ChiVMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、煙草脈帶花葉病毒（tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）等均由本課題組純化保存。

1.2 方法

1.2.1 TZSVN基因蛋白表達和純化

序列合成：根據(jù)TZSV 云南分離物N基因序列（GenBank Accession number NC_010489），優(yōu)化密碼子，合成并克隆到載體pET28a，得到質(zhì)粒pET28a-TZSV-N，序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。質(zhì)粒pET28a-TZSV-N 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），并篩選陽性克隆。

蛋白表達：固體平板上挑取pET28a-TZSV-N 單克隆菌落接入5 mL LB 液體培養(yǎng)基（卡那質(zhì)量濃度50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)12～14 h。次日，菌種以1∶50（體積比）接入LB 液體培養(yǎng)基（卡那質(zhì)量濃度50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)至OD值0.4～0.6，加入IPTG至終濃度0.8 mol/L，25 ℃誘導(dǎo)表達6 h，菌液8 000 r/min、4 ℃離心（5810R，德國Eppendorf 公司）15 min，并收集菌體。

菌種裂解：加入100 mL 破碎液進行超聲破碎。裂解條件：冰浴、功率60%、超聲2 s、間隔2 s、時間15 min。超聲破碎后12 000 r/min、4 ℃離心15 min，并收集上清液和沉淀。

上清液純化：收集的上清液利用高親和性Ni 樹脂進行純化，并收集穿出液、洗脫液，由SDS-PAGE檢測純化效果。

1.2.2 雜交瘤細胞和單克隆抗體制備

將表達純化的蛋白與等體積的弗氏佐劑混合乳化均勻，成油包水狀態(tài)，用于免疫小鼠試驗。將乳化后的蛋白免疫4只BALB/c小鼠，皮下免疫3次，間隔28 d，最后經(jīng)間接ELISA 檢測效價［23］。細胞融合參照趙丹丹等［24］的方法，最后一次免疫14 d 后腹腔注射抗原進行加強免疫，3 d后進行細胞融合。將融合好的細胞進行96 孔鋪板，用HAT 培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，3 d后更換并改用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。10 d后，取細胞培養(yǎng)上清液進行檢測。使用有限稀釋法對陽性孔進行克隆，直到得到的克隆均為陽性，最終獲得雜交瘤細胞。

提前7 d在小鼠腹腔中注射礦物油，將一定數(shù)量的雜交瘤細胞注射入小鼠腹腔，10 d左右收集腹水，4 000 r/min 離心15 min，上清液即為單克隆抗體腹水。參照尚海麗等［25］的方法進行單克隆抗體純化。以間接ELISA方法對純化后抗體進行效價檢測［23］。

應(yīng)用小鼠抗體亞型檢測試劑盒（美國Proteintech公司）對抗體進行亞型檢測。應(yīng)用雙抗夾心的金標方法篩選可以配對的抗體對。

1.2.3 TZSV膠體金快速檢測試紙條制備

參照魏梅生等［26］的方法，采用檸檬酸三鈉還原方法制備膠體金。TZSV 膠體金快速檢測試紙由樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊（吸收墊）和背板組成；樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次疊加粘貼在背板上，各組分間相互疊加2.5 mm；金標墊上包被有膠體金標記的抗TZSV單克隆抗體（由10#雜交瘤細胞產(chǎn)生）；硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線（Test line，T線）和質(zhì)控線（Control line，C線），檢測線包被有抗TZSV病毒單克隆抗體（由55#雜交瘤細胞產(chǎn)生），質(zhì)控線包被有抗鼠IgG二抗。

質(zhì)控線包被的抗鼠IgG 二抗的質(zhì)量濃度為1 mg/mL。樣品墊的大小為3 mm×15 mm，金標墊的大小為3 mm×3 mm，硝酸纖維素膜的大小為3 mm×28 mm，吸收墊的大小為3 mm×19 mm。檢測線與質(zhì)控線間的間距為6.0 mm～6.5 mm。

在底板上依次粘貼樣品墊和固定有膠體金標記的TZSV單克隆抗體的金標墊、硝酸纖維素膜以及吸收墊，切條機裁切成3 mm 寬，獲得TZSV 膠體金快速檢測試紙條。

1.2.4 檢測方法

準備待測樣品液，取200 μL 待測液加入1.5 mL離心管，取試紙條將有樣品墊的一端插入離心管，接觸待測液，5 min 左右判斷結(jié)果。若C 線顯色而T 線未顯色，則結(jié)果為陰性；若C 線和T 線均顯色，結(jié)果為陽性；若C線和T線均未顯色或T線顯色而C線未顯色，則結(jié)果無效。

1.2.5 試紙條性能評價試驗

1.2.5.1 靈敏度測試

將0.1 g 感染TZSV 的煙草葉片充分研磨，加入1 mL 0.1 mol/L PBS作為病毒汁液的10倍稀釋液，依次配制102、103、104、105倍的病毒汁液稀釋液。

1.2.5.2 特異性測試

將含TMV、PVY、CMV、TVBMV、ChiVMV、TSWV和TZSV的發(fā)病葉片制備成10倍病毒汁液稀釋液，分別取200 μL用TZSV快速檢測試紙條檢測。

1.2.5.3 田間樣品檢測

田間采集疑似煙草斑萎病的樣品，提取RNA，RT-PCR 鑒定其中的TZSV，所用引物為TZSV N 基因特異性引物。上游引物TZSV-N（5'-3'）：TTAAAA AGACAGATCATTGCTGCT；下游引物TZSV-NR（5'-3'）：ATGTCTAACGTCCGGAGTTTAAC，參考尹躍艷等［27］的方法設(shè)計。用TZSV 試紙條對所有TZSV RT-PCR 檢測為陽性的樣品進行測試，并計算兩種檢測方法的符合度。

1.2.5.4 穩(wěn)定性測試

將制備好的TZSV快速檢測試紙條密封后在4、25、37 ℃3個溫度條件下保存，并在第0、1、2、3、4、5、6個月后取出，分別檢測TZSV陽性樣品和健康煙葉（陰性對照），并檢測其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TZSV云南省株系N蛋白原核表達

對TZSV云南株系N蛋白序列的親疏水性、信號肽、跨膜域、基本結(jié)構(gòu)等進行理論評估，為了更好地進行原核表達，對該基因序列進行了密碼子優(yōu)化（圖1）。優(yōu)化后的序列與原序列相比，核苷酸同源性為77.6%，而氨基酸序列完全一致。采用基因合成的方式構(gòu)建質(zhì)粒并克隆到表達載體pET28a上，進一步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞（BL21）。

融合蛋白經(jīng)過純化，可在上清液中大量表達，經(jīng)驗證在200～500 mmol/L 咪唑的洗脫下可最大量純化該融合蛋白。SDS-PAGE 電泳分析在理論分子量35 kDa 相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，初步確定融合蛋白成功得到了純化（圖2）。

圖2 SDS-PAGE檢測純化后的重組TZSV N蛋白Fig.2 Purified recombinant TZSV N protein after SDS-PAGE test

2.2 TZSV單克隆抗體制備

取4 只6 周齡雌性BALB/c 小鼠，在第0、13、33天共進行3次免疫。每次每只小鼠抗原免疫用量為25 μg，初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，皮下多點注射。第2次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，皮下多點注射，第3次免疫用等量生理鹽水混合，腹腔注射。第2 次免疫后20 d 尾靜脈采血，通過間接ELISA 法測抗體效價，以此確定小鼠體內(nèi)是否有抗體生成。比較4只小鼠的效價，選擇抗體效價較高的小鼠用于細胞融合。融合前3 d 用抗原直接加強免疫1次。

共獲得陽性單克隆雜交瘤細胞株55 株（1#～55#）。收集雜交瘤細胞，制備并收集小鼠腹水，田間采集的TZSV陽性樣品以103倍病毒汁液稀釋液為待測樣品，采用間接ELISA法測定抗體效價，效價最高可達1∶1 024 000?？贵w類型及亞類鑒定結(jié)果表明，55 個單抗中有54 個單抗類型為IgG1，1 個單抗類型為IgG2b，所有單克隆抗體均為κ輕鏈。選擇其中能夠高效分泌TZSV 單抗且效價高的9#、10#、45#和55#雜交瘤細胞進行后續(xù)試驗。

2.3 TZSV試紙條性能測試

按照1.2.3 的方法制備TZSV 快速檢測試紙條。首先對試紙條靈敏度進行檢測。經(jīng)測試，10#單抗標金/55#單抗噴膜抗體組合檢測效果最好。利用田間發(fā)病的TZSV 陽性煙葉樣品進行靈敏度檢測。結(jié)果（圖3）顯示，10#單抗標金/55#單抗噴膜的試紙條靈敏度最佳，在病毒汁液稀釋104倍時T 線仍清晰可見，病毒汁液稀釋105倍時隱約有線。

圖3 TZSV試紙條靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity evaluation on test strips for TZSV

以陽性的TMV、PVY、CMV、TVBMV、ChiVMV、TSWV 和TZSV 發(fā)病葉片作為待測樣品對TZSV 試紙條特異性進行檢測，結(jié)果見圖4。由圖4 可見，試紙條僅對TZSV樣品有陽性反應(yīng)，其他病毒陽性樣品檢測結(jié)果均為陰性，表明TZSV試紙條具有良好的特異性。

圖4 TZSV試紙條特異性檢測Fig.4 Specificity evaluation on test strips for TZSV

田間采集疑似煙草斑萎病的煙草樣品，提取RNA，通過RT-PCR 鑒定其中的TZSV。鑒定為TZSV 陽性的131 個煙草樣品用本研究中制備的TZSV快速檢測試紙條進行檢測，其中126個樣品經(jīng)試紙條檢測為陽性，符合率為96.2%。

TZSV 試紙條穩(wěn)定性評價。將試紙條置于4、25、37 ℃環(huán)境條件下保存6個月，期間每隔1個月取出試紙條檢測陰性對照和TZSV 陽性樣品，結(jié)果見表1。在穩(wěn)定性評價6 個月時間內(nèi)，試紙條在3 種溫度條件下均保持良好的穩(wěn)定性，無假陽性和假陰性出現(xiàn)。

表1 不同溫度條件下TZSV試紙條穩(wěn)定性檢測結(jié)果①Tab.1 Stability evaluation results of test strips for TZSV at different temperatures

3 討論

煙草斑萎病已成為影響我國西南煙區(qū)烤煙生產(chǎn)的重要病毒病，其病原是以TSWV 和TZSV 為主的多種正番茄斑萎病毒屬病毒［2］。不同病毒引起的煙草斑萎病癥狀類似，僅憑肉眼難以區(qū)分。此外，苗期的煙草斑萎病檢測對于育苗質(zhì)量監(jiān)測尤為重要。目前市場上已有TSWV的快速檢測產(chǎn)品，但沒有TZSV的快速檢測試紙條。我國已有科研人員制備了TZSV單克隆抗體并制備了TZSV快速檢測試紙條，但其對煙草病汁液的檢測限介于1∶810～1∶2 430，且并未對田間自然發(fā)病的TZSV煙葉樣品進行檢測［19-21］。本研究中制備的TZSV 快速檢測試紙條檢測TZSV陽性煙草葉片病汁液可稀釋10 000 倍（質(zhì)量體積比），靈敏度高，可在5 min內(nèi)實現(xiàn)田間發(fā)病煙草斑萎病樣品的快速檢測。本研究中制備的TZSV 快速檢測試紙條檢測結(jié)果與RT-PCR 檢測結(jié)果的吻合率為96.2%，少量RT-PCR檢測結(jié)果為TZSV陽性的樣品，TZSV試紙條檢測結(jié)果為陰性，這說明試紙條檢測的靈敏度略低于RT-PCR。由于病毒在葉片上分布不均，這一結(jié)果也可能與不同采樣煙葉部位病毒含量差異有關(guān)。根據(jù)云南省煙草斑萎病病原組成特點，下一步可嘗試制備同時檢測TSWV 和TZSV 的多重檢測試紙條。本研究中制備的TZSV 快速檢測試紙條可對田間煙葉和煙田周邊雜草上的TZSV 實現(xiàn)快速檢測，基于其較高的靈敏度，本研究中制備的TZSV 單抗和快速檢測試紙條具有檢測傳毒昆蟲薊馬是否帶毒的潛力，但還需進一步驗證。

4 結(jié)論

①獲得了TZSV 單克隆抗體。②制備了TZSV膠體金快速檢測試紙條，可在5 min內(nèi)完成煙草病毒的檢測。③試紙條檢測陽性TZSV 的煙草病汁液的靈敏度高，可稀釋10 000 倍（質(zhì)量體積比）。同時與煙草上常見的TMV、PVY、CMV 和TSWV 等病毒沒有交叉反應(yīng)，可特異性地檢測田間煙葉樣品中的TZSV。