miR-218-5p靶向TPX2調(diào)節(jié)p53通路影響肺腺癌惡性進展

許建功

據(jù)世界衛(wèi)生組織對于2020年全球癌癥發(fā)病情況的統(tǒng)計[1]，肺癌是癌癥死亡的主要原因。在全球的肺癌病例中，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）作為肺癌的一種亞型，確診病例約占所有肺癌病例的40%[2]。雖然近年新的藥物和治療方法使得LUAD患者的生存情況有所改善，但由于患者被診斷時往往已為晚期以及藥物抗性等原因，使得LUAD死亡率正逐年增加[3]。因此，深入理解LUAD調(diào)控惡性表型的機制對于藥物的開發(fā)、診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等十分重要和緊急。

靶向Xklp2靶蛋白（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2, TPX2）是減數(shù)分裂和有絲分裂的重要調(diào)控因子。近幾年來TPX2因在乳腺癌、肝細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等多種人類惡性腫瘤中出現(xiàn)顯著高表達(dá)，被認(rèn)為是潛在的癌基因[4-6]。Li等[7]的研究表明TPX2有成為前列腺癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力。此外，TPX2與癌癥的進展密切相關(guān)，例如：在膽管癌、肝細(xì)胞癌和前列腺癌中TPX2表達(dá)水平與癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相關(guān)[8-10]；在結(jié)直腸癌中TPX2高表達(dá)且促進癌癥的進展[11]。有研究[12]報道TPX2可能是LUAD預(yù)后的獨立因素，并可能通過參與LUAD中的幾種癌癥相關(guān)信號通路促進癌癥發(fā)生發(fā)展。另外，有研究[13]表明沉默TPX2能促進LUAD細(xì)胞A549凋亡以及促進p53蛋白表達(dá)，表明TPX2可能是LUAD的促癌基因，TPX2在LUAD中的調(diào)控機制值得進一步挖掘并驗證，進而明確其調(diào)控作用以及上下游調(diào)控機制。因此本研究選擇TPX2作為研究對象。

本研究旨在以TPX2為出發(fā)點，深入探究其在LUAD中的上游和下游調(diào)控機制，以及其串聯(lián)軸對LUAD惡性發(fā)展過程的具體作用，幫助深入理解TPX2發(fā)揮調(diào)控作用的具體機制，為尋找LUAD的靶向診斷和治療的新方法提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本 收集2023年1月至2023年3月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的新鮮LUAD組織標(biāo)本和配對癌旁組織標(biāo)本各20例。患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞 研究所用的人肺上皮細(xì)胞系BE A S-2 B細(xì)胞（CTCC-400-0007）和人LUAD細(xì)胞A549 細(xì)胞（CTCC-001-0036）、A-427細(xì)胞（CTCC-001-0055）、Calu-3細(xì)胞（CTCC-003-0104）、PC-9（CTCC-400-0185）、H1975（CTCC-001-0354）均購自于美森細(xì)胞。

1.3 主要試劑 胎牛血清購自以色列Bioind公司；青鏈霉素混合液購自中國Solarbio公司；BEGM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自瑞士Lonza公司；F-12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基、EMEM完全培養(yǎng)基、RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自中國中喬新舟生物科技公司；Trizol、RIPA緩沖液、Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-NC、miR-218-5p mimic、siRTPX2、siR-NC均購自中國銳博生物；pcDNA3.1-TPX2和pcDNA3.1空白質(zhì)粒均購自中國生工生物工程公司；p53抑制劑pifithrin-α（PFT-α）購自德國Merck公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR、miRNA 1stStrand cDNA Synthesis

試劑盒購自中國諾唯贊公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司；細(xì)胞活力檢測（cell counting kit-8,CCK-8）試劑購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)膠購自美國Corning公司；BCA蛋白檢測試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光試劑購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自中國雅酶公司；雙熒光素酶表達(dá)載體pmirGLO-Vector、雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；一抗TPX2、p53、p-p53（Ser15）、MDM2、Bax、GAPDH及二抗山羊抗兔IgG均購于英國Abcam公司。

1.4 生信分析 從腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載LUAD的miRNA成熟體（Normal:n=46, Tumor:n=521）、mRNA的表達(dá)量數(shù)據(jù)（Normal:n=59, Tumor:n=535），利用“edgeR”包對miRNA（|logFC|>1,Padj<0.05）、mRNA（|logFC|>2,Padj<0.05）進行Normal組和Tumor組的差異分析獲得差異miR NA及差異mR NA，通過文獻(xiàn)參考確定目標(biāo)基因mRNA。利用starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）、mirDIP（http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp#r）數(shù)據(jù)庫預(yù)測目標(biāo)基因mRNA的上游調(diào)控基因，獲得與目標(biāo)基因mRNA靶向結(jié)合位點的差異miRNA。通過GSEA軟件對目標(biāo)基因mRNA進行通路富集分析，研究目標(biāo)mRNA的下游效應(yīng)物。

1.5 免疫組化 將LUAD和癌旁臨床組織樣本固定包埋并切片后，4oC下與一抗TPX2（1:1000）孵育過夜，隨后加入二抗孵育30 min，采用蘇木素染核，梯度酒精脫水，樹脂封片。倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B在添加了10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的BEGM中培養(yǎng)；LUAD細(xì)胞A549在添加了10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的F12K中培養(yǎng)；LUAD細(xì)胞A-427、H1975、PC-9在添加了10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640中培養(yǎng)。所有細(xì)胞置于37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理 使用miR-218-5p mimic、siR-TPX2、pcDNA3.1-TPX2和各自對照序列或質(zhì)粒以及A549和PC-9細(xì)胞系，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書構(gòu)建各轉(zhuǎn)染組：siR-TPX2、siR-NC、miR-218-5p mimic、miR-NC、miR-218-5p+oe-TPX2、miR-NC+oe-TPX2、miR-NC+oe-NC。另外使用DMSO溶解p53抑制劑（PFT-α）按照說明書配比進行溶解，將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后添加PFT-α，在20 μmol/L的濃度下處理1 h。構(gòu)建正常表達(dá)TPX2的細(xì)胞（siR-NC+DMSO）、敲低TPX2的細(xì)胞（siR-TPX2+DMSO）及敲低T P X 2的同時抑制p5 3發(fā)揮作用的細(xì)胞（s i RTPX2+PFT-α）。

1.8 蛋白免疫印跡（Western blot） 采用添加了蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞樣品的總蛋白。采用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。將等量的蛋白使用10%的SDSPAGE分離，隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。使用5%脫脂牛奶封閉2 h，4oC條件下與兔抗TPX2（1:1000）、兔抗MDM2（1:1000）、兔抗p-p53（磷酸化S15，1:5000）、兔抗p53（1:1000）、兔抗Bax（1:2000）、兔抗GAPDH（1:10,000）進行孵育過夜。經(jīng)TBST清洗再與山羊抗兔IgG（1:2000）在室溫下孵育2 h。使用超敏化學(xué)發(fā)光液處理后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察。GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.9 總R N A 提取和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR） 使用Trizol提取組織和細(xì)胞的總RNA，在Nanodrop 2000分光光度計中檢測RNA濃度。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒合成對mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，使用miRNA 1stStrand cDNA Synthesis試劑盒對miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄。SYBR Premix Ex Taq用于qPCR檢測，miR-218-5p以U6為內(nèi)參，TPX2以GAPDH為內(nèi)參。qPCR使用的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence

1.10 細(xì)胞增殖實驗 將單細(xì)胞懸液接種在96孔板中（3000個/孔），補加培養(yǎng)液至100 μL，在37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、24、48、72、96 h后加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度。

1.11 克隆形成實驗 各處理組細(xì)胞分別接種于6孔板中（1000個/孔）。在37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。棄培養(yǎng)基并洗滌后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，棄固定液，加適量0.05%結(jié)晶紫染15 min，清洗后干燥；觀察克隆情況并拍照、計數(shù)。

1.12 劃痕愈合實驗 各處理組細(xì)胞分別接種于6孔板中（5×104個/孔），在37oC、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至約占90%。以直尺作輔助，使用200 μL的槍頭在每個孔的中間劃一條線。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。拍照記錄培養(yǎng)0和24 h后的劃痕寬度。

1.13 Transwell細(xì)胞侵襲實驗 將用無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室中（2×104個/孔）。在下室添加含10% FBS的培養(yǎng)基。于37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用棉棒除去未侵襲的細(xì)胞和基底膜基質(zhì)，使用結(jié)晶紫對膜下方的細(xì)胞進行染色，顯微鏡下拍照并記錄個數(shù)。

1.14 細(xì)胞凋亡及周期流式分析 （1）細(xì)胞凋亡：細(xì)胞用4oC的PBS洗滌后，在避光條件下，使用PI和FITC-Annexin V對細(xì)胞進行染色15 min。最后使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。（2）細(xì)胞周期：細(xì)胞中加入預(yù)冷的70%乙醇進行固定，于4oC放置3-4 h后去除乙醇，加入PI和RNA酶，37oC、避光孵育15 min，然后使用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞周期分析。

1.15 雙熒光素酶報告實驗 在兩個pmirGLO雙熒光載體中分別插入TPX2的3’UTR片段和突變的TPX23’UTR片段，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別為TPX2-WT和TPX2-MUT。TPX2-WT和TPX2-MUT各分為兩組，將miR-218-5pmimic和miR-NC分別轉(zhuǎn)染至TPX2-WT或TPX2-MUT的兩組細(xì)胞中。培養(yǎng)48 h后使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作參照。

1.16 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表達(dá)，兩組間比較使用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。采用GraphPad Prism 8.0.2使檢測數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1TPX2在LUAD中表達(dá)量分析 從TCGA中下載LUAD的mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)，通過差異分析后獲得2503個在Tumor組和Normal組之間存在表達(dá)差異的mRNA，見圖1A。生信分析TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD數(shù)據(jù)集顯示TPX2在LUAD組織中顯著高表達(dá)，見圖1B。qRT-PCR分析得LUAD組織中TPX2表達(dá)量顯著高于正常組織（P<0.001），見圖1C。免疫組化結(jié)果顯示，20例LUAD組織中TPX2蛋白水平均高于對應(yīng)的癌旁正常組織，見圖1D。qRT-PCR檢測得人LUAD細(xì)胞A549、H1975、PC-9、H1299中TPX2相對表達(dá)量顯著高于BEAS-2B細(xì)胞（P<0.05），見圖1E。Western blot結(jié)果見圖1F，可見LUAD細(xì)胞中TPX2蛋白水平高于BEAS-2B細(xì)胞。選擇相對表達(dá)較顯著的A549和PC-9細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

圖1 TPX2在LUAD中高表達(dá)。A：LUAD mRNA表達(dá)差異分析的火山圖；B：LUAD數(shù)據(jù)集中TPX2的差異表達(dá)情況；C：qRT-PCR檢測LUAD組織和癌旁組織臨床樣本中TPX2 mRNA的表達(dá)水平；D：免疫組化檢測LUAD組織和癌旁組織臨床樣本中TPX2蛋白表達(dá)的代表性結(jié)果（×200）；E：qRT-PCR檢測BEAS-2B、A549、H1975、PC-9、H1299細(xì)胞中TPX2 mRNA的表達(dá)水平；F：Western blot檢測TPX2在5種細(xì)胞系中的蛋白水平。*：與BEAS-2B組相比，P<0.05；***：與Normal組相比，P<0.001。Fig 1 TPX2 is highly expressed in LUAD. A: Volcano plot of differential analysis of mRNA expression in LUAD; B: Differential expression of TPX2 in the LUAD dataset; C: qRT-PCR to detect the expression level of TPX2 mRNA in clinical samples of LUAD tissues and paracancerous tissues; D:Representative results of immunohistochemical detection of TPX2 protein expression in clinical samples of LUAD and paracancer tissues (×200);E: qRT-PCR to detect the expression level of TPX2 mRNA in BEAS-2B, A549, H1975, PC-9 and H-1299 cells; F: Western blot to detect the protein level of TPX2 in the five cell lines. *: Compared with BEAS-2B group, P<0.05; ***: Compared with Normal group，P<0.001. TPX2: targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2; LUAD: lung adenocarcinoma.

2.2 siR-NC組與siR-TPX2組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力和凋亡率、細(xì)胞周期分布情況比較 qRT-PCR結(jié)果顯示siRTPX2-1組、siR-TPX2-2組的A549和PC-9細(xì)胞mRNA相對表達(dá)量均顯著低于siR-NC組（P<0.05），Western blot實驗結(jié)果顯示siR-TPX2-1組和siR-TPX2-2組的A549和PC-9細(xì)胞TPX2蛋白表達(dá)量顯著低于siR-NC組，見圖2A。選擇表達(dá)量差異最顯著的siR-TPX2-2進行后續(xù)的功能研究。CCK-8結(jié)果顯示siR-TPX2組A549和PC-9細(xì)胞活性顯著低于siRNC組（P<0.05），見圖2B。克隆形成、劃痕愈合、Transwell、細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果見圖2C-圖2F，與siR-NC組相比，siRTPX2組A549和PC-9細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力顯著降低，凋亡率顯著升高（P<0.05）。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，相比于siR-NC組，siR-TPX2組A549和PC-9細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞均顯著阻滯于G2/M期（P<0.05），見圖2G。

圖2 下調(diào)TPX2會抑制LUAD細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移并促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生。A：qRT-PCR和Western blot檢測A549細(xì)胞中TPX2的mRNA和蛋白表達(dá)水平的下調(diào)情況；B, C：CCK-8增殖試驗和克隆形成試驗檢測A549細(xì)胞增殖能力的變化；D：劃痕愈合試驗檢測A549細(xì)胞遷移能力的變化；E：Transwell試驗檢測A549細(xì)胞侵襲能力的變化；F：流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡率的變化；G：流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞周期分布的變化。*：與siR-NC組相比，P<0.05。Fig 2 Down-regulation of TPX2 can inhibit the proliferation and metastasis of LUAD cells and promote cell apoptosis. A: qRT-PCR and Western blot to examine the down-regulation of mRNA and protein expression levels of TPX2 in A549 cells; B, C: CCK-8 proliferation assay and clone formation assay to detect changes in the proliferation ability of A549 cells; D: Scratch healing assay to detect changes in the migration ability of A549 cells; E: Transwell assay to detect changes in the invasion ability of A549 cell invasion ability; F: Flow cytometry to detect changes in apoptosis rate of A549 cells; G: Flow cytometry to detect changes in cell cycle distribution of A549 cells. *: Compared with siR-NC group,P<0.05. OD: optical density; CCK-8: cell counting kit-8.

2.3TPX2和p53信號通路關(guān)系分析 為進一步挖掘TPX2發(fā)揮調(diào)控功能的下游效應(yīng)器，我們通過GSEA富集得到TPX2顯著參與p53等信號通路，見圖3A。Western blot檢測A549細(xì)胞p53信號通路相關(guān)蛋白p53、MDM2、磷酸化p53（p-p53, Ser15）和Bax，結(jié)果顯示沉默TPX2能有效地增加p53蛋白表達(dá)水平、p53 Ser15磷酸化水平、Bax蛋白以及MDM2的表達(dá)水平，但是這種作用效果會被PFT-α消除，而PFT-α不會影響TPX2的表達(dá)水平，見圖3B。CCK-8結(jié)果顯示，siR-TPX2+DMSO組的A549和PC-9細(xì)胞活力均顯著低于siR-NC+DMSO組（P<0.05），而siR-TPX2+PFT-α組則顯著高于siR-TPX2+DMSO組（P<0.05），見圖3C。劃痕愈合、Transwell、細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果見圖2D-圖2F，與siR-NC+DMSO組相比，siR-TPX2+DMSO組A549和PC-9細(xì)胞克隆、遷移、侵襲能力顯著降低，凋亡率顯著升高（P<0.05），而與siR-TPX2+DMSO組相比，siR-TPX2+PFT-α組細(xì)胞克隆、遷移、侵襲能力顯著提高，凋亡率顯著降低（P<0.05）。細(xì)胞周期分析顯示相比于siR-NC+DMSO組，siR-TPX2+DMSO組A549和PC-9細(xì)胞均顯著阻滯于G2/M期（P<0.05），而siR-TPX2+PFT-α組的G0/G1期細(xì)胞顯著增加（P<0.05）。

圖3 TPX2能夠調(diào)控p53信號通路。A：對TPX2進行GSEA富集的結(jié)果；B：Western blot檢測A549細(xì)胞中TPX2蛋白和p53信號通路相關(guān)蛋白Bax、MDM2、p53和p-p53的表達(dá)水平；C：CCK-8檢測A549和PC-9細(xì)胞增殖能力的變化；D：劃痕愈合試驗檢測A549和PC-9細(xì)胞遷移能力的變化；E：Transwell試驗檢測A549和PC-9細(xì)胞侵襲能力的變化；F：流式細(xì)胞術(shù)檢測A549和PC-9細(xì)胞侵襲能力的變化；G：流式細(xì)胞術(shù)檢測A549和PC-9細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。*：與siRNC+DMSO組相比，P<0.05；#：與siR-TPX2+DMSO組相比，P<0.05。Fig 3 TPX2 can regulate p53 signaling pathway. A: Results of GSEA enrichment for TPX2; B: Western blot to detect the expression levels of TPX2 and p53 signalling pathway-related proteins Bax, MDM2, p53 and p-p53 in A549 cells; C: CCK-8 assay to detect changes in the proliferative capacity of A549 and PC-9 cells; D: Scratch healing assay to detect changes in migration ability of A549 and PC-9; E: Transwell assay to detect changes in invasion ability of A549 and PC-9 cells; F: Flow cytometry to detect changes in apoptosis rate of A549 and PC-9 cells; G: Flow cytometry to detect the distribution of cell cycle of A549 and PC-9 cells. *: Compared with siR-NC+DMSO group, P<0.05; #: Compared with siR-TPX2+DMSO group, P<0.05. GSEA: gene set enrichment analysis.

2.4 在LUAD中TPX2的表達(dá)量與miR-218-5p表達(dá)量相關(guān)性 為發(fā)現(xiàn)TPX2的上游調(diào)控因子，本研究從TCGA中得到LUAD的miRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)，通過差異分析后獲得299個存在表達(dá)差異的miRNA，見圖4A。將該組差異表達(dá)中下調(diào)的miRNA和利用starBase、mirDIP數(shù)據(jù)庫對TPX2進行上游調(diào)控基因預(yù)測得到的miRNA進行對照，取三者的交集發(fā)現(xiàn)4個與TPX2有靶向結(jié)合位點的差異miRNA，見圖4B。對TPX2和4個差異miRNA作Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-218-5p是其中與TPX2負(fù)相關(guān)程度最高的，見圖4C、圖4D。對LUAD的數(shù)據(jù)集進行差異分析發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在LUAD組織中顯著低表達(dá)，見圖4E。通過對5個細(xì)胞系進行qRTPCR的檢測，我們進一步發(fā)現(xiàn)在LUAD細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），見圖4F。

圖4 miR-218-5p在LUAD中低表達(dá)且與TPX2呈負(fù)相關(guān)。A：LUAD中miRNA表達(dá)差異分析的火山圖；B：starBase、mirDIP數(shù)據(jù)庫預(yù)測的TPX2上游調(diào)控基因和下調(diào)miRNA集之間的交集；C：TPX2與交集中miRNAs的Pearson相關(guān)性分析；D：miR-218-5p和TPX2的Pearson相關(guān)性分析；E：miR-218-5p在LUAD數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)情況；F：qRT-PCR檢測miR-218-5p在BEAS-2B、A549、H1975、PC-9、H1299細(xì)胞中的表達(dá)水平。*：與BEAS-2B組相比，P<0.05。Fig 4 miR-218-5p was underexpressed in LUAD and negatively correlated with TPX2. A: Volcano plot of differential analysis of miRNA expression in LUAD; B: StarBase, mirDIP database prediction of TPX2 upstream regulated genes and intersection between down-regulated miRNA sets; C:Pearson correlation analysis between TPX2 and miRNAs in the intersection set; D: Pearson correlation between miR-218-5p and TPX2 analysis; E:Differential expression of miR-218-5p in the LUAD dataset; F: qRT-PCR to detect the expression level of miR-218-5p in BEAS-2B, A549, H1975, PC-9 and H1299 cells. *: Compared with the BEAS-2B group, P<0.05.

2.5TPX2與miR-218-5p的靶向關(guān)系 qRT-PCR檢測顯示miR-218-5p mimic組細(xì)胞miR-218-5p的表達(dá)水平顯著高于miR-NC組（P<0.05），見圖5A。通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到TPX2和miR-218-5p具有靶向結(jié)合位點，見圖5B。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示miR-218-5p mimic組細(xì)胞中野生型TPX2報告基因的熒光活性顯著低于miR-NC組（P<0.05）；突變型TPX2報告基因的熒光活性與miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖5C。qRT-PCR檢測得miR-218-5p mimic組細(xì)胞TPX2表達(dá)水平顯著低于miR-NC組（P<0.05）。Western blot檢測得miR-218-5p mimic組細(xì)胞TPX2蛋白表達(dá)水平顯著低于miR-NC組（P<0.05），見圖5D。

圖5 miR-218-5p通過靶向結(jié)合TPX2的3’UTR調(diào)控TPX2的表達(dá)水平。A：qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染了miR-NC和miR-218-5p mimic的A549細(xì)胞中miR-218-5p的表達(dá)水平；B：預(yù)測miR-218-5p與TPX2的結(jié)合位點，并改變位點序列以獲得TPX2-MUT；C：雙熒光素酶報告實驗檢測miR-218-5p與TPX2的結(jié)合關(guān)系；D：qRT-PCR和Western blot檢測TPX2表達(dá)的變化。*：與miR-NC組相比，P<0.05。Fig 5 miR-218-5p regulates the expression level of TPX2 by targeting the 3‘UTR that binds to TPX2. A: qRT-PCR to detect the expression level of miR-218-5p in A549 cells transfected with miR-NC and miR-218-5p mimic; B: Predicted binding sites of miR-218-5p targeting to TPX2 and alteration of the site sequence were designed to obtain TPX2-MUT; C: Dual-luciferase reporter assay to detect the binding relationship between miR-218-5p and TPX2; D: qRT-PCR and Western blot to detect the changes of TPX2 expression level in A549 cells transfected with miR-NC and miR-218-5p mimic. *: Compared with miR-NC group, P<0.05.

2.6 miR-NC+oe-NC組、miR-NC+oe-TPX2組、miR-218-5p+oe-TPX2組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力和凋亡率、細(xì)胞周期分布情況比較 qRT-PCR和Western blot檢測miRNC+oe-NC組、miR-NC+oe-TPX2組、miR-218-5p+oe-TPX2組A549和PC-9細(xì)胞TPX2表達(dá)量，miR-NC+oe-TPX2組的TPX2表達(dá)量顯著高于siR-NC組，而miR-218-5p+oe-TPX2組TPX2表達(dá)量顯著低于miR-NC+oe-TPX2組（P<0.05），見圖6A。CCK-8結(jié)果顯示miR-NC+oe-TPX2組A549和PC-9細(xì)胞活力顯著高于miR-NC+oe-NC組，miR-218-5p+oe-TPX2組細(xì)胞活力顯著低于miR-NC+oe-TPX2組（P<0.05），見圖6B。劃痕愈合、Transwell、細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果見圖6C-圖6E。與miR-NC+oe-NC組相比，miR-NC+oe-TPX2組A549和PC-9細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著增強，凋亡率顯著降低，而與miR-NC+oe-TPX2組相比，miR-218-5p+oe-TPX2組細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著降低，凋亡率顯著增高（P<0.05）。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示相比于miR-NC+oe-NC組，miRNC+oe-TPX2組A549和PC-9細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞，而相比于miR-NC+oe-TPX2組，miR-218-5p+oe-TPX2組G0/G1期細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞顯著阻滯于G2/M期（P<0.05），見圖6F。Western blot檢測p53信號通路相關(guān)的蛋白p53、磷酸化p53（Ser15）、MDM2和Bax的表達(dá)，見圖6G，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-218-5p能夠消除過表達(dá)TPX2導(dǎo)致的Bax、MDM2、p53的表達(dá)水平和磷酸化p53（Ser15）水平的下調(diào)。

圖6 miR-218-5p靶向TPX2從而通過p53信號通路調(diào)控LUAD細(xì)胞的惡性表型。A：qRT-PCR和Western blot檢測TPX2在A549和PC-9細(xì)胞中的表達(dá)水平；B：CCK-8檢測A549和PC-9細(xì)胞增殖能力的變化；C：劃痕愈合試驗檢測A549和PC-9細(xì)胞遷移能力的變化；D：Tanswell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力的變化；E：流式細(xì)胞術(shù)檢測A549和PC-9細(xì)胞的凋亡率；F：流式細(xì)胞術(shù)檢測A549和PC-9細(xì)胞凋亡率的變化；G：Western blot檢測A549細(xì)胞中p53、磷酸化p53（Ser15）、MDM2和Bax的表達(dá)變化。*：與miR-NC+oe-NC組相比，P<0.05；#：與miR-NC+oe-TPX2組相比，P<0.05。Fig 6 miR-218-5p targets TPX2 to regulate the malignant phenotype of LUAD cells through the p53 signaling pathway. A: qRT-PCR and Western blot to detect the expression level of TPX2 in A549 and PC-9 cells; B: CCK-8 to detect the changes in proliferation ability of A549 and PC-9 cells; C: Scratch healing assay to detect the changes in migration ability of A549 and PC-9 cells; D: Tanswell invasion assay to detect the changes in invasion ability changes; E: Flow cytometry to detect the apoptosis ratio of A549 and PC-9 cells; F: Flow cytometry to detect the changes in cell cycle distribution of A549 and PC-9 cells; G:Western blot to detect the changes in the expression of p53, phosphorylated p53 (Ser15), MDM2 and Bax in A549 cells. *: Compared with miR-NC+oe-NC group, P<0.05; #: Compared with miR-NC+oe-TPX2 group, P<0.05.

3 討論

全球死亡率最高的肺癌中LUAD有很大占比[1,2]。本研究通過生物信息學(xué)對LUAD差異基因的分析發(fā)現(xiàn)，TPX2基因在LUAD組織中高表達(dá)。已有的研究[14]表明TPX2在多種癌癥（膀胱尿路上皮癌、肝細(xì)胞癌、LUAD、胃腺癌）中高表達(dá)，可作為癌癥的預(yù)后分子生物標(biāo)志物和治療這些疾病的潛在治療靶點。本研究中的實驗結(jié)果也表明TPX2在LUAD中高表達(dá)，對LUAD的惡性進展起促進作用。對TPX2進行通路富集分析后發(fā)現(xiàn)其顯著參與p53信號通路。大量的研究表明p53行使抑癌作用。p53信號通路主要包含p53和MDM2。MDM2為p53的E3泛素連接酶，通過將p53泛素化使其降解，而p53作為一個激活MDM2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在降解后形成一個負(fù)反饋，二者因此達(dá)成平衡。而在細(xì)胞存在壓力時，二者平衡被打破，p53表達(dá)量上調(diào)，引發(fā)凋亡、細(xì)胞周期分布改變等活動[15]。劉等[13]研究表明沉默TPX2能促進LUADA549細(xì)胞的凋亡，其作用可能與上調(diào)p53表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果同樣顯示TPX2具有促癌的作用，與p53信號通路的功能相左，因此后續(xù)通過PFT-α抑制p53信號通路，并敲低TPX2進行回復(fù)實驗，驗證了TPX2可通過抑制p53信號通路，從而促進LUAD細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并抑制凋亡。

本研究中我們的實驗結(jié)果表明TPX2可以抑制p53信號通路，并且敲低TPX2能夠增加磷酸化p53（Ser15）的蛋白水平，結(jié)合過去關(guān)于結(jié)腸癌的研究[16]顯示p53的Ser15磷酸化能夠增加p53的穩(wěn)定性，防止其p53被MDM2降解，蛋白印記法檢測p53信號通路相關(guān)蛋白的結(jié)果顯示TPX2和p53信號通路之間具體的調(diào)控機制可能是通過改變p53磷酸化情況從而改變p53的穩(wěn)定性，進而影響p53信號通路及下游的基因表達(dá)。此外，TPX2、MDM2和p53三者被發(fā)現(xiàn)存在直接的相互作用[17]，與本研究中敲低TPX2能夠提高p53和MDM2表達(dá)量的結(jié)果相照應(yīng)，TPX2、MDM2和p53復(fù)合體的形成也可能是TPX2與p53信號通路的互作方式。以上研究結(jié)果提示TPX2可能通過多條路徑與p53信號通路產(chǎn)生互作。

隨著對miRNA的研究逐漸增加，眾多科研團隊發(fā)現(xiàn)其在癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)TPX2的上游調(diào)控miRANmiR-218-5p，并通過雙熒光素報告實驗證明二者存在結(jié)合關(guān)系。在以往的研究[19]中，miR-218-5p被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中具有調(diào)控作用，例如，在宮頸癌的研究[20]中，miR-218-5p通過LYN/核因子-κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）抑制癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，miR-218-5p通過靶向結(jié)合CX43 mRNA抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移，并減弱細(xì)胞的吉西他濱抗藥性。值得注意的是，Chen等[21]研究表明，miR-218-5p在LUAD中低表達(dá)且能夠和mRNA ERO1A結(jié)合發(fā)揮抑癌的作用。這些研究說明miR-218-5p能夠結(jié)合多個靶基因?qū)Π┘?xì)胞的多個惡性表型進行調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)miR-218-5p能夠通過靶向結(jié)合TPX2下調(diào)TPX2的表達(dá)水平，抑制LUAD的增殖、遷移、侵襲，并促進凋亡和G2/M期阻滯的發(fā)生。

綜上，本研究揭示了miR-218-5p/PX2/p53信號通路的互作軸，并且發(fā)現(xiàn)其在LUAD中參與惡性進程的調(diào)控，串聯(lián)TPX2發(fā)揮調(diào)控作用的信號通路，該調(diào)控機制可能為LUAD提供診斷和預(yù)后標(biāo)志物，幫助挖掘潛在的癌癥發(fā)展相關(guān)因子，并為LUAD提供可能的治療方案，如恢復(fù)miR-218-5p的表達(dá)、抑制TPX2的表達(dá)以及修復(fù)p53的正常功能。本研究結(jié)論有待在動物實驗中進行進一步驗證。

Competing interests

The author declare no competing interests.

Author contributions

Xu JG conceived and designed the study, performed the experiments, analyzed the data and accomplished the paper.All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.