類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清外泌體長鏈非編碼RNA Hotair和XIST的表達(dá)及意義*

于娟,孫寧,宋淑圣,張力,張健,李曉軍(.南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京 00;.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,南京 000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性全身性系統(tǒng)性自身免疫病,典型的病理特征是滑膜炎和血管炎,主要臨床表現(xiàn)是遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)對稱性畸形和功能喪失。全世界約1%的人口受RA影響,歐洲人和亞洲人的患病率較高,確切致病機(jī)制仍未完全闡明,遺傳和環(huán)境因素具有重要作用,炎癥反應(yīng)和免疫紊亂是關(guān)鍵因素[1-2]。

目前,RA診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查,實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)志物主要包括紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein,CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP)。外泌體(exosome)直徑30～200 nm,屬于細(xì)胞外囊泡的一種,所有類型細(xì)胞均可分泌,存在于人體各種體液中,包括血清、唾液、腦脊液和尿液等。外泌體由磷脂雙分子層包裹,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,可抵抗外環(huán)境各種酶的消化,內(nèi)含大量生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂類和核酸,可近距離或遠(yuǎn)距離在相同或不同類型細(xì)胞間互相傳遞生物活性物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞間通訊[3-4]。外泌體受到廣泛關(guān)注,其所含微小核糖核酸(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明,外泌體中的miRNA可能作為RA診斷的潛在標(biāo)志物,如miR-1915-3P、miR-187-5p等[4-6]。LncRNA是一種新發(fā)現(xiàn)的長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,在不同細(xì)胞、組織、體液以及不同疾病中均具有各自特異性表達(dá)譜,主要通過影響免疫細(xì)胞的功能,發(fā)揮抑炎和促炎的雙重作用[7-8]。目前外泌體中的lncRNA在RA診斷的研究報(bào)道較少。本課題組采用基因芯片技術(shù)對RA患者血清和滑膜細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA差異表達(dá)及生物信息學(xué)分析,篩選出4種差異表達(dá)的lncRNAHotair、XIST、H19和MALAT1[9-11]。本研究將探討血清外泌體攜帶的4種lncRNA可否作為RA診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1研究對象 選擇2017年1月至2018年12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院門診治療的70例RA患者,年齡31～62歲,平均年齡48.6歲,男性29例,女性41例;40例SLE患者,年齡23～65歲,平均年齡45.6歲,男性16例,女性24例。納入標(biāo)準(zhǔn):RA患者均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(EULAR)提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12],SLE患者符合ACR 2009年修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)[13]。排除標(biāo)準(zhǔn):患有傳染性疾病如結(jié)核、艾滋病等;患有惡性腫瘤及其他自身免疫病;患有血液系統(tǒng)疾病;近期使用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑藥物治療者。選擇同期40例健康體檢者作為健康對照組,30～64歲,平均年齡47.4歲,男性16例,女24例。3組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:2016NZGKJ-049)。

1.2主要儀器與試劑 7500型實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司),IMMAGE 800比濁分析儀(美國Beckman-Coulter公司),i2000型化學(xué)發(fā)光儀(美國Abbott公司),分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)。ExoQuick血清外泌體提取試劑盒(美國System Biosciences公司),DP315-R型RNA提取試劑盒(北京天根生物公司),SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海TaKaRa公司),引物由南京銳真生物公司合成,CRP、RF檢測試劑盒(美國Beckman-Coulter公司),anti-CCP檢測試劑盒(美國Abbott公司)。

1.3標(biāo)本采集與處理 用含促凝劑的真空采血管采集患者空腹靜脈血5 mL,室溫靜置30 min,3 000 r/min離心10 min。收集血清至無酶EP管中,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,去除細(xì)胞及碎片后-80 ℃冰箱保存,用于后續(xù)外泌體提取。

1.4方法

1.4.1血清外泌體分離 將收集到的血清樣品從-80 ℃冰箱取出復(fù)溫20～30 min,4 ℃、3 000 r/min離心15 min,去除細(xì)胞碎片及雜質(zhì)。每個樣本吸出250 μL血清至新的EP管中,加入63 μL ExoQuick溶液震蕩混勻15 s?；旌衔? ℃溫育30 min,4 ℃、12 000 r/min離心30 min,棄上清液,加入100 μL PBS至含有外泌體的沉淀物中,充分?jǐn)嚢璐荡蚧靹?用于下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.4.2透射電子顯微鏡(TEM) 取按照1.4.1提取的外泌體溶液20 μL與20 μL PBS混勻,取20 μL滴在一干凈的200目載樣銅網(wǎng)上室溫2 min晾干,再滴20 μL 2%磷鎢酸溶液復(fù)染1 min,用干凈的濾紙輕輕吸去多余的液體晾干2 min。在南京大學(xué)公共實(shí)驗(yàn)平臺使用JEM-200CX透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)拍攝外泌體圖片。

1.4.3納米粒徑追蹤儀檢測血清外泌體濃度 500 μL血清樣本按照1.4.1的方法預(yù)處理,吸取126 μL ExoQuick溶液用于提取外泌體,沉淀物懸浮于125 μL PBS中備用。Zeta View納米顆粒跟蹤分析儀(德國Particle Metrix公司)用于檢測外泌體的粒徑和濃度分析。

1.4.4RNA提取與實(shí)時定量PCR(RT-qPCR) 采用1.4.1方法提取血清外泌體,使用RNA提取試劑盒提取總RNA,操作過程參照試劑盒說明書,提取的總RNA溶解在60 μL DEPC水中,純度和濃度使用分光光度計(jì)進(jìn)行測量。提取的總RNA經(jīng)過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)體系為10 μL:2 μL 5×Prime Script Buffer,4 μL RNA模板,4 μL DEPC水;反應(yīng)條件為:37 ℃ 5 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min。GAPDH為內(nèi)參基因,RT-qPCR測定lncRNAHotair、XIST、H19、MALAT1的表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL:2 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ,上、下游引物(濃度為10 μmol/L)各1 μL,12 μL DEPC水, 4 μL cDNA模板;反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,循環(huán)40次?；虮磉_(dá)的差異是通過2-ΔΔCt計(jì)算,其中ΔCt實(shí)驗(yàn)組=Ct(目的lncRNA)-Ct(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-平均ΔCt健康對照組。引物序列如下表1。

表1 擴(kuò)增GAPDH、Hotair、XIST、H19及MALAT1所用引物序列

2 結(jié)果

2.1血清外泌體形態(tài)檢測和納米粒徑分析 HC組、RA組和SLE組血清分離得到的外泌體分別經(jīng)TEM成像顯示,外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,大小不一,為雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的橢圓形或類似圓形的納米顆粒,直徑約30～200 nm(圖1)。納米粒徑分析儀可以直觀看到做布朗運(yùn)動的納米顆粒,結(jié)果顯示HC組平均粒徑為124.92 nm,RA組平均粒徑126.78 nm,SLE組平均粒徑125.7 nm,3組樣本的粒徑檢測粒徑范圍均在30～200 nm。

圖1 外泌體TEM結(jié)果

2.2血清外泌體濃度檢測 分別隨機(jī)選擇HC組、RA組和SLE組各15例患者,3組年齡和性別分布無顯著差異(P<0.05)。每個患者血清樣本取1 mL,每組分別5個樣本進(jìn)行混合,然后從混合血清中分離外泌體,使用納米粒徑追蹤分析儀分別進(jìn)行濃度檢測。HC組患者外泌體濃度為(3.40±0.28)×1012/mL,RA組患者外泌體濃度為(6.50±0.79)×1012/mL,SLE組患者外泌體濃度為(5.30±0.90)×1012/mL,結(jié)果顯示,RA組患者血清外泌體濃度水平顯著高于HC組(t=5.24,P<0.05),SLE組患者血清外泌體濃度水平顯著高于HC組(t=2.85,P<0.05),RA組與SLE患者之間血清外泌體濃度水平無顯著差異(t=1.42,P>0.05)。

2.3Hotair和XIST在RA患者中高表達(dá) 采用RT-qPCR方法檢測3組患者血清外泌體中l(wèi)ncRNAH19、MALAT1、Hotair和Xist的表達(dá)水平,lncRNAH19和MALAT1在3組中表達(dá)量低,且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LncRNAHotair和XIST表達(dá)水平在RA組中顯著高于SLE和HC組(P<0.001),見表2。

表2 血清外泌體中l(wèi)ncRNA H19、MALAT1、Hotair和Xist的相對表達(dá)水平

2.4ROC曲線分析Hotair和XIST在RA患者中的診斷價值 以HC組和SLE組作為對照組,評價2種lncRNAs對RA的診斷價值。如圖2所示,Hotair的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.84(95%CI=0.78～0.90,P<0.001),cut-off值為1.31時,敏感性為91.43%,特異性為61.25%,陽性預(yù)測值為68.82%,陰性預(yù)測值為89.47%;XIST的AUCROC為0.76(95%CI=0.68～0.83,P<0.001),cut-off值為1.65時,敏感性為65.71%,特異性為75%,陽性預(yù)測值為70.59%,陰性預(yù)測值為73.17%。

圖2 ROC曲線分析血清外泌體來源LncRNA Hotair、XIST在RA中的診斷價值

2.5Hotair和XIST的表達(dá)水平與RA患者anti-CCP、RF、ESR、CRP和DAS-28評分的關(guān)系Hotair和Xist的表達(dá)水平與ESR呈正相關(guān),r值分別為0.646和0.640;與CRP呈正相關(guān),r值分別為0.780和0.747;與DAS-28評分呈顯著正相關(guān),r值分別為0.516和0.544。然而,2種lncRNA均與抗CCP或RF無顯著相關(guān)或弱相關(guān)關(guān)系。見表3。ESR、CRP水平和DAS-28評分是疾病活動的指標(biāo),因此,LncRNAHotair和Xist可能作為RA患者疾病活動的重要分子標(biāo)志物。

表3 RA患者血清外泌體Hotair、XIST表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)及DAS-28評分的相關(guān)性分析

3 討論

人類基因組中,非編碼RNA約占據(jù)細(xì)胞總RNA的99%,lncRNA作為一種非編碼RNA,在自身免疫病中參與炎癥、異常增殖、遷移、侵襲和凋亡的過程,促進(jìn)炎癥因子釋放,加重或減輕疾病的嚴(yán)重程度[8,15]。外泌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,其所含lncRNA在多種疾病中得到鑒定,可作為預(yù)測癌癥、心血管疾病和自身免疫病等發(fā)生和發(fā)展的生物標(biāo)志物[15-17]。

SLE和RA是常見的多系統(tǒng)自身免疫病,臨床表現(xiàn)、血清學(xué)特征、免疫學(xué)特征和轉(zhuǎn)錄組常具有一些相似性導(dǎo)致鑒別診斷存在困難[18],因此本研究選用SLE為疾病對照組。首先通過透射電鏡對提取的外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,可見圓形或類圓形微小囊泡,粒徑在100 nm左右,與已有報(bào)道相符[3-4]。納米粒徑分析儀進(jìn)行血清外泌體濃度分析,結(jié)果顯示RA和SLE組濃度水平顯著高于HC組(P<0.05),但RA與SLE兩組無顯著差異(P>0.05)。Shu等[19]對膽管癌、胰腺癌、普通膽管結(jié)石患者膽汁和血清中外泌體濃度進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)不同疾病之間膽汁外泌體濃度無顯著差異,胰腺癌、普通膽管結(jié)石患者血清外泌體濃度無顯著差異。因此推測外泌體濃度檢測可作為疾病狀態(tài)的判斷,不能單獨(dú)用于RA的特異性診斷。

用RT-qPCR方法分析lncRNAHotair、XIST、H19和MALAT1在3組研究對象血清外泌體中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示H19和MALAT1均低表達(dá)且3組間無顯著差異(P>0.05),Hotair和XIST在RA組顯著高表達(dá)(P<0.001)。Song等[20]已證實(shí)Hotair可以激活成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和破骨細(xì)胞中的MMP-2和MMP-13,并促進(jìn)骨、軟骨基質(zhì)溶解和關(guān)節(jié)破壞。Bost等[21]證實(shí)XIST在RA患者成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和破骨細(xì)胞中過表達(dá),促進(jìn)炎癥和增殖信號通路因子表達(dá)上調(diào)。因此推測RA患者外周血清外泌體中Hoair和XIST的表達(dá)增高可能與RA患者發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

進(jìn)一步使用ROC曲線評價血清外泌體lncRNAHotair和XIST對RA的診斷價值,AUCROC分別為0.84和0.76,均具有較高的敏感性和特異性,并且兩者均與ESR、CRP和DAS-28呈正相關(guān)關(guān)系,提示2種LncRNA與RA疾病活動度存在正相關(guān)性。但本研究中缺少RA患者治療前后血清外泌體Hotair和XIST表達(dá)差異分析,無法確定藥物治療是否產(chǎn)生影響,下一步將進(jìn)一步明確用藥前后2種血清外泌體lncRNA表達(dá)量的相互關(guān)系,從而提升診斷和預(yù)后價值。