電針對(duì)正常小鼠血清單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

裴麗娟,馮晨晨,姚超,葉子,張衙楠,孫栩秋,王珂,周嘉

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;2.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203)

針刺治療疾病具有整體調(diào)節(jié)作用,并具有雙向的特性[1]。針刺效應(yīng)的產(chǎn)生被認(rèn)為與“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡(luò)途徑密切相關(guān),具有多環(huán)節(jié)、多靶向的特征[2]。其中,針刺效應(yīng)的產(chǎn)生與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān),針刺通過(guò)刺激機(jī)體穴位引起神經(jīng)傳入纖維的沖動(dòng),針刺信號(hào)從外周上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)后進(jìn)行逐級(jí)整合和持續(xù)傳遞[3],反饋下行調(diào)節(jié)機(jī)制,同時(shí)促發(fā)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng),協(xié)同發(fā)揮整體調(diào)控效應(yīng)。在這個(gè)過(guò)程中針刺可引起不同層級(jí)神經(jīng)遞質(zhì)活性和水平的變化[4]。由此可見(jiàn),神經(jīng)系統(tǒng)是促發(fā)針刺效應(yīng)產(chǎn)生的必要條件和始動(dòng)因素[5]。

神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與效應(yīng)器細(xì)胞之間傳遞信息的化學(xué)物質(zhì),也是針刺效應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)既參與腧穴局部針刺信號(hào)的啟動(dòng)以及針刺信息在中樞神經(jīng)系統(tǒng)各個(gè)層級(jí)的傳導(dǎo)和信息整合,又參與針刺對(duì)機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)器官活動(dòng)的調(diào)節(jié)[6]。針刺是中醫(yī)學(xué)治未病的重要手段之一,能發(fā)揮未病先防和已病防變的作用,如《素問(wèn)·刺熱》:“肝熱病者,左頰先赤……病雖未發(fā),見(jiàn)赤色者刺之,名曰治未病?！弊闳锸轻樉呐R床防病治病和保健強(qiáng)身的要穴。足三里是足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴,“四總穴”之一,也是《針灸聚英》中“回陽(yáng)九針”的穴位之一?！豆欧ㄐ陆鈺?huì)元針灸學(xué)》評(píng)價(jià)足三里為“此穴治病萬(wàn)端,有白術(shù)之強(qiáng),有桂附之熱,有參茸之功,有硝黃之力”。更有《千金要方》有“若要安,三里常不干”的論述?，F(xiàn)代研究[7-8]表明,針灸刺激足三里可對(duì)機(jī)體“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生影響,“足三里”在機(jī)體不同狀態(tài)下發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)效應(yīng),從而對(duì)機(jī)體的生理病理發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究[9-11]表明,單次電針足三里能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)各級(jí)中樞發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在中樞和外周均發(fā)揮廣泛的生理學(xué)效應(yīng),也是針刺效應(yīng)的介導(dǎo)者和發(fā)揮效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此,本文通過(guò)研究正常小鼠接受電針足三里處理后不同時(shí)間節(jié)段血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化,探索電針對(duì)正常機(jī)體外周神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)效應(yīng)規(guī)律,以期部分解析針刺治未病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF 級(jí)健康雄性C57BL/6J 小鼠30 只,5 周齡,體質(zhì)量20～22 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,合格證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為室溫20～25 ℃,相對(duì)濕度50%～65%,每日12 h 光照。實(shí)驗(yàn)小鼠自由飲水、普通飼料喂養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分為對(duì)照組和電針組,每組15 只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)待動(dòng)物遵照國(guó)家科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 主要試劑與儀器

所有化學(xué)物質(zhì)均為HPLC 級(jí),采用超純水系統(tǒng)生產(chǎn)超純水(Milli-Pore,美國(guó))。標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸去甲腎上腺素(norepinephrine hydrochloride,NE)、鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride,DA)、3,4 二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylaceticacid,DOPAC)、鹽酸5-羥 色 胺(5-hydroxytryptamine hydrochloride,5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)均購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。安捷倫1200 系列神經(jīng)遞質(zhì)分析儀(南京利爾實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司),高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分工司),低溫冰箱(日本SANYO 公司),電化學(xué)探測(cè)器(Antec SDC ECD,荷蘭),LH 200 型韓氏電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司),中研太和不銹鋼針灸針(0.16 mm×7 mm,天津億朋醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 電針

用特制的棉布束縛裝置對(duì)小鼠進(jìn)行束縛,留小鼠雙下肢在布套外,在束縛的基礎(chǔ)上選用0.16 mm×7 mm不銹鋼針灸針,75%乙醇常規(guī)消毒后直刺雙側(cè)足三里。取穴方法參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12],通過(guò)體表解剖標(biāo)志的確定以及骨度分寸法進(jìn)行取穴,取雙側(cè)足三里穴,足三里定位為膝關(guān)節(jié)腓骨小頭向后0.5 cm,在脛骨和腓骨之間,針刺深度7 mm。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行電針“神經(jīng)-免疫”調(diào)控相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)候,摸索過(guò)不同頻率、強(qiáng)度和刺激時(shí)間,發(fā)現(xiàn)電針頻率10 Hz,強(qiáng)度2 mA,留針時(shí)間30 min對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)和免疫均有較好的調(diào)節(jié)效應(yīng),因此采用上述電針參數(shù)。針刺刺入足三里后,接通電針儀,調(diào)節(jié)電針參數(shù)。對(duì)照組僅用特制的棉布束縛裝置束縛30 min,不予電針。

1.4 取材

實(shí)驗(yàn)前3 d,對(duì)小鼠進(jìn)行環(huán)境和人為操作適應(yīng)性習(xí)慣訓(xùn)練。采血時(shí)間點(diǎn)分別為電針干預(yù)前1 d 及電針干預(yù)后1 h、2 h、4 h、8 h、24 h,眼眶取血。每只小鼠取150～200 μL 血液,室溫靜置1 h,3 000 r/min離心15 min,將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的0.5 mL EP管,再次3 000 r/min 離心15 min;從每個(gè)EP 管中各吸取上清液40 μL。每組小鼠每3 只小鼠血清混為一個(gè)樣本?；鞓雍蟮难?120 μL/管)加入8.6 μL 的高氯酸,室溫靜置5 min,3 000 r/min 離心15 min,用移液槍吸出上清(大約為60 μL/管血清),置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

將所有試劑標(biāo)準(zhǔn)品分別用0.1 mol/L 的高氯酸配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,貯存于4 ℃冰箱內(nèi)。分析時(shí)用0.1 mol/L 的高氯酸稀釋到所需濃度。采用高效液相色譜法測(cè)定NE、DA、DOPAC、5-HIAA以及5-HT 等神經(jīng)遞質(zhì)在血清中的含量。流動(dòng)相為水:甲醇為90:10(含0.74 mmol/L 辛烷磺酸鈉、80 mmol/L二水合磷酸二氫鈉、0.027 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和2 mmol/L 氯化鉀),磷酸調(diào)pH＝3.0,將樣品的上清液注入到C18 柱(2.2 μm,2.1×100 mm;賽默飛世爾科技)中,溫度為38 ℃。用流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液磷酸氫二鈉 90 mmol/L,檸檬酸 50 mmol/L,原硅酸1.7 mmol/L,EDTA 0.05 μmo/L,以0.2 mL/min 的流量進(jìn)行分離,檢測(cè)單元設(shè)置為700 mV,防護(hù)單元設(shè)置為750 mV,通過(guò)化學(xué)站(安捷倫科技)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析。通過(guò)與已知外部標(biāo)準(zhǔn)的比較,確定峰和相對(duì)濃度。NE、DA、DOPAC、5-HIAA 以及5-HT 各分子的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 NE、DA、DOPAC、5-HIAA 以及5-HT 的高效液相色譜圖

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS22.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析,若方差齊,則采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較;若方差不齊,則采用Tamhane’s T2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清NE 含量比較

兩組干預(yù)前小鼠血清NE 含量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組干預(yù)后1 h、2 h、4 h 和8 h血清NE 含量較干預(yù)前降低(P＜0.05,P＜0.01);電針組干預(yù)后24 h 血清NE 含量顯著低于對(duì)照組和干預(yù)前(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 兩組血清NE 含量比較(±s,n＝5)

2.2 兩組血清DA、DOPAC 含量及DOPAC/DA 比值比較

兩組干預(yù)前血清DA、DOPAC 含量及DOPAC/DA 比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組干預(yù)后血清DA 含量和DOPAC/DA 比值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低(P＜0.05,P＜0.01),對(duì)照組干預(yù)后2 h 血清DOPAC 含量較干預(yù)前降低(P＜0.05),電針組干預(yù)后4 h 和8 h 血清DOPAC含量較干預(yù)前升高(P＜0.01);電針組干預(yù)后2 h、4 h、8 h 和24 h 血清DA 含量高于對(duì)照組(P＜0.05,P＜0.01),DOPAC/DA 比值低于對(duì)照組(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 兩組血清DA、DOPAC 含量及DOPAC/DA 比值比較(±s,n＝5)

2.3 兩組血清5-HT、5-HIAA 含量及5-HIAA/5-HT 比值比較

兩組干預(yù)前血清5-HT、5-HIAA 含量以及5-HIAA/5-HT 比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)血清5-HT 含量均降低(P＜0.01),電針組干預(yù)后2 h 和4 h 血清5-HT 含量低于對(duì)照組(P＜0.05);兩組血清5-HIAA 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對(duì)照組干預(yù)后8 h 和24 h 血清5-HIAA/5-HT 比值較干預(yù)前降低(P＜0.05),電針組干預(yù)后1 h、4 h 和24 h 血清5-HIAA/5-HT 比值較干預(yù)前升高(P＜0.01),電針組干預(yù)后1 h、4 h、8 h 和24 h 血清5-HIAA/5-HT 比值高于對(duì)照組(P＜0.01,P＜0.05)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 兩組血清5-HT、5-HIAA 含量及5-HIAA/5-HT 比值比較(±s,n＝5)

3 討論

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類由兩個(gè)碳鏈將氨基和芳香環(huán)鏈接在一起為特征的神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中參與了情緒、喚醒和記憶等重要生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。同樣,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在外周也發(fā)揮重要生理病理調(diào)節(jié)作用。外周血中NE、DA 和5-HT 均有擬交感神經(jīng)活性效應(yīng),對(duì)心血管系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控。此外,這些單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在外周還有各自獨(dú)特而廣泛的作用和效應(yīng)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下單次電針足三里即可對(duì)外周血中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮廣泛的影響。

NE 既是一種神經(jīng)遞質(zhì),也是一種激素。腎上腺髓質(zhì)作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)換器是外周血中NE 的主要來(lái)源,其次交感節(jié)后神經(jīng)元神經(jīng)末梢釋放的NE 也有部分進(jìn)入血液循環(huán),循環(huán)系統(tǒng)中的NE 主要通過(guò)與α型腎上腺素能受體結(jié)合發(fā)揮效應(yīng),對(duì)心血管系統(tǒng)和整個(gè)機(jī)體的代謝產(chǎn)生影響,與應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[15]。有研究[16]顯示,電針麻醉誘導(dǎo)前30 min 預(yù)干預(yù),可以有效抑制腰椎后路開放手術(shù)患者氣管插管即刻時(shí)外周血中的NE濃度,減少氣管插管所導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)于急性腦梗死患者,醒腦開竅針?lè)?lián)合藥物治療可有效降低血清NE、5-HT 水平,改善患者神經(jīng)功能缺損狀態(tài)[17]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,常規(guī)電針刺激20 min 即可引起正常兔子外周血中NE 含量的下調(diào),從而抑制交感神經(jīng)活性,發(fā)揮針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)[18]。研究還發(fā)現(xiàn),電針治療可以通過(guò)調(diào)節(jié)心肌梗死后交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的重塑,顯著降低模型小鼠血清NE 水平,改善心臟功能和拮抗心肌損傷,發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),電針組和對(duì)照組小鼠在早期外周血中NE 均呈現(xiàn)下調(diào),但對(duì)照組小鼠在24 h 后恢復(fù)至干預(yù)前水平,而單次電針的效應(yīng)可持續(xù)至針刺后24 h。

DA 主要在神經(jīng)元和腎上腺髓質(zhì)中合成,循環(huán)血液中的DA 主要受交感神經(jīng)調(diào)控,但在各個(gè)組織器官也能局部合成和釋放[19]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外主要通過(guò)局部旁分泌發(fā)揮作用,在心血管系統(tǒng)可以引起血管擴(kuò)張,在腎臟中增加鈉排泄和尿量,在胰腺中減少胰島素的產(chǎn)生,在消化系統(tǒng)中減低胃腸蠕動(dòng)并保護(hù)胃黏膜[20-21]。而且,近年來(lái)研究[22-23]表明外周DA 在免疫調(diào)節(jié)和抑制炎癥方面發(fā)揮重要作用,能夠調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞活性和細(xì)胞因子的釋放,抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3 炎癥小體依賴性的炎癥反應(yīng)。一項(xiàng)研究[24]表明電針足三里預(yù)刺激15 min 可激活迷走神經(jīng),進(jìn)而促進(jìn)腎上腺髓質(zhì)DA 的合成與釋放,從而抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的膿毒血癥模型小鼠的全身炎癥反應(yīng)。DA 促發(fā)人體基本運(yùn)動(dòng),含量降低時(shí)肢體會(huì)出現(xiàn)震顫等癥狀,研究[25]發(fā)現(xiàn)針刺聯(lián)合西藥治療帕金森可顯著提高患者血清中DA等水平,有助于DA神經(jīng)元修復(fù),改善病情。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,單次電針可有效提高針刺后2 h 至24 h 循環(huán)血液中DA 的含量,且DOPAC/DA 比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但對(duì)照組和電針組之間DOPAC作為DA的代謝產(chǎn)物兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果進(jìn)一步提示單次電針可以促進(jìn)循環(huán)血液中DA 的含量,其機(jī)制可能是電針促進(jìn)了機(jī)體DA的合成和釋放,但可能對(duì)DA 的降解過(guò)程影響不大。

機(jī)體有1%～2%的5-HT 是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成和分泌。而絕大多數(shù)5-HT 是由胃腸道的腸嗜鉻細(xì)胞合成并分泌入血,由血小板吸收和儲(chǔ)存、并在激活后釋放。其中5-HIAA 是5-HT 主要代謝產(chǎn)物。外周5-HT 介導(dǎo)一系列的生理功能,包括參與調(diào)控心率、血管緊張度、腸蠕動(dòng),還能作為生長(zhǎng)激素調(diào)控心臟、大腦和乳腺的發(fā)育以及肝、骨和肺動(dòng)脈的細(xì)胞生長(zhǎng),也是溝通腦腸軸的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ),對(duì)免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)廣泛而復(fù)雜的調(diào)控作用[26-27]。有臨床研究[28-29]顯示無(wú)論是電針還是經(jīng)皮穴位電刺激均能有效抑制手術(shù)患者術(shù)后外周血中5-HT 的濃度,這可能是針刺治療可以抑制患者術(shù)后惡心、嘔吐和疼痛的潛在機(jī)制之一。本次實(shí)驗(yàn)中,雖然電針組和對(duì)照組血清5-HT 和5-HIAA 含量差異幾乎沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是5-HIAA/5-HT 比值在兩組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,電針組高于對(duì)照組,說(shuō)明電針足三里可能同時(shí)影響機(jī)體的5-HT 和5-HIAA 在外周血中的分布發(fā)揮整體調(diào)控作用。上述研究結(jié)果提示針刺可能調(diào)節(jié)NE、DA 和5-HT 含量,可廣泛應(yīng)用于預(yù)防心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病、降低機(jī)體應(yīng)激和調(diào)節(jié)免疫抑制炎癥等方面的多個(gè)病種。例如,一項(xiàng)雙中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)[30]發(fā)現(xiàn),電針可下調(diào)血清5-HT 和 NE 水平發(fā)揮緩解女排運(yùn)動(dòng)員賽前焦慮、減輕賽前壓力并改善賽前焦慮引起的睡眠障礙的作用。

研究[31-33]表明,晝夜節(jié)律變化對(duì)機(jī)體內(nèi)外周血中NE、DA 和5-HT 的含量有明顯的影響。同時(shí),已有的研究[34-35]就顯示不同的應(yīng)激刺激也可以對(duì)上述單胺類神經(jīng)遞質(zhì)外周血中的含量產(chǎn)生不同的影響。且針刺作用具有顯著的時(shí)間依賴效應(yīng),針刺作用可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間的影響[36]。因此,本研究觀察了電針對(duì)外周血24 h 各單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠外周血中相關(guān)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量隨時(shí)間的改變,這一變化可能與晝夜節(jié)律變化以及束縛刺激均有關(guān)系。由于本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察單次電針對(duì)外周血中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響,因此未能設(shè)計(jì)相關(guān)的對(duì)照進(jìn)行排除,是本次研究的不足之處。但是在不同時(shí)間點(diǎn)上電針組與對(duì)照組在一些相關(guān)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物上仍然存在差異性,進(jìn)一步說(shuō)明電針刺激對(duì)外周血中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量具有明確的調(diào)節(jié)作用。上述研究也提示針刺作用具有明顯的后效應(yīng),甚至單一1 次電針刺激,其對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)仍然在結(jié)束后持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間。

綜上所述,本研究探索性地研究了單次電針對(duì)生理狀態(tài)下小鼠外周血單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響,和針刺后24 h 外周血單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化特征。這些結(jié)果不但有助于反應(yīng)和解析電針足三里對(duì)正常機(jī)體啟動(dòng)整體調(diào)節(jié)作用的效應(yīng)機(jī)制,還有助于理解針刺足三里發(fā)揮防病保健效應(yīng)的原理,為中醫(yī)學(xué)治未病重要思想提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。