高壓靜電場下發(fā)酵牛肉風(fēng)味品質(zhì)及微生物群落特性研究

沙 坤 李思源 張松山 張澤俊 劉海杰

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院, 煙臺 264670; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院, 北京 100083;3.河北旅游職業(yè)學(xué)院, 承德 067000; 4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193)

0 引言

發(fā)酵牛肉是一種具有高附加值的便捷特色牛肉產(chǎn)品,符合消費(fèi)者日益改變的生活方式及消費(fèi)需求,對牛肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義[1]。發(fā)酵過程是發(fā)酵牛肉品質(zhì)形成的重要工藝環(huán)節(jié),發(fā)酵過程中,肉中的自由水轉(zhuǎn)化為結(jié)合水形成了其特殊的質(zhì)地,蛋白質(zhì)、脂肪等氧化降解形成了其獨(dú)特的風(fēng)味[2-3]。

高壓靜電場(High-voltage electrostatic field,HVEF)是一種人工綜合效應(yīng)場,發(fā)生裝置通常由直流電源、高壓發(fā)生器、處理室3個(gè)核心裝置組成,直流電源先產(chǎn)生一個(gè)較低的電壓,再通過高壓發(fā)生器將電壓升高,最終作用于處理室的電極形成靜電場[4-5],根據(jù)電極形狀不同可形成均勻或非均勻電場,通常平板電極間的電場被默認(rèn)為勻強(qiáng)電場,針板、線板等非平板電極間的電場為非勻強(qiáng)電場[6]。

HVEF作為一種新型非熱加工技術(shù),節(jié)能高效,能夠最大限度地保持食品的營養(yǎng)物質(zhì),在肉類冷凍解凍、食品保鮮等方面已有廣泛研究[7-9]。目前,已有學(xué)者研究將HVEF用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程。文獻(xiàn)[10]研究HVEF對食醋成分變化的影響,結(jié)果表明,經(jīng)HVEF處理后,食醋中乙醛、乙醇、異丁醇等具有刺激性氣味成分的含量降低,總酸和具有芳香氣味的酯類含量升高,這對提高食醋等級非常有利。文獻(xiàn)[6]通過HVEF輔助發(fā)酵余甘子酵素,將發(fā)酵時(shí)間由49 d縮短至8 d,與無HVEF輔助發(fā)酵制備的余甘子酵素比,HVEF輔助發(fā)酵的樣品必需氨基酸質(zhì)量濃度由0.674 mg/mL提高至1.214 mg/mL,酯類中乙酸乙酯和水楊酸甲酯所占比例顯著提高。 文獻(xiàn)[11] 研究HVEF對干腌牛肉冷藏期間品質(zhì)及揮發(fā)性有機(jī)物的影響,結(jié)果表明,HVEF處理可以延緩冷藏期間干腌牛肉pH值及含水率的降低速率,提高顏色的穩(wěn)定性能,可以提高苯甲醛、三甲基吡嗪及麥芽酚等特征性風(fēng)味成分的含量,HVEF可以應(yīng)用于干腌肉類的貯存。文獻(xiàn)[12]采用HVEF輔助腌制牛肉,結(jié)果表明,HVEF處理可以提高腌制完成后產(chǎn)品的產(chǎn)率,促進(jìn)水分和NaCl在肉樣中的擴(kuò)散。但還鮮有研究將HVEF用于發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)過程。

氣相-離子遷移譜(Gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)是一種新興的揮發(fā)性化合物檢測手段,具有操作簡單、響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析領(lǐng)域[13-14]。目前采用GC-IMS技術(shù)對肉品風(fēng)味研究主要集中在不同種類肉品的風(fēng)味鑒別、摻偽鑒別、新鮮度檢驗(yàn)等,也有研究開始用于比較不同加工方式(如干燥、燉煮、發(fā)酵、老化、干腌等)對肉品風(fēng)味特性的影響[15]。文獻(xiàn)[16]采用GC-IMS技術(shù)在混菌發(fā)酵香腸中共鑒定出33 種揮發(fā)性物質(zhì),可以直觀地看出添加不同種類發(fā)酵劑及發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)種類和含量的變化。高通量測序技術(shù)可以對物種基因組進(jìn)行全面分析,特異性強(qiáng)、靈敏度高,可以全面、客觀地了解某一微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)[17]。文獻(xiàn)[18]采用高通量測序技術(shù)對不同來源的傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析,結(jié)果顯示不同來源臘肉樣品在細(xì)菌組成方面相似性較高。文獻(xiàn)[19]采用通量測序技術(shù)評價(jià)臘腸發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性,發(fā)現(xiàn)乳酸菌對臘腸的發(fā)酵成熟和風(fēng)味品質(zhì)的形成有重要影響。

本文以牛肉為原料,通過HVEF結(jié)合自然發(fā)酵方法制備發(fā)酵牛肉,通過電子鼻、電子舌及GC-IMS分析技術(shù)研究發(fā)酵和HVEF處理對牛肉風(fēng)味品質(zhì)的影響,同時(shí),采用高通量測序技術(shù)測定不同處理組發(fā)酵牛肉中的微生物群落結(jié)構(gòu),以期為揭示高壓靜電場對發(fā)酵牛肉品質(zhì)的影響提供理倫依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛肉(小黃瓜條),購買于河北燕城食品有限公司;腌制用中性大粒鹽、蔗糖、胡椒粉、辣椒、香葉等,食品級,購于北京物美超市。

1.2 儀器與設(shè)備

BS 200S-WEI型電子天平,北京賽多利斯天平有限公司;HI99163型pH計(jì),美國HANNA儀器有限公司;CR-400型色差儀,日本柯尼卡-美能達(dá)公司;BMT-JD020(2.0 kV)型、BMT-JD010(3.0 kV)型靜電場發(fā)生裝置,山東博美特廚業(yè)有限公司;PEN3型電子鼻、SA402B型電子舌,北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司;FlavourSpec型風(fēng)味分析儀,山東海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1發(fā)酵牛肉制備

腌制劑組成:腌制劑使用按腌制劑與原料肉質(zhì)量比添加,食鹽3%,蔗糖0.15%,亞硝酸鈉0.02%,胡椒粉1%,辣椒0.3%,香葉0.5%,腌制前混合均勻。

腌制:將原料牛肉在0～4℃冰箱內(nèi)解凍,修整外形,將腌制劑均勻地涂抹在原料肉表面,在4℃下腌制10 d,期間每2 d翻整1次。

發(fā)酵:腌制完成后,洗去肉表面腌制劑,裝入尼龍網(wǎng)袋。進(jìn)行編號,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對照、2.0 kV處理組、3.0 kV處理組,對照組樣品吊掛在發(fā)酵間(溫度 15～20℃、相對濕度60%～65%)發(fā)酵42 d,2.0 kV組和3.0 kV組分別將2.0、3.0 kV靜電場發(fā)生裝置接至吊掛發(fā)酵牛肉的鐵架上,其他條件與對照組一致。

取樣:3組處理分別取發(fā)酵第0、42天的肉樣用于指標(biāo)的測定。

1.3.2含水率

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》,采用直接干燥法測定。

1.3.3pH值

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》。

1.3.4肉色

使用色差計(jì)測定樣品的L*、a*和b*值。肉樣切開后,于室溫(20℃)氧合40 min后測定,每個(gè)樣品測定3次,結(jié)果取平均值。

稱取1 g樣品于10 mL頂空瓶中,將頂空瓶密封,室溫平衡20 min,60℃水浴30 min,室溫平衡 30 min,平衡結(jié)束后使用PEN3型電子鼻進(jìn)行檢測分析。進(jìn)樣流量600 mL/min,洗脫時(shí)間300 s,檢測時(shí)間300 s。選用296～300 s響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用的電子鼻傳感器類型及性能如下:WIC,對芳香成分敏感;W5S,對氮氧化物敏感;W3C,對氨、芳香類化合敏感;W6S,對氫化物有選擇性;W5C,對烷烴、芳香化合物敏感;W1S,對甲烷敏感;W1W,對無機(jī)硫化物敏感;W2S,對醇類及部分芳香化合物敏感;W2W,對芳香成分、有機(jī)硫化物敏感;W3S,對長鏈烷烴敏感。

1.3.6電子舌

稱取5 g樣品于離心管中,加入20 mL預(yù)熱至38℃的超純水,渦旋儀處理30 min,再加入20 mL預(yù)熱至38℃的超純水,37℃超聲30 min,室溫8 000 r/min、離心10 min,取上清液用砂芯漏斗抽濾,濾液稀釋 2倍, 通過SA402B型味覺分析系統(tǒng)檢測分析。選擇Sample_Measurement(2steps_washing)測試方法:第 1次 清洗溶劑90 s,第2次清洗溶劑60 s,第3次清洗溶劑60 s,調(diào)解溶劑30 s、樣品液30 s,第4次清洗溶劑3 s、第5次清洗溶劑3 s、標(biāo)準(zhǔn)清洗溶劑30 s。使用的電子舌傳感器為:AEE(鮮味)、CA0(酸味)、CT0(咸味)、C00(苦味)、AE1(澀味)。

1.3.7揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

稱取2 g樣品于20 mL頂空瓶中,60℃孵育 20 min 后進(jìn)樣。

自動(dòng)進(jìn)樣單元:進(jìn)樣體積500 μL,孵育時(shí)間 20 min,孵育溫度60℃,進(jìn)樣針溫度85℃,孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

氣相-離子遷移譜單元:FS-SE-54-CB-1型色譜柱(15 m×0.53 mm),色譜柱溫度為60℃,載氣為N2,IMS溫度45℃,分析時(shí)間25 min。應(yīng)用VOCal軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

對命運(yùn)的反抗，一直是陳凱歌導(dǎo)演作品隱藏的深層次主題，而其表現(xiàn)形式大多為因?qū)π拍畹膱?jiān)持而最終毀滅，往往呈現(xiàn)出悲劇性的色彩。我們可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)下電影市場中優(yōu)秀的電影作品總是有著深厚的人文內(nèi)涵，藝術(shù)總是為人而存在，應(yīng)該緊緊圍繞著“人”這一主題。陳凱歌導(dǎo)演身上所承載的“現(xiàn)代士人精神”需要大力弘揚(yáng)，重構(gòu)“現(xiàn)代士人精神”是構(gòu)建“中國電影學(xué)派”不可或缺的一環(huán)。

1.3.8微生物群落

使用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒提取樣品DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,NanoDrop2000型核酸蛋白測定儀檢測DNA純度和濃度。

真菌DNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增引物分別為ITS1F和ITS2R,序列分別為5′-CTTGGTCATTT AGAGGAAGTAA-3′和5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′。ITS1F-ITS2R引物PCR反應(yīng)體系包括:10 ng 模板DNA,2 μL 10×Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPS,0.8 μL 5 μmol/L各引物,0.2 μL rTaq Polymerase聚合酶,0.2 μL BSA(牛血清白蛋白),補(bǔ)二次蒸餾水至20 μL。

細(xì)菌DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR擴(kuò)增引物分別為338F和806R,序列分別為5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3′和5′- GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′。338F_806R引物PCR反應(yīng)體系包括:10 ng 模板DNA、4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPS、0.8 μL 5 μmol/L 各引物、0.4 μL FastPfu Polymerase聚合酶、0.2 μL BSA、補(bǔ)二次蒸餾水至 20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為:1×(95℃,3 min)、27×(95℃,30 s;55℃,30 s;72℃,45 s)、1×(72℃,10 min)。

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,檢測合格后通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司高通量測序平臺進(jìn)行檢測,并通過美吉生信云平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行方差分析,用Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)的分析

不同處理組牛肉發(fā)酵后的理化指標(biāo)如表1所示(表中ΔE表示色差)。

表1 不同處理組發(fā)酵牛肉的理化指標(biāo)Tab.1 Physicochemical indexes of fermented beef in different treatment groups

2.1.1含水率

由表1可知,發(fā)酵42 d,3組樣品含水率均大幅下降,對照組、2.0 kV組、3.0 kV組樣品含水率分別為54.75%、45.17%、40.40%,2.0 kV組和3.0 kV組均顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明,發(fā)酵時(shí)間對樣品含水率有極顯著影響(P<0.001),HVEF會極顯著促進(jìn)牛肉的脫水干燥過程(P<0.001),且電壓越高,效果越顯著。含水率降低,使水溶性的游離氨基酸和還原糖等物質(zhì)濃縮,這些物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的底物,能生成醛、酮、烷烴和酯類等一系列揮發(fā)性物質(zhì),有利于發(fā)酵肉制品風(fēng)味的形成[20];而且,水分損失會增高牛肉中的鹽濃度,鹽一方面可以為發(fā)酵牛肉提供咸味,另一方面可以抑菌,有助于發(fā)酵牛肉的長期保存[21]。

2.1.2pH值

由表1可知,發(fā)酵42 d,3組樣品的pH值均顯著增加(P<0.05),且3.0 kV組顯著高于2.0 kV組與對照組(P<0.05)。發(fā)酵過程中,產(chǎn)品pH值的上升與蛋白質(zhì)水降解產(chǎn)生堿性物質(zhì)有關(guān)[22],較高電壓處理可能會使蛋白水解加劇,促進(jìn)pH值增加,但整體來看HVEF對pH值沒有顯著影響(P>0.05)。

2.1.3肉色

色澤是發(fā)酵牛肉的重要品質(zhì)指標(biāo)。L*表示肉的亮度,a*表示紅度,b*表示黃度。由表1可知,發(fā)酵42 d,發(fā)酵時(shí)間和HVEF處理對樣品的L*值均無顯著影響(P>0.05),HVEF和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對發(fā)酵牛肉的L*和b*值無顯著影響(P>0.05),與文獻(xiàn)[11]的研究結(jié)果一致。2.0 kV組樣品的a*值發(fā)酵后顯著降低,且顯著低于對照組與3.0 kV組(P<0.05)。發(fā)酵42 d,不同處理組樣品的ΔE有顯著差異(P<0.05),對照組、2.0 kV組、3.0 kV組的ΔE值依次為2.25、9.16、4.76。a*值為預(yù)測消費(fèi)者對牛肉顏色接受程度的指標(biāo),a*值較高,消費(fèi)者的接受程度較高,ΔE值與肉的色澤穩(wěn)定性有關(guān),ΔE值越小,說明肉的色澤越穩(wěn)定[11]。因此,2.0 kV HVEF處理可能會對發(fā)酵牛肉的色澤穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。

2.2 電子鼻結(jié)果分析

圖1為發(fā)酵牛肉電子鼻檢測傳感器數(shù)據(jù)雷達(dá)圖,4組樣品的W1W、W2W、W5S傳感器的響應(yīng)值變化顯著,W1W傳感器對無機(jī)硫化物敏感,W2W對有機(jī)硫化物敏感,W5S對氮氧化合物敏感。由圖1 可知,對照組W1W、W2W、W5S傳感器響應(yīng)值最低,其次是發(fā)酵0 d樣品,HVEF處理的兩組樣品的響應(yīng)值顯著增大,且3.0 kV組最高。含硫化合物氣味閾值很低,具有熟肉、青草、燒烤等氣味,主要來源于含硫氨基酸和硫胺素的降解[23-24],說明HVEF處理有利于這類反應(yīng)的進(jìn)行。圖2為10個(gè)傳感器數(shù)據(jù)經(jīng)主成分分析轉(zhuǎn)化為2個(gè)變量PC1(59.0%)、PC2(38.9%),累計(jì)貢獻(xiàn)率97.9%,能夠解釋樣本總體的變異。從圖2可以看出,4組樣品分布在不同區(qū)域,表明各組樣品之間揮發(fā)性氣味成分存在明顯差異,可以通過主成分分析進(jìn)行較好的區(qū)分。

圖1 不同處理組發(fā)酵牛肉電子鼻傳感器雷達(dá)圖Fig.1 Radar image of electronic nose sensor of fermented beef in different treatment groups

圖2 不同處理組發(fā)酵牛肉電子鼻數(shù)據(jù)主成分分析Fig.2 Principal component analysis of electronic nose data of fermented beef in different treatment groups

2.3 電子舌結(jié)果分析

不同處理組發(fā)酵牛肉的電子舌實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成雷達(dá)圖如圖3所示。電子舌傳感器十分靈敏,可以檢測到人的舌頭無法辨別的味道,因此每個(gè)傳感器都設(shè)有無味點(diǎn)[25-26],低于無味點(diǎn)的數(shù)據(jù)認(rèn)為無法被人的舌頭辨別。實(shí)驗(yàn)中苦味、鮮味、咸味、豐富度的值在無味點(diǎn)之上,去除無味點(diǎn)后,重新繪制雷達(dá)圖,如圖4所示。由圖4可知,與發(fā)酵0 d的樣品相比,發(fā)酵42 d的3組樣品的鮮味、咸味和苦味傳感器響應(yīng)值均增加,且從小到大依次為3.0 kV組、2.0 kV組、對照組。咸味響應(yīng)值增高,一方面可能是因?yàn)镠VEF處理發(fā)酵后牛肉失水較多,導(dǎo)致牛肉中NaCl濃度升高[27],另一方面,可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水解產(chǎn)生了咸味肽[28]。鮮味和苦味響應(yīng)值的增高可能由于發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解使呈鮮味及苦味的肽和氨基酸含量增加,也可能與核苷酸含量增加有關(guān)[29-30],而且氨基酸和核苷酸的協(xié)同作用也會增加鮮味[28]。發(fā)酵42 d的樣品豐富度的響應(yīng)值高于發(fā)酵0 d的樣品,但發(fā)酵42 d的3組樣品之間無差異。以上結(jié)果說明,HVEF處理會促進(jìn)牛肉中的蛋白質(zhì)水解,產(chǎn)生小分子肽和氨基酸,從而影響發(fā)酵牛肉的滋味。

圖3 不同處理組發(fā)酵牛肉電子舌雷達(dá)圖Fig.3 Radar image of electronic tongue sensor of fermented beef in different treatment groups

圖4 不同處理組發(fā)酵牛肉電子舌雷達(dá)圖(扣除無味點(diǎn))Fig.4 Radar image of electronic tongue sensor of fermented beef in different treatment groups(removing tasteless point)

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

不同處理組發(fā)酵牛肉中揮發(fā)性成分的二維 GC-IMS 差異對比譜圖如圖5所示。橫坐標(biāo)1.0 ms處豎線為反應(yīng)離子峰(RIP峰),RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表的是一種揮發(fā)性成分。采用差異模式進(jìn)行樣品間的差異比較,以發(fā)酵0 d的譜圖作為參比,其他樣品的譜圖扣減參比?？蹨p后的背景為白色,則揮發(fā)性成分一致,紅色代表該物質(zhì)濃度比參比樣品高,藍(lán)色代表比參比低。從圖5可以看出,與發(fā)酵 0 d 的樣品比較,發(fā)酵42 d的3組牛肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量表現(xiàn)出比較明顯的差異,有不同程度的升高或降低。

圖5 不同處理組發(fā)酵牛肉揮發(fā)性成分的GC-IMS譜圖Fig.5 GC-IMS spectrum of volatile components of fermented beef in different treatment groups

經(jīng)過對比特征性物質(zhì)的保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間,通過GC-IMS數(shù)據(jù)庫檢索來對揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析,結(jié)果如表2所示。從樣品中共鑒別出43種揮發(fā)性成分,包括一些化合物的二聚體和多聚體,其中,醇類12種,酮類10種,醛類9種,烯類8種,其他4種。

為更好地分析不同處理組樣品之間揮發(fā)性成分的差異,依據(jù)各組樣品重復(fù)測定3次所得GC-IMS二維圖譜中所有的待分析峰構(gòu)建成指紋圖譜,結(jié)果如圖6所示。圖中每一行代表一個(gè)樣品中選取的全部信號峰,每一列代表同一物質(zhì)在不同樣品中的信號峰。從圖6可以看出,紅框中的物質(zhì)包括4-萜烯醇、芳樟醇、α-松油醇、順-3-己烯-1-醇、己醛、壬醛、辛醛、庚醛、α-水芹烯、3-戊酮、α-蒎烯、β-蒎烯、1-戊醇、1-己醇、3-羥基-2-丁酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-戊酮、丁酮、檸檬烯、1,8-桉樹腦和乙醇等,在發(fā)酵0 d的樣品中含量較高,發(fā)酵42d的3組樣品中含量出現(xiàn)不同程度的下降,結(jié)果表明這些物質(zhì)在腌制結(jié)束后就已經(jīng)快速生成,它們主要來源于香辛料的添加和脂肪氧化[24,31],隨著發(fā)酵過程進(jìn)行,這些物質(zhì)易被氧化或相互反應(yīng)生成酯類物質(zhì),所以出現(xiàn)含量下降[32]。

圖6 不同處理組發(fā)酵牛肉揮發(fā)性成分指紋圖譜對比Fig.6 Comparison of volatile compounds fingerprints of fermented beef in different treatment groups

而橙框中的物質(zhì)在發(fā)酵0 d的樣品中含量較低,在發(fā)酵42 d的3組樣品中含量不同程度上升,這些物質(zhì)包括苯甲醛、2-乙酰-1-吡咯啉和3-甲基丁醇等,表明這些物質(zhì)主要形成于發(fā)酵過程,這一結(jié)果與文獻(xiàn)[33]一致。苯甲醛具有苦杏仁味,3-甲基丁醇呈清香味,這些物質(zhì)主要來自于氨基酸的Strecker 降解[34]。發(fā)酵42 d,HVEF處理的牛肉中的苯甲醛含量低于對照組,且電壓越高含量越低。

綠框中的物質(zhì)為2-戊酮,與發(fā)酵0 d相比,發(fā)酵42 d后,對照組中的該物質(zhì)含量升高,而HVEF處理組中的該物質(zhì)含量下降。2-戊酮主要來自于微生物作用下的脂肪不完全β-氧化,能夠賦予肉制品特殊的果香、辛辣等發(fā)酵風(fēng)味[35-36]。

為進(jìn)一步研究發(fā)酵時(shí)間和HVEF處理對發(fā)酵牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響,將不同處理組樣品中揮發(fā)性成分指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果如圖7 所示,PC1和PC2累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到88%,能夠解釋樣本總體的變異。從圖7可以看出,4組樣品分布在3個(gè)區(qū)域,對照組和2.0 kV處理組聚集在一起,表明兩組樣品的揮發(fā)性成分比較接近,而 0 d 發(fā)酵組及3.0 kV處理組分布在相對較遠(yuǎn)的區(qū)域,表明3個(gè)區(qū)域樣品之間揮發(fā)性成分存在明顯差異,可以通過主成分分析進(jìn)行較好的區(qū)分。這一結(jié)果與電子鼻結(jié)果不完全一致,可能是兩種檢測方法的差異導(dǎo)致。電子鼻是通過識別樣品的整體揮發(fā)性風(fēng)味成分對樣品之間進(jìn)行差異比較,而GC-IMS技術(shù)是通過鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行差異分析,受檢測數(shù)據(jù)庫限制,有些物質(zhì)可能不能通過GC-IMS技術(shù)檢測到,如電子鼻檢測結(jié)果中含硫化合物的感應(yīng)信號較強(qiáng),但在GC-IMS鑒定結(jié)果中并未鑒定出含硫化合物的存在。

圖7 不同處理組發(fā)酵牛肉揮發(fā)性成分指紋圖譜主成分分析Fig.7 Principal component analysis of volatile components fingerprint of fermented beef in different treatment groups

2.5 微生物多樣性分析

2.5.1菌群結(jié)構(gòu)

圖8為基于屬水平的發(fā)酵牛肉中真菌菌落結(jié)構(gòu)圖。發(fā)酵0 d牛肉中的優(yōu)勢菌為Penicillium、Debaryomyces和曲霉菌屬(Aspergillus),所占百分比分別為45.73%、19.97%、14.29%。發(fā)酵42 d,不同處理組樣品中的優(yōu)勢菌群都為Penicillium和Debaryomyces,但是所占比例不同,對照組、2.0 kV組、3.0 kV組中Penicillium和Debaryomyces所占百分比分別為84.69%和15.29%、62.75%和36.93%、61.72%和37.91%。Penicillium的活性作用與發(fā)酵肉制品中脂肪及蛋白質(zhì)氧化分解產(chǎn)生的酮類、醛類、醇類等風(fēng)味物質(zhì)有關(guān),Debaryomyces的活性作用與酯類和酸類風(fēng)味物質(zhì)的生成有關(guān)[32,36]。

圖8 基于屬水平的牛肉中真菌菌落結(jié)構(gòu)Fig.8 Fungi community of beef based on genus level

圖9為基于屬水平的牛肉中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)圖,發(fā)酵0 d牛肉樣品中的優(yōu)勢菌為Staphylococcus,所占百分比為54.24%。發(fā)酵42 d,不同處理組樣品中的優(yōu)勢菌群都有Staphylococcus,但所占比例不同,對照組為55.31%,2.0 kV組為78.69%,3.0 kV組為93.21%。另外,對照組還有一優(yōu)勢菌群,為Lactobacillus,所占百分比為27.53%。文獻(xiàn)[34]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵肉制品中的主要優(yōu)勢微生物為清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)和Staphylococcus,Staphylococcus普遍具有較強(qiáng)的蛋白酶和酯酶活性,能夠有效促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的生成[23]。

圖9 基于屬水平的發(fā)酵牛肉中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)Fig.9 Bacterial community of beef based on genus level

2.5.2Alpha-多樣性分析

基于OUT聚類分析結(jié)果,Sobs指數(shù)反映實(shí)際測量的OUT數(shù)目,Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均可表征群落豐富度,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均可表征群落微生物多樣性,Coverage指數(shù)代表測序文庫覆蓋率。由表3和表4可知,樣品的Coverage指數(shù)均為0.99,說明樣品可代表真實(shí)情況。發(fā)酵42 d,樣品真菌及細(xì)菌的Sobs指數(shù)均下降。真菌及細(xì)菌Ace和Chao指數(shù)均下降,HVEF處理樣品真菌Ace指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),細(xì)菌Ace指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05),說明在發(fā)酵過程中真菌和細(xì)菌群落豐富度均降低,HVEF處理會增加真菌豐富度,降低細(xì)菌豐富度,不同電壓處理組之間差異不顯著。Shannon指數(shù)越大則多樣性越高,而Simpson指數(shù)越大則多樣性越低,發(fā)酵42 d,真菌及細(xì)菌Shannon指數(shù)均降低,3.0 kV HVEF處理Shannon指數(shù)顯著高于其他兩組(P<0.05),HVEF處理Shannon指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05);發(fā)酵42 d,真菌的Simpson指數(shù)增大,3.0 kV HVEF Simpson指數(shù)處理顯著低于其他兩組(P<0.05),細(xì)菌的Simpson指數(shù)減小,HVEF處理組顯著低于對照組(P<0.05),以上結(jié)果表明,3.0 kV HVEF處理有利于保持樣品中真菌及細(xì)菌的多樣性。

表3 真菌Alpha-多樣性指數(shù)Tab.3 Alpha diversity index of fungi

表4 細(xì)菌Alpha-多樣性指數(shù)Tab.4 Alpha diversity index of bacterial

3 結(jié)束語

本研究將HVEF應(yīng)用于發(fā)酵牛肉的生產(chǎn),結(jié)果表明,HVEF處理會極顯著促進(jìn)牛肉的脫水干燥過程(P<0.001),對pH值、L*和b*值無顯著影響,但2.0 kV HVEF處理會顯著降低a*值、增加ΔE值(P<0.05),對發(fā)酵牛肉的色澤穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。電子鼻分析表明,不同處理組發(fā)酵牛肉樣品之間風(fēng)味差異較大,可以通過主成分分析進(jìn)行較好區(qū)分。電子舌分析表明,HVEF處理會增加鮮味、咸味和苦味物質(zhì)的含量。通過GC-IMS分析,共鑒別出43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醇類12種,酮類10種,醛類9種,烯類8種,其他4種。高通量測序結(jié)果表明,HVEF處理會改變發(fā)酵牛肉中真菌和細(xì)菌優(yōu)勢菌的比例,增加具有較強(qiáng)的蛋白酶和酯酶活性的Staphylococcus比例。綜合分析表明,3.0 kV HVEF處理對發(fā)酵牛肉品質(zhì)提升有較好促進(jìn)作用,在實(shí)際生產(chǎn)中具有較好應(yīng)用前景。