安徽銅陵地區(qū)首例血流感染耳念珠菌的耐藥性及溯源分析*

潘愷 陳繼中 王中新 胡志軍 朱娟娟

1安徽省銅陵市人民醫(yī)院，安徽銅陵 244000，2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230000

耳念珠菌由日本在2009年首次報(bào)道，分離于一名患者外耳道內(nèi)而得名，其對(duì)臨床常規(guī)抗真菌感染治療藥物的高度耐藥性和高致死率，易引起醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)事件發(fā)生，因此被稱為“超級(jí)真菌”[1-2]，目前質(zhì)譜系統(tǒng)和基因測(cè)序具有較高的精準(zhǔn)性，廣泛應(yīng)用于臨床的病原微生物菌種鑒定，本文應(yīng)用該方法對(duì)中國(guó)安徽省某三甲醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科一例血流感染耳念珠菌患者的病例進(jìn)行分析報(bào)道。

資料與方法

1 一般資料

男性患者，77歲，2021年9月21日因“頸椎椎體手術(shù)后突發(fā)呼吸心跳驟停”轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)病房，入院診斷為（1）呼吸心跳驟停，（2）缺血缺氧性腦病后遺癥，（3）2型糖尿病，（4）高血壓，（5）高脂血癥。入住重癥監(jiān)護(hù)病房后予以機(jī)械通氣、維持血壓、腦保護(hù)、抗細(xì)菌感染等治療，患者入院后一直處于淺昏迷狀態(tài)，長(zhǎng)期鼻飼、留置導(dǎo)尿管。血液、呼吸、心血管系統(tǒng)查體未見(jiàn)異常。2022年5月22日—6月1日因痰培養(yǎng)和中段尿培養(yǎng)檢出泛耐藥肺炎克雷伯菌及泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌先后調(diào)整哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、替加環(huán)素三種抗菌藥物抗細(xì)菌感染治療?？辜?xì)菌感染期間，真菌（1，3）-β-D葡聚糖試驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)異常（＜60 pg/mL）。6月2日（1，3）-β-D葡聚糖的檢測(cè)結(jié)果為150.10 pg/mL，提示患者深部真菌感染。2022年6月5日患者復(fù)查真菌（1，3）-β-D葡聚糖檢測(cè)結(jié)果為220.40 pg/mL。同日送檢的血液培養(yǎng)及靜脈導(dǎo)管細(xì)菌培養(yǎng)均于6月6日?qǐng)?bào)陽(yáng)，隨即抽取血培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種哥倫比亞血瓊脂平板和沙堡弱斜面瓊脂并涂片革蘭染色，涂片可見(jiàn)酵母樣真菌孢子，見(jiàn)圖1，支持酵母樣真菌血流及導(dǎo)管感染判斷。

圖1 血培養(yǎng)直接涂片

6月8日臨床科室經(jīng)驗(yàn)治療給予卡泊芬凈50 QD靜脈滴注治療方案，6月15日再次送檢雙側(cè)雙瓶血液培養(yǎng)依然檢出耳念珠菌。該患者基礎(chǔ)性疾病多，多器官功能衰竭，長(zhǎng)期臥床，免疫力低下，耳念珠菌的高毒力表現(xiàn)和多重耐藥性導(dǎo)致抗真菌治療效果不佳，患者于6月23日臨床死亡。

2 儀器和試劑

血液培養(yǎng)儀使用BD BACTEC FX全自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)；菌株鑒定使用生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和重慶中元公司產(chǎn)品的EXS1000全自動(dòng)微生物飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)；沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂平板和CHROmagar念珠菌顯色平板選用江門市凱林貿(mào)易有限公司產(chǎn)品，真菌（1，3）-β-D葡聚糖檢測(cè)試劑盒（光度法）使用北京金山川科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

3 方法

真菌菌種鑒定使用飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)的甲酸裂解法[3-4]；本研究中使用的其他耳念珠菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列均來(lái)自于NCBI的Blast數(shù)據(jù)庫(kù)；一代測(cè)序委托安徽合肥金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，使用引物ITS1及ITS4的序列分別為5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；全基因組測(cè)序委托上海生工生物工程公司檢測(cè)；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用MEGA7.0軟件進(jìn)行繪制。

結(jié) 果

1 VITEK2和質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定結(jié)果

抽取血培養(yǎng)瓶樣本轉(zhuǎn)種在血瓊脂平板和沙堡弱斜面瓊脂上，二者分別置于36℃和28℃下進(jìn)行培養(yǎng)，18 h后兩培養(yǎng)基表面均可見(jiàn)乳白色奶油狀凸起菌落生長(zhǎng)。隨即使用VITEK2的YST酵母菌鑒定卡鑒定，得出的結(jié)果為耳念珠菌，置信度99%。同時(shí)挑取沙堡弱上單個(gè)菌落使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（MALDI-TOF MS）鑒定為耳念珠菌，鑒定得分為2.23。

2 CHROmagar念珠菌顯色平板顏色變化

平板置于28℃培養(yǎng)24 h和48 h后均呈乳白色，菌落在72 h后開(kāi)始顯現(xiàn)出淺粉紅色，顯色結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 CHROmagar念珠菌顯色培養(yǎng)基24、48、72 h顯色結(jié)果

3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

我們將測(cè)得的藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)和中國(guó)境內(nèi)已報(bào)道的5例耳念珠菌（廈門2例XM1803、XM1805，北京3例C1921、C1922、BJCA001）[5-6]進(jìn)行了對(duì)照，見(jiàn)表1，VITEK2藥物敏感試驗(yàn)提示該例真菌對(duì)唑類及多烯類抗真菌藥物均耐藥，僅對(duì)5-氟胞嘧啶敏感。

4 耐藥基因比對(duì)結(jié)果

為了解該菌的耐藥機(jī)制，我們將與該菌有關(guān)的耐藥基因序列[7]和參考序列進(jìn)行了比對(duì)，敏感菌參考序列來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

對(duì)該菌進(jìn)行一代測(cè)序鑒定后將基因測(cè)序結(jié)果輸入BLASTN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)該菌株ITS區(qū)域基因序列與2017年南非上傳至BLASTN數(shù)據(jù)庫(kù)的分離株（KY656976）、2017年印度分離株（MK108049）、2022年印度分離株（ON331802）以及2022年印度分離株（ON331807）的基因序列具有100%的相似度。之后我們繼續(xù)使用ITS區(qū)域的序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)繪制用于分析該菌株的來(lái)源情況，我們選擇了中國(guó)境內(nèi)的已報(bào)道的5個(gè)菌株以及BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中ITS序列相似性最高的9個(gè)菌株進(jìn)行比對(duì)并繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3，比對(duì)顯示我們分離的菌株（AHTLCA-001，以藍(lán)色三角標(biāo)注）和印度株（MK108049.1）親緣性最為接近。

圖3 安徽省分離的耳念珠菌與參考菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

6 毒力因素分析

我們使用全基因組測(cè)序結(jié)果做了KEGG ORTHOLOG（KO）注釋，根據(jù)KO與通路的聯(lián)系對(duì)其進(jìn)行了KEGG代謝通路分類，獲得了通路的分支柱狀圖，見(jiàn)圖4，縱軸為參與到該代謝通路名稱，橫軸為注釋到該通路下的基因數(shù)量。在與人類疾病相關(guān)基因通路中，感染類疾病基因表達(dá)數(shù)量最高，其次為腫瘤通路和神經(jīng)退行性疾病通路。

圖4 KEGG通路分類柱狀圖

討 論

耳念珠菌可定植于普通病房和重癥監(jiān)護(hù)病房的環(huán)境中和患者皮膚上，在患者免疫功能良好的情況下不會(huì)引起感染。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)人群如長(zhǎng)期臥床、長(zhǎng)期使用廣譜抗菌藥物、血管插管的患者、HIV感染患者尤為易感，本研究從血液中分離出耳念珠菌的患者患有糖尿病、高血壓及長(zhǎng)期臥床，易受到環(huán)境定植中的耳念珠菌感染。趙偉娜等[7]報(bào)道耳念珠菌極易在重癥監(jiān)護(hù)環(huán)境中傳播，推測(cè)與共同使用的醫(yī)療設(shè)備上定植該菌有關(guān)，回顧本例患者病程我們發(fā)現(xiàn)，在該患者血培養(yǎng)檢出耳念珠菌前兩周，其鄰床患者中段尿培養(yǎng)中也檢出該菌，可能這兩名患者之間存在交叉感染。

使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）和真菌基因測(cè)序鑒定可更準(zhǔn)確的鑒定菌種[8-10]，與黃小強(qiáng)等[11]報(bào)道不同的是，本例菌株使用VITEK2真菌鑒定系統(tǒng)也可準(zhǔn)確鑒定到種，這可能與近年來(lái)VITEK2鑒定系統(tǒng)菌株庫(kù)不斷升級(jí)有關(guān)，但為了確保該菌與其易混淆的酵母樣真菌如希木龍念珠菌，釀酒酵母和無(wú)名念珠菌更準(zhǔn)確的鑒別，推薦實(shí)驗(yàn)室使用MALDI-TOF MS或分子生物學(xué)方法檢測(cè)。

國(guó)際上關(guān)于耳念珠菌的耐藥情況報(bào)道多指出其對(duì)唑類、多烯類和棘白菌素類抗真菌藥物普遍耐藥[12]，如CHOWDHARY等[13]在2020年報(bào)道的10株印度株中，所有分離株均對(duì)氟康唑耐藥，40%對(duì)兩性霉素B耐藥，60%對(duì)5-氟胞嘧啶耐藥，MAGOBO等[14]報(bào)道85株南非分離株藥敏結(jié)果顯示僅對(duì)唑類抗真菌藥物呈現(xiàn)耐藥性。因CLSI中目前尚未發(fā)布耳念珠菌藥物敏感折點(diǎn)，所以在本研究中我們選擇了使用白念珠菌的折點(diǎn)進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示其對(duì)唑類和兩性霉素B耐藥，對(duì)5-氟胞嘧啶敏感，在與北京報(bào)道的耳念珠菌（C1921，C1922）和廈門報(bào)道菌株（XM1803，XM1805）測(cè)試的藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，氟康唑、兩性霉素B的折點(diǎn)相同，呈現(xiàn)多重耐藥性，見(jiàn)表1。即便中國(guó)境內(nèi)報(bào)道的第一株耳念珠菌（BJCA001）菌株對(duì)所有抗真菌藥物敏感，然而在中國(guó)境內(nèi)多重耐藥的耳念珠菌也已經(jīng)存在[15-16]。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)

表2 耐藥基因序列檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

有文獻(xiàn)指出生物膜形成是真菌對(duì)唑類或多烯類藥物耐藥的原因，而外排泵相關(guān)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）會(huì)在成熟的生物膜中顯著出現(xiàn)，該例真菌的全基因組測(cè)序中檢出其攜帶了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因ABCB1基因，有上述原因得知，該例耳念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥的原因?yàn)镋RG11及CDR1基因突變，而生物膜的形成導(dǎo)致了對(duì)多烯類的耐藥表現(xiàn)。

棘白菌素類耐藥基因與FKS1基因的三個(gè)熱點(diǎn)突變有關(guān)[17]。通過(guò)序列比對(duì)，我們未發(fā)現(xiàn)S639Y、S639P、S639F三個(gè)熱點(diǎn)突變。因此，臨床所使用的卡泊芬凈應(yīng)該對(duì)治療真菌感染有效。然而在本次入院治療之前，該患者處于淺昏迷狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)5年。病程中患者長(zhǎng)期臥床，反復(fù)出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)感染，基礎(chǔ)情況差。因此對(duì)于該患者實(shí)施的氣管切開(kāi)、靜脈留置管、導(dǎo)尿管、口鼻胃管、腸管等侵入性治療措施無(wú)法停止。此外，患者的各器官功能衰竭在治療后期逐步加重，患者年齡較大，機(jī)體代償能力差。而念珠菌敗血癥的治療效果與患者本身狀況、耐受情況以及給藥方式密切相關(guān)，因此該患者的念珠菌血流感染并未得到控制。

此外，念珠菌的致病因子多為酯酶、磷脂酶及溶血素等，全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，該菌株基因組中檢出編碼分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPs）相關(guān)基因16組，而SAPs主要為致病性念珠菌屬分泌的一類可降解宿主蛋白質(zhì)的胃蛋白酶樣蛋白酶，這與該例耳念珠菌的高致病和高毒力有關(guān)。

醫(yī)院感染防控方面，耳念珠菌藥敏試驗(yàn)結(jié)論成為臨床治療相關(guān)感染的重要指標(biāo)。除此之外，及早診斷和及時(shí)治療由耳念珠菌引起的感染，可以明顯改善患者的臨床轉(zhuǎn)歸[18]。臨床科室應(yīng)針對(duì)性的使用有病原微生物實(shí)驗(yàn)室出具的藥敏試驗(yàn)結(jié)果治療。此外耳念珠菌可以在環(huán)境中存在7天依然有傳染性[19]，具有高度持久性并難以準(zhǔn)確鑒定和找到傳播途徑，故做好環(huán)境消毒成為預(yù)防耳念珠菌醫(yī)院感染的重要途徑之一，紫外線消毒和常用的表面消毒劑消毒能有效防止耳念珠菌在環(huán)境中的定植[20]，如有必要，需要更換或停止使用可接觸患者的重復(fù)使用醫(yī)療設(shè)備，如血壓監(jiān)測(cè)綁帶，水銀體溫表等。

本研究探討了安徽省首次報(bào)道的血流感染耳念珠菌的相關(guān)信息。該株菌株具有多重耐藥性。在中國(guó)境內(nèi)報(bào)道的耳念珠菌中，絕大部分（19/21）屬于南非分支進(jìn)化株。基于ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，本例菌株與印度分支進(jìn)化株的親緣關(guān)系最為接近。它屬于國(guó)內(nèi)已經(jīng)報(bào)道的第二個(gè)南亞分離株。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突