整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證復(fù)方脈絡(luò)寧抗腦缺血的作用機制

王可 ，樓燁亮 ，高倩 ，徐水凌

(1.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314001；2.麗水市人民醫(yī)院，浙江麗水323000)

缺血性腦血管病為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以腦血液循環(huán)障礙為主要特征.具有高發(fā)生率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特征，嚴重危害人體健康，目前，西醫(yī)治療腦缺血的臨床效果仍難以讓人滿意.[1]中藥由于可多靶點、多途徑整體干預(yù)腦缺血的發(fā)生發(fā)展，在腦缺血治療中具有獨特的優(yōu)勢和潛力.脈絡(luò)寧源自著名醫(yī)方“四妙勇安湯”，由玄參、牛膝、石斛、金銀花等組成，化學(xué)成分包括香豆素類、苯丙素類、昆蟲變態(tài)激素、三萜皂苷等，具有養(yǎng)陰清熱、活血化瘀的功效.[2-3]臨床上廣泛用于治療缺血性腦血管病，[4]療效可靠，副作用小.有研究表明，脈絡(luò)寧注射液能明顯縮小MCAO大鼠的腦梗死范圍.[5]另外，脈絡(luò)寧抗腦缺血與保護線粒體功能相關(guān)，但具體機制尚未完全清晰.本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，同時構(gòu)建PC12細胞氧糖剝奪模型，探討脈絡(luò)寧抗腦缺血的作用機制，為后續(xù)研究提供支持.

1 資料與方法

1.1 脈絡(luò)寧活性成分靶點獲取及靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

從TCMSP中檢索篩選玄參、牛膝、石斛及金銀花的化學(xué)成分，將符合口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18的化合物確定為潛在的活性成分；[6]通過Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索所含成分對應(yīng)的SMILES號，借助Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測，[7]獲得脈絡(luò)寧活性成分合集及對應(yīng)靶點合集.

1.2 腦缺血疾病相關(guān)靶點及藥物-疾病共同靶點獲取

利用疾病數(shù)據(jù)庫 Genecards 、DisGeNET 和 CTD，以“Cerebral ischemia”為檢索詞條，對腦缺血的靶點進行檢索收集，獲取腦缺血相關(guān)作用靶點.將 1.1 項獲得的脈絡(luò)寧活性成分靶點與腦缺血疾病靶點導(dǎo)入 Venny 2.1 在線工具繪制 Venny 圖，獲得脈絡(luò)寧-腦缺血共同靶點.

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化

將脈絡(luò)寧-腦缺血共同靶點導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫進行分析，設(shè)置條件：物種=Homo sapiens，最低相互作用閾值=medium confidence(0.4)，[8]獲得蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，利用Cytoscape 3.9.0 軟件中的插件 CytoNCA 進行關(guān)鍵靶點的篩選.

1.4 GO 生物功能和 KEGG 通路富集分析

基于 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行基因本體(Gene Ontology，簡稱GO)功能注釋和通路富集(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，簡稱KEGG)分析.[9]最后，將分析得到的靶點、信號通路相對應(yīng)，運用Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)模型.

1.5 “活性成分-靶點”分子對接驗證

根據(jù) KEGG 通路富集結(jié)果，利用autodock vina將相關(guān)通路涉及靶點與脈絡(luò)寧活性成分進行分子對接.Vina半柔性分子對接后的結(jié)合能越低，表明活性成分與靶點存在相互作用的可能性越大.當(dāng)結(jié)合能小于-5.0 kcal·mol-1時，表明脈絡(luò)寧潛在活性分子與核心靶點結(jié)合得比較好；當(dāng)結(jié)合能小于-7.0 kcal·mol-1時，表明脈絡(luò)寧潛在活性分子與核心靶點之間的結(jié)合極為強烈.[10]

1.6 脈絡(luò)寧防治腦缺血體外實驗驗證

1.6.1 細胞

PC12細胞株由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供.

1.6.2 藥物與試劑

脈絡(luò)寧注射液(南京金陵制藥廠，批號：20210412);依達拉奉(MCE，批號：34266);MTT(Sigma-Aldrich，批號：EZ7890B255);線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天，批號：032421211103);RT-PCR反應(yīng)試劑盒引物購自上海生物工程公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TaKaRa 公司，批號：AK3017).

1.6.3 PC12細胞氧糖剝奪模型(OGD)的建立

通過OGD方法模擬腦缺血神經(jīng)細胞損傷模型.培養(yǎng)至對數(shù)培養(yǎng)期的PC12細胞，再在37℃下全部換成無糖Earle's 緩沖液，最后通95%N2+5%CO2的混合氣6 h后取出缺氧盒進行后續(xù)實驗.

1.6.4 MTT檢測

按MTT實驗檢測相關(guān)步驟操作.脈絡(luò)寧預(yù)保護48 h，OGD后每孔加 MTT(5 mg/m1)20 μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上層清液，每孔加入 DMSO 150 μl，以空白對照調(diào)零，用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處各孔 OD 值.計算細胞的存活率.

1.6.5 線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期的PC12細胞，以每孔 1×105個細胞密度接種于24孔板，脈絡(luò)寧組干預(yù)48 h，依達拉奉組干預(yù)24 h，吸出每孔培養(yǎng)液，用JC-1孵育30 min后在熒光顯微鏡下檢測.

1.6.6 qRT-PCR 檢測靶基因

TaKaRa 試劑盒提取總 RNA.使用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈RT-PCR反應(yīng)試劑盒，將 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并對Real-time PCR 進行擴增.反應(yīng)條件：94°C 預(yù)變性 5 min，94°C 變性 30 s，60°C 退火 45 s，72°C 延伸 30 s，35 個循環(huán)后在72°C下延伸 7 min.最后用熒光定量 PCR 儀檢測常規(guī)溶解曲線，分析測定Ct值，以 2-ΔΔCt的計算值作為相對表達水平.

1.6.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 9 統(tǒng)計學(xué)軟件分析，定量資料以χ±s表示，同時采用單因素方差分析、多重比較法進行分析.以P值表示：P<0.05 表示有顯著性差異，P<0.01 表示有極顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 脈絡(luò)寧活性成分篩選及靶點預(yù)測結(jié)果

通過檢索各文獻數(shù)據(jù)庫并采用Swiss ADME平臺預(yù)測和Swiss Target Prediction對各個成分進行靶點預(yù)測，共獲得存在靶點的脈絡(luò)寧活性成分58個(見表1)，共獲得活性成分的靶點1 051個，刪除重復(fù)靶點后最終獲得317個靶點.

表1 脈絡(luò)寧活性成分

2.2 脈絡(luò)寧活性成分治療腦缺血靶點篩選

通過Genecards和CTD對腦缺血治療靶點進行檢索，篩選整理后共獲得腦缺血治療相關(guān)靶點276個，將腦缺血與脈絡(luò)寧活性成分的靶點輸入 Venny 2.1.0 軟件，繪制韋恩圖，取其交集后獲得脈絡(luò)寧-腦缺血共同靶點84個，見圖1.

圖1 脈絡(luò)寧活性成分——腦缺血交集基因韋恩圖

2.3 脈絡(luò)寧活性成分——腦缺血靶點網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)2.2項分析得到的潛在作用靶點及靶點與活性成分之間的關(guān)系，應(yīng)用cytoscape軟件構(gòu)建脈絡(luò)寧活性成分——抗腦缺血靶點網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2A).該網(wǎng)絡(luò)中包含115個節(jié)點及215條邊，其中31個節(jié)點表示脈絡(luò)寧活性成分(不同形狀代表來自不同藥物)，84個長方形節(jié)點表示腦缺血靶點，203條邊代表脈絡(luò)寧活性成分與腦缺血靶點間的相互作用.各活性成分按度值大小進行排序，選取排名靠前的5個活性成分并篩選相對應(yīng)的靶點構(gòu)建脈絡(luò)寧活性成分——腦缺血靶點網(wǎng)絡(luò)的核心網(wǎng)絡(luò)(見圖2 B)，該網(wǎng)絡(luò)中包含73個節(jié)點和133條邊，其中活性成分節(jié)點5個，靶點節(jié)點128個.核心網(wǎng)絡(luò)包含的活性成分分別為槲皮素、蘆丁、山奈酚、漢黃芩素、β胡蘿卜素，表明這五種成分是脈絡(luò)寧治療腦缺血時發(fā)揮作用的關(guān)鍵性成分.

圖2 脈絡(luò)寧活性成分——腦缺血靶點網(wǎng)絡(luò)圖

注：六邊形為石斛成分；箭頭為金銀花成分；圓形為牛膝成分；菱形為玄參成分；三角形為共同成分；長方形為腦缺血靶點

2.4 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

將脈絡(luò)寧活性成分治療腦缺血的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING平臺，應(yīng)用Cytoscape軟件繪制成一個包含84個節(jié)點和1547條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，獲得蛋白相互作用的關(guān)系.將結(jié)果進一步導(dǎo)入Cytoscape 3.7.3軟件進行拓撲分析，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3).最終得到PPI核心網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的蛋白，分別為ALB、AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、JUN、PTGS2、MMP9，這些靶點與其他靶點關(guān)聯(lián)密切，可能在治療腦缺血的過程中占據(jù)重要地位.

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析圖

2.5 GO分類與KEGG富集分析結(jié)果

GO和KEGG分析的主要區(qū)別在于它們所依據(jù)的數(shù)據(jù)不同.GO分析是基于序列信息，而KEGG分析則是通過對基因的表達信息進行分析來確定基因的功能的.本文利用 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行生物富集分析，得到具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的 GO 功能富集條目 602 條，其中生物過程(biological process，BP)466 條，分子功能(molecular function，MF)74 條，細胞組分(cellular component，CC)62 條.對 GO 富集條目按照P進行排序，P越小表示富集程度越高，分別選取 BP、CC 和 MF 中排名前 10 的條目繪制圖形，如圖 4.GO分類富集結(jié)果表明，脈絡(luò)寧活性成分是通過多種生物學(xué)過程的作用來治療腦缺血的.

KEGG 通路富集結(jié)果顯示，共涉及 140 條通路，將P排序前20名的繪制成KEGG 通路氣泡圖，由圖 5可知，脈絡(luò)寧活性成分對腦缺血的防治主要分布在TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、松弛素信號通路等，表明脈絡(luò)寧活性成分可通過多條信號通路發(fā)揮治療腦缺血的作用.

圖5 脈絡(luò)寧活性成分治療腦缺血的相關(guān)通路KEGG富集結(jié)果

2.6 靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)模型

將排名前20的KEGG信號通路及相對應(yīng)的靶點導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.0 軟件中構(gòu)建腦缺血靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)(見圖6)，該網(wǎng)絡(luò)中共包含35個節(jié)點和145條邊，其中三角形為信號通路節(jié)點，長方形為靶點節(jié)點.結(jié)果顯示，脈絡(luò)寧活性成分是通過多靶點、多途徑的共同作用下治療腦缺血的.該網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點為RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb，CASP8、JUN等，分別調(diào)控了多條信號通路，表明該8個靶點在脈絡(luò)寧活性成分治療腦缺血的過程中起到了重要的作用.

圖6 脈絡(luò)寧活性成分治療腦缺血靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)模型注：三角形為信號通路節(jié)點，長方形為靶點節(jié)點

2.7 分子對接驗證結(jié)果

由2.4項可知，PPI核心網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白為ALB、AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、JUN、PTGS2、MMP9，靶點-信號通路中的核心基因為RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb、CASP8、JUN，結(jié)合2.3項中獲得的關(guān)鍵活性成分，利用autodock vina對上述基因與可作用于這些基因的活性成分進行半柔性分子對接.

表2顯示，活性成分與其對應(yīng)的靶點分子對接的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，表明活性成分與靶點具有較好的結(jié)合活性.選取結(jié)合能最高(MOL000173與JUN)和最低(MOL000006與PTGS2)的進行對接，結(jié)果見圖7.

表2 分子對接驗證結(jié)果

圖7 結(jié)合能最高和最低的分子對接結(jié)果圖

2.8 體外實驗驗證

2.8.1 脈絡(luò)寧對PC12細胞存活率的影響

與 control 組相比，OGD 損傷組的神經(jīng)元吸光度明顯下降，細胞存活率降低(P<0.05)；與 OGD 組相比，PC12細胞經(jīng)濃度為0.2 μmol/L、0.02 μmol/L 的脈絡(luò)寧干預(yù)后，吸光度明顯增加，說明脈絡(luò)寧能顯著改善經(jīng)OGD后PC12細胞的存活率，并呈濃度依賴性，對PC12細胞有保護作用，如表3、圖8所示.

表3 脈絡(luò)寧對PC12細胞存活率的影響(χ±s,n=9)

圖8 脈絡(luò)寧對 OGD 損傷后PC12細胞存活率的影響(χ±s，n=9)

2.8.2 脈絡(luò)寧對OGD誘導(dǎo)的PC12細胞線粒體膜電位水平的影響

與假手術(shù)組相比，OGD組細胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)；與OGD組相比，脈絡(luò)寧0.2 μmol/L、0.02 μmol/L劑量組和依達拉奉0.1 μmol/L細胞線粒體膜電位均顯著增加 (P<0.05，P<0.01)(見表4，圖 9).

表4 脈絡(luò)寧對OGD誘導(dǎo)PC12 細胞線粒體膜電位的影響(ˉχ±s,n=3)

圖9 脈絡(luò)寧對OGD誘導(dǎo)的PC12 細胞線粒體膜電位的影響

2.8.3脈絡(luò)寧關(guān)鍵靶點基因變化對OGD誘導(dǎo)PC12細胞的影響

RT-PCR 結(jié)果顯示，與control 組相比，OGD組的Caspase3、Caspase8、RelA、NFκb、MAPK1、MAPK8、Jun mRNA 表達顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，而 AKT1 mRNA 水平則下調(diào)(P<0.01)；與OGD組比較，脈絡(luò)寧組與依達拉奉組的Caspase3、Caspase8、RelA、NFκb、MAPK1、MAPK8、Jun mRNA 表達顯著下調(diào)(P<0.05，P<0.01)，而AKT1 mRNA 表達上調(diào)(P< 0.01)，見表5.

表 5 脈絡(luò)寧對OGD誘導(dǎo)PC12細胞關(guān)鍵靶點基因mRNA 表達的影響(χ ±s,n=3)

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，搜集脈絡(luò)寧注射液中中藥成分共含58種，對應(yīng)276個靶點，與腦缺血交集的靶點84個，核心靶點8個，分別為RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb、CASP8、JUN.核心靶點的 GO 富集分析結(jié)果表明，脈絡(luò)寧注射液抗腦缺血主要在細胞因子介導(dǎo)的信號通路、對脂多糖的反應(yīng)、基因表達的正向調(diào)節(jié)、細胞凋亡過程的負向調(diào)節(jié)、細胞對鎘離子的反應(yīng)等；細胞組分主要涉及細胞外空隙、胞外區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、膜筏等；分子功能主要涉及酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合等.KEGG 富集分析前 20 項結(jié)果并結(jié)合現(xiàn)有研究報道顯示：TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、松弛素信號通路等都與腦缺血相關(guān).[11-14]由此可見，脈絡(luò)寧注射液可能通過上述多個生物過程、靶點和通路共同參與抗腦缺血，其機制主要涉及抗炎、保護線粒體功能及改善血流動力學(xué)相關(guān)的信號通路.

為驗證脈絡(luò)寧通過保護線粒體活性抗腦缺血的有效性，本研究通過OGD構(gòu)建體外腦缺血模型進行實驗驗證.依達拉奉是一種自由基清除劑，被廣泛應(yīng)用于腦血管病的治療，[15]故本研究使用依達拉奉作為陽性對照藥物進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)寧的PC12細胞OGD損傷明顯下降，說明可明顯改善因OGD誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降，表明脈絡(luò)寧的抗腦缺血作用與保護線粒體活性相關(guān).

為進一步探討脈絡(luò)寧抗腦缺血可能的機制，本研究對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的8個關(guān)鍵靶基因RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb、CASP8、JUN進行驗證.RelA是NFκB通路的主要功能亞基，翻譯后修飾能有效調(diào)控NFκB的轉(zhuǎn)錄激活，進而在炎癥反應(yīng)及腦缺血的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用.[16]近年來，許多研究證明MAPK8信號通路與腦缺血損傷后的神經(jīng)細胞凋亡有密切關(guān)系.[17-19]JUN屬于核轉(zhuǎn)錄基因，腦缺血時被激活，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄，進而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，[20]這與本研究RT-PCR結(jié)果趨勢相同.大量證據(jù)表明，腦缺血后導(dǎo)致的線粒體功能障礙最終可引起細胞自噬或凋亡，[21-23]腦缺血時，PI3K/Akt磷酸化水平顯著降低，Caspase3、Caspase8表達增加，通過級聯(lián)反應(yīng)引起線粒體途徑的細胞凋亡.[24-26]研究還發(fā)現(xiàn)，AKT1在急性中風(fēng)病、阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，可通過線粒體途徑抗凋亡機制保護神經(jīng)元，對神經(jīng)元存活起促進作用.[27]本研究中，經(jīng)OGD后，脈絡(luò)寧可顯著上調(diào)AKT1 mRNA，下調(diào)Caspase3、Caspase8、mRNA.進一步證實了脈絡(luò)寧可通過線粒體途徑抗腦缺血損傷.結(jié)合關(guān)鍵靶基因的相關(guān)研究報道和本實驗結(jié)果，脈絡(luò)寧治療腦缺血可能與通過PI3K/Akt信號通路抑制炎癥反應(yīng)、進而抑制線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)，這為進一步研究其作用機制提供了參考.