沒食子軟膏對二硝基氯苯致大鼠濕疹的保護作用及機制研究

馬 璇 郝 夢 張明惠 秦華夏 楊青青 李柯翱 聶繼紅

(1 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊,830054; 2 新奇康藥業(yè)股份有限公司,烏魯木齊,830011; 3 新疆奇沐醫(yī)藥研究院(有限公司),烏魯木齊,830011; 4 新疆中藥(民族藥)制藥共性關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室,烏魯木齊,830011; 5 新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,烏魯木齊,830099; 6 新疆中藥炮制研究重點實驗室,烏魯木齊,830099)

濕疹是一種具有滲出傾向的伴有嚴重炎癥反應(yīng)的皮膚疾病,其典型特征為持續(xù)性瘙癢、紅腫、糜爛伴有滲出物以及干燥脫屑等[1-3]。西醫(yī)認為濕疹主要的發(fā)病機制是免疫系統(tǒng)功能異常,臨床上多以激素類藥物及抗組胺藥物進行治療,雖具有一定療效但存在易復(fù)發(fā)、難根治、不良反應(yīng)多等問題[4-5]。中醫(yī)將濕疹歸為濕瘡范疇,認為臟腑功能失調(diào)兼風(fēng)濕熱燥邪為其主要病機,臨床上多用清熱解毒燥濕類藥物治療,具有療效顯著、復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)少等特點[6-8]。維醫(yī)將濕疹稱為“苦巴依如塔甫”,以調(diào)節(jié)氣質(zhì)、清血、消炎、止癢為主要治療原則。沒食子軟膏是一種特色維藥,由沒食子和紫草等組成,來源于新疆喀什地區(qū)大夫的臨床經(jīng)驗方。該方具有清熱解毒、燥濕收斂、清瀉局部異常黏液質(zhì)的功效。在長期的臨床運用中,顯示了較好的治療濕疹的作用,故在特色民族藥開發(fā)的過程中將其開發(fā)為方便攜帶且用藥依從性較強的軟膏劑。但目前沒食子軟膏治療濕疹的作用機制尚不清楚。本研究通過沒食子軟膏治療大鼠濕疹的作用研究,探索其可能的作用機制,為臨床治療濕疹提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠60只,雌雄各半,5～7周齡,體質(zhì)量180～220 g。由新疆醫(yī)科大學(xué)提供,動物合格證號:SCXK(新)2018-0002。于SPF級實驗動物房中飼養(yǎng),溫度20～26 ℃,濕度40%～70%,明暗周期各12 h,自由獲取水及飼料。所有動物實驗均經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥物安全性評價中心實驗動物福利倫理委員會審核批準(倫理審批號:nGLP-2020002)。

1.1.2 藥物 復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司,批號:20201024X);低(0.035 g/g)、中(0.07 g/g)、高(0.14 g/g)濃度的沒食子軟膏(新奇康藥業(yè)股份有限公司,批號:10126);二硝基氯苯(上海九鼎化學(xué)科技有限公司,批號:97-00-7)。

1.1.3 試劑與儀器 血液學(xué)檢測試劑(深圳邁瑞科技有限公司,批號:06/2020);兔二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司,批號:PV-6001);抗體:白細胞介素-4受體α(上海撫生實業(yè)有限公司,貨號:FS0218);p-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6、JAK1、白細胞介素-5(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號:bs-1439R/bs-1791/Rbs-1318R);SYBRGreen PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司,貨號:AQ601-01);逆轉(zhuǎn)錄酶(賽默飛世爾科技公司,美國,貨號:K1622);梯度PCR儀(伯樂中國有限公司,型號:T100);熒光定量PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司,型號:Q2000B);光學(xué)顯微鏡(leica Microsystems Ltd,德國,型號:DM4000)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按隨機數(shù)字表法將大鼠分成6組:正常組、模型組、陽性組(地塞米松)、沒食子軟膏低劑量組、沒食子軟膏中劑量組、沒食子軟膏高劑量組,每組10只,雌雄各半。除正常組大鼠外,剩余大鼠均使用7%二硝基氯苯丙酮溶液涂擦背部,建立大鼠濕疹模型。采用電動剃毛器去除動物頸背部(A:2 cm×2 cm)、背部(B:4 cm×4 cm)處毛發(fā)。用移液槍將7%二硝基氯苯丙酮溶液100 μL涂于大鼠A處皮膚致敏,可見大鼠瘙癢劇烈,頻繁出現(xiàn)搔抓、打滾行為,持續(xù)約2 h。7 d周后B處再次剃毛,涂擦7%二硝基氯苯丙酮溶液200 μL進行第1次激發(fā),5 d激發(fā)1次,共激發(fā)6次[9]。

1.2.2 給藥方法 預(yù)實驗摸索最大給藥量,以藥膏能滲透紗布但又未被擠出定為最大涂抹量,最終將0.30 g/只定為各給藥組的給藥量。除正常組與模型組大鼠在裸露皮膚處涂抹適量生理鹽水外,其余各給藥組均勻涂抹相應(yīng)藥物,用醫(yī)用2～3層紗布包扎,給予無刺激性膠布固定,約4 h后揭去紗布,以溫?zé)釢崈舻乃料锤蓛?連續(xù)給藥14 d。末次給藥后24 h后,麻醉后腹主動脈取血,置于抗凝血采血管中,用于當(dāng)日測定血液學(xué)。剝離造模區(qū)病灶皮膚,去除多余組織,部分置于4%多聚甲醛溶液中,過夜固定,備用;部分置于-80 ℃冰箱凍存,備用。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 組織病理學(xué)觀察 取固定好的皮膚組織按常規(guī)進行脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色、封片等,鏡檢病理組織變化并攝片。

1.2.3.2 血液學(xué)測定 根據(jù)實際說明對血液樣本進行白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比、單核細胞百分比、嗜酸性粒細胞百分比的測定。

1.2.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測皮膚組織中白細胞介素-4Rα、白細胞介素-5、JAK1、p-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6蛋白表達水平 取固定好的組織按常規(guī)制備組織蠟塊、切片、烤片、復(fù)水、去除內(nèi)源性酶、修復(fù)抗原、封閉、一抗及二抗孵育,顯色、蘇木精染色、脫水、封片、固片、拍片。隨機選取每張切片3個不同的視野放大200倍,觀察拍照。

1.2.3.4 熒光定量PCR檢測皮膚組織中磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B基因表達水平 Trizol法提取RNA,測定純度,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取PCR上游引物和下游引物各2 μL(表1),根據(jù)試劑盒說明書配置成2 μL的PCR體系,按照如下反應(yīng)程序進行:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火35 s,45個循環(huán)后進行檢測。采用2-△△Ct法分析目的基因在各組之間的表達差異。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮膚組織病理改變 正常組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)清晰、完整,真皮層無水腫、無炎癥細胞浸潤。模型組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)模糊,表皮可見肥厚且過度角化,真皮層可見水腫以及大量炎癥細胞浸潤。給藥14 d后,與模型組比較,各給藥組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)較清晰,表皮肥厚、角化以及真皮層水腫、炎癥細胞浸潤程度明顯降低。見圖1。

圖1 各組大鼠皮膚組織病理學(xué)比較(HE染色,×100)

2.2 各組大鼠血液學(xué)指標比較 與正常組比較,模型組大鼠的單核細胞百分比、嗜酸性粒細胞百分比顯著升高(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,沒食子軟膏低劑量組、沒食子軟膏高劑量組大鼠的單核細胞百分比顯著降低(P<0.05,P<0.01),沒食子軟膏中劑量組、沒食子軟膏高劑量組大鼠的嗜酸性粒細胞百分比顯著降低(P<0.01,P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血液學(xué)指標比較

2.3 各組大鼠皮膚組織白細胞介素-4受體α、白細胞介素-5、JAK1、p-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6蛋白表達水平 與正常組比較,模型組大鼠皮膚組織白細胞介素-4受體α、白細胞介素-5、JAK1、p-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6表達量明顯增高(P<0.001);與模型組比較,陽性組、沒食子軟膏低劑量組、沒食子軟膏中劑量組大鼠皮膚組織白細胞介素-4受體α蛋白表達量明顯減少(P<0.001,P<0.05,P<0.001);陽性組、沒食子軟膏低劑量組、沒食子軟膏中劑量組、沒食子軟膏高劑量組大鼠皮膚組織白細胞介素-5蛋白表達量明顯減少(P<0.001,P<0.01,P<0.001,P<0.001);各給藥組大鼠皮膚組織JAK1、p-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6表達量明顯下降(P<0.001)。見圖2～3。

圖2 各組大鼠皮膚組織白細胞介素-4受體α、白細胞介素-5、JAK1、p-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6蛋白表達情況(免疫組織化學(xué)染色,×200)

圖3 各組大鼠皮膚組織蛋白表達情況注:A.白細胞介素-4受體α;B.白細胞介素-5;C. JAK1、D. p-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6。與正常組比較,***P<0.001;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001

2.4 各組大鼠皮膚組織磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B基因表達水平 與正常組比較,模型組大鼠皮膚組織磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B表達量明顯增高(P<0.000 1,P<0.001);與模型組比較,陽性組、沒食子軟膏各劑量組大鼠皮膚組織中磷脂酰肌醇3激酶含量均顯著降低(P<0.000 1),沒食子軟膏各劑量組大鼠皮膚組織中蛋白激酶B含量均顯著降低(P<0.001)。見圖4。

圖4 各組大鼠皮膚組織蛋白表達情況注:A.磷脂酰肌醇3激酶基因;B.蛋白激酶B基因。與正常組比較,***P<0.001,****P<0.000 1;與模型組比較,△△△P<0.001,△△△△P<0.000 1

3 討論

濕疹作為一種較為復(fù)雜的皮膚疾病,其發(fā)病機制目前尚未完全清楚。有研究表明皮膚屏障損壞為濕疹重要的發(fā)病原因之一。當(dāng)皮膚屏障的功能與結(jié)構(gòu)出現(xiàn)缺陷時,外界的抗原及病原體則會侵入皮膚組織,誘導(dǎo)促進皮膚發(fā)生免疫炎癥反應(yīng),加快濕疹的發(fā)展[9-10]。另有研究指出濕疹是一種自身免疫性疾病,Th2細胞優(yōu)勢應(yīng)答在濕疹發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后的過程中具有重要作用。皮膚病理損傷部位分泌多種炎癥介質(zhì),從而刺激分泌白細胞介素-4、白細胞介素-5等多種Th2細胞因子,進而反饋性誘導(dǎo)Th2細胞免疫過度激活,擴大免疫炎癥反應(yīng),誘發(fā)并且促進一系列濕疹的病理表現(xiàn)[11-13]。

有臨床研究顯示,濕疹患者的嗜酸性粒細胞百分比、白細胞介素-5均高于正常人。濕疹患者發(fā)病時,活化的肥大細胞可以產(chǎn)生白細胞介素-5,從而能誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞的活化、增殖、分化以及成熟,誘導(dǎo)肥大細胞釋放組胺等,介導(dǎo)嗜酸性粒細胞和角質(zhì)形成細胞的破壞[14]。因此,嗜酸性粒細胞在濕疹的免疫機制中起重要作用。本研究顯示,二硝基氯苯致濕疹模型大鼠血液學(xué)嗜酸性粒細胞百分比顯著升高,沒食子軟膏中劑量組、沒食子軟膏高劑量組均可明顯降低濕疹大鼠血液學(xué)嗜酸性粒細胞百分比。陽性組也可明顯降低濕疹大鼠血液學(xué)嗜酸性粒細胞百分比,但陽性組嗜酸性粒細胞百分比下降大大低于正常值,淋巴細胞百分比、單核細胞百分比也明顯降低。這可能與腎上腺皮質(zhì)激素類藥抑制細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),延遲性的過敏反應(yīng),減少淋巴細胞、單核粒細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目等藥理作用相關(guān)。皮膚組織局部病理情況是判定給藥后藥物是否起到治療作用的可靠指標。本研究結(jié)果表明,沒食子軟膏可以顯著改善濕疹大鼠皮膚組織的水腫、炎癥浸潤等病理情況,起到良好的改善大鼠濕疹的作用。濕疹患者的白細胞介素-4、白細胞介素-5高表達,白細胞介素-4、白細胞介素-5作為Th2細胞反應(yīng)的關(guān)鍵分化因子,能夠驅(qū)動T細胞分化為Th2細胞并誘導(dǎo)2型相關(guān)細胞因子和趨化因子產(chǎn)生[15-16]。白細胞介素-4轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有嚴重的濕疹樣皮損表現(xiàn)[17]。白細胞介素-5拮抗劑單克隆體則被用于治療特應(yīng)性皮炎[18]。本研究顯示,濕疹模型大鼠病灶皮膚組織部位的白細胞介素-4受體α、白細胞介素-5表達顯著上升,給藥后,白細胞介素-4受體α、白細胞介素-5表達量則被顯著抑制。

角質(zhì)形成細胞為角質(zhì)屏障的主要細胞,其正常增殖分化維持了角質(zhì)屏障的結(jié)構(gòu)與功能[19-20]。IL-4R/JAK1/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在角質(zhì)形成細胞上高度活化,參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的增殖分化[17]。濕疹皮膚病理損傷處白細胞介素-4等細胞因子高表達,其白細胞介素-4受體的表達進而被上調(diào),二者結(jié)合后活化JAK1/JAK3,促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6磷酸化,誘導(dǎo)下游Th2炎癥介質(zhì)增多,致使Th1/Th2失衡,擴大免疫炎癥反應(yīng),調(diào)控表皮分化相關(guān)蛋白表達,破壞角質(zhì)屏障的穩(wěn)態(tài)環(huán)境,促進濕疹的發(fā)生發(fā)展[18-19]。PI3K/AKT通路參與細胞的增殖、分化和凋亡的過程。磷脂酰肌醇3激酶可以調(diào)控多種炎癥介質(zhì),磷脂酰肌醇3激酶-γ對胰蛋白酶誘導(dǎo)所致的小鼠瘙癢、炎癥等反應(yīng)具有調(diào)控作用。濕疹患者體內(nèi)的肥大細胞數(shù)量與濕疹皮膚皮炎的臨床嚴重程度正相關(guān),被激活的肥大細胞發(fā)生脫顆粒,釋放出顆粒和炎癥介質(zhì)等內(nèi)容物,從而引起皮損部位的發(fā)熱、炎癥以及瘙癢,而PI3K/AKT/mTOR信號通路可以參與肥大細胞的脫顆粒過程[20-21]。同時PI3K/AKT信號通路與JAK/STAT信號通路之間也存在密切關(guān)聯(lián),JAK/STAT信號通路在PI3K/AKT信號通路的上游,當(dāng)JAK/STAT信號通路被激活時,PI3K/AKT信號通路也會被進一步激活。

綜上所述,沒食子軟膏可以顯著降低濕疹大鼠血液中嗜酸性粒細胞百分比、皮膚組織病理損傷的水平,改善大鼠濕疹病癥,其機制可能與降低白細胞介素-4受體α、白細胞介素-5表達水平,影響JAK1/STAT6/PI3K/AKT信號通路的激活,降低機體免疫炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)皮膚表皮、角質(zhì)等細胞的增殖、凋亡等過程,促進角質(zhì)屏障回歸穩(wěn)定有關(guān)。

利益沖突聲明:無。