不同添加劑處理筍殼對(duì)其發(fā)酵品質(zhì)及湖羊瘤胃微生物的影響

覃娟清，黨浩千，金華云，郭宇康，張富，劉慶華

（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建 福州 350002）

我國(guó)竹子種類(lèi)達(dá)500 多種，位居世界之首；竹林面積占600 萬(wàn)～700 萬(wàn)hm2［1-2］。筍殼是竹筍（Bambuseaespp.）加工過(guò)程中產(chǎn)生的主要廢棄物，筍殼年產(chǎn)量超3000 萬(wàn)t，其利用率極低［3-4］。筍殼一般指竹筍的鞘和基部區(qū)域，占竹筍的70%，具有豐富的木質(zhì)纖維、粗蛋白和易酵解的膳食纖維［5-6］。筍殼易被反芻動(dòng)物消化，總可消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)高達(dá)68.5%［7］。筍殼高溫處理發(fā)酵后，可提升蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分含量，是優(yōu)良的反芻動(dòng)物粗飼料來(lái)源［8］。因此，合理開(kāi)發(fā)利用筍殼，不僅能變廢為寶，還可以緩解飼料資源短缺，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

至今，在飼料開(kāi)發(fā)方面，主要采用干燥、青貯和微貯對(duì)筍殼進(jìn)行加工處理，從而實(shí)現(xiàn)飼料化利用［9-10］。青貯是通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸，使飼料得以長(zhǎng)期保存。不同類(lèi)型的青貯添加劑對(duì)青貯品質(zhì)改善作用不同，常見(jiàn)的發(fā)酵青貯添加劑有酶類(lèi)、有機(jī)鹽類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和益生菌復(fù)合制劑等［11-13］。甲酸是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、用途廣泛的復(fù)合有機(jī)酸，可抑制有害菌，降低pH 值，提升有氧穩(wěn)定性，常與其他酶制劑等混合青貯，改善飼料發(fā)酵品質(zhì)［14］。在青貯飼料過(guò)程中添加外源性纖維素酶能降低pH 值、氨態(tài)氮含量，與乳酸菌聯(lián)合使用，可顯著降低酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量，并能提高青貯品質(zhì)，抑制有害菌生長(zhǎng)［15］。EM（effective microorganisms）菌是一種以光合細(xì)菌群、酵母菌群等為主的有益微生物群，其能夠?qū)怪虏【海纳葡到y(tǒng)微生物平衡及肉質(zhì)［16-17］。研究表明，在青貯筍殼發(fā)酵過(guò)程中，適當(dāng)添加乳酸菌、玉米粉等可不同程度地提升筍殼發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［18-19］。目前，單一青貯筍殼的研究甚多，不同添加劑處理筍殼對(duì)其發(fā)酵品質(zhì)及肉羊瘤胃微生物的影響研究較少，降低了筍殼在生產(chǎn)中的有效利用率。因此，本試驗(yàn)以當(dāng)季新鮮的馬蹄筍（Bambusa oldhami）筍殼為材料，并以斷奶期湖羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，研究分析不同添加劑小罐青貯筍殼對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)的影響，隨之開(kāi)展青貯筍殼飼喂湖羊試驗(yàn)，探究青貯筍殼營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及其在湖羊上的飼用效果，為優(yōu)化筍殼的加工方式及其在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 筍殼青貯試驗(yàn)

1.1.1 試驗(yàn)材料 2021 年2 月于寧德市龍林牧業(yè)有限公司選取新鮮馬蹄筍殼進(jìn)行本試驗(yàn)。甲酸（85%）和纖維素酶（1.0×104U·g-1）150 g 均為分析純，購(gòu)自福州佰泉生物技術(shù)有限公司。在河南農(nóng)富康生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)EM 菌300 mg（10 g·瓶-1，其主要成分為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、糞腸球菌等多種微生物組群及生物酶，復(fù)合菌劑活菌總數(shù)≥1×1010CFU·g-1）。在市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)拉伸筋膜。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)分為8 組，分別是甲酸組（formic acid， FA）（10 mL·kg-1）、 EM 菌組（effective microorganisms， EM）（20 mg·kg-1）、纖維素酶組（cellulase enzyme， CE）（150 mg·kg-1）、甲酸+EM 菌組（formic acid+effective microorganisms， FM）（10 mL·kg-1+20 mg·kg-1）、甲酸+纖維素酶組（formic acid+cellulase enzyme， FC）（10 mL·kg-1+150 mg·kg-1）、纖維素酶組+EM 菌組（cellulase enzyme+effective microorganisms， CM）（20 mg·kg-1+150 mg·kg-1）、甲酸+纖維素酶組+EM 菌組（formic acid+cellulase enzyme+effective microorganisms， FCM）（10 mL·kg-1+20 mg·kg-1+150 mg·kg-1），對(duì)照組（control group， CK）不添加青貯劑。每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)發(fā)酵罐中裝2.5 kg 筍殼。

2021 年2 月采集新鮮筍殼，將其除去泥土后用粉碎機(jī)（26 型，浙江）粉碎至約3 cm，各處理組定量噴灑添加劑。發(fā)酵前，活化菌劑，即按1 kg 溫水+0.5 kg 白糖+10 g 菌劑的劑量活化24 h，隨后根據(jù)所需添加量稀釋原液。每個(gè)發(fā)酵罐裝填2.5 kg 筍殼，充分混勻青貯劑與筍殼，之后層層緊密壓入塑料發(fā)酵罐中，常溫儲(chǔ)存于無(wú)強(qiáng)光照處，厭氧發(fā)酵80 d 后開(kāi)封取樣測(cè)定分析，進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。

1.1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法 80 d 后，根據(jù)劉建新等［20］所示方法對(duì)各組青貯品質(zhì)進(jìn)行評(píng)定（表1）。

表1 青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Quality evaluation standard of silage

常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定：用常規(guī)方法［21］測(cè)定樣品粗蛋白（crude protein， CP）含量，用Van Soest［22］所示方法測(cè)定酸性洗滌纖維（acid detergent fiber， ADF）和中性洗滌纖維（neutral detergent fiber， NDF）含量；ADF-NDF=半纖維素（hemicellulose， HC）含量；原料經(jīng)105 ℃烘干至恒重后，即為干物質(zhì)（dry matter， DM）含量。

發(fā)酵參數(shù)測(cè)定：發(fā)酵參數(shù)主要測(cè)定pH、乳酸（lactic acid， LA）、總氮（total nitrogen， TN）、氨態(tài)氮（ammoniacal nitrogen， AN）。用pH 測(cè)定儀（pHS-3D 型，上海）測(cè)定pH 值；采用高效液相色譜儀（LC-20AT 型，日本島津）測(cè)定乳酸含量［23］；采用凱氏定氮法［24］測(cè)定總氮含量；采用苯酚-次氯酸鈉比色法［25］測(cè)定氨態(tài)氮含量。

1.2 湖羊飼養(yǎng)試驗(yàn)

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧配方 2021 年7-9 月在寧德市古田縣黃田鎮(zhèn)龍林牧業(yè)有限公司羊場(chǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，選取3月齡［初始體重（16.68±1.05） kg］健康公湖羊30 只，采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)羊隨機(jī)分為3 組（CK、FM和FCM 組），每組10 只。CK、FM 和FCM 組分別飼喂基礎(chǔ)日糧、甲酸+EM 菌和甲酸+EM 菌+纖維素酶，試驗(yàn)期間飼糧按照黨浩千等［26］所示基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平表進(jìn)行配制。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)欄舍、器具清潔并消毒，統(tǒng)一對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行編號(hào)和驅(qū)蟲(chóng)。預(yù)飼期7 d，正飼期60 d。采取全舍飼由專(zhuān)人飼養(yǎng)，每天飼喂兩次（8：00 和16：00），每次投喂日飼喂量的1/2，定時(shí)清理消毒羊舍，自由飲水。

1.2.3 樣品采集與保存 用瘤胃管采集瘤胃液，后用4 層紗布進(jìn)行過(guò)濾，隨之分裝于15 mL 凍存管中；之后清空瘤胃，剪取約2 cm2厚的瘤胃背囊部組織（2 片），用生理鹽水沖洗干凈存放于15 mL 平底試管中，并于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)與方法 瘤胃乳頭長(zhǎng)度和肌層厚度：4%多聚甲醛固定，按照“修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片”的順序制作石蠟切片，最后鏡檢篩選出合格的樣片。用正置白光拍照顯微鏡（Eclipse Ci-L， Nikon， 日本）觀察并測(cè)量瘤胃乳頭長(zhǎng)度和瘤胃肌層厚度。

瘤胃微生物的測(cè)定：解凍瘤胃液樣品，根據(jù)十六烷基溴化銨裂解緩沖液法（cetyl trimethyl ammonium bromid，CTAB）［27］提取瘤胃液DNA，按照基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行提取，之后在1%瓊脂糖凝膠上依次進(jìn)行濃縮與純化。使用引物序列（5′-3′）為341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGACTACNNGGGTA TCTAAT，使用Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和高效高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)目的條帶使用膠回收試劑盒（購(gòu)自Qiagen 公司）回收產(chǎn)物。再使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 和q-PCR 定量，文庫(kù)合格后，使用Illumina NovaSeq PE 250 平臺(tái)（美麗莎生物科技有限公司，上海）進(jìn)行16S rRNA 高通量測(cè)序。

基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析［28］，同時(shí)，對(duì)OTUs 進(jìn)行豐度、Alpha 多樣性計(jì)算、繪制Venn 圖，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs 信息；通過(guò)主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis， PCoA）展示樣本群落結(jié)構(gòu)；選用LEfSe 分析檢測(cè)各組間的物種差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 統(tǒng)計(jì)軟件整理數(shù)據(jù)，采用SPSS Statistics 21 進(jìn)行單因素方差分析及Duncan 氏法多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 作為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑處理對(duì)筍殼青貯感官的影響

由表2 可知，CE 和CM 組青貯筍殼腐敗味較濃郁，顏色變褐發(fā)黑，腐敗嚴(yán)重且散發(fā)出刺鼻性霉味，莖葉結(jié)構(gòu)較為緊湊完整，青貯品質(zhì)較差，為劣等。

表2 不同添加劑處理筍殼青貯的感官評(píng)定Table 2 Sensory evaluation of silage treated with different additives

FA、EM 和FC 組青貯筍殼有酒酸味，較為刺鼻，顏色暗綠，筍殼保存基本緊湊完整，略微黏連，無(wú)明顯腐敗味，青貯品質(zhì)一般。與對(duì)照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)提升明顯，青貯品質(zhì)改善顯著。

FM 和FCM 組筍殼芳香果味和甘酸味濃郁，結(jié)構(gòu)完整，青貯品質(zhì)良好，明顯優(yōu)于對(duì)照組。

2.2 不同添加劑處理對(duì)筍殼營(yíng)養(yǎng)成分的影響

根據(jù)上述筍殼青貯質(zhì)量感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)一般、良好的各處理組及對(duì)照組進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定，劣等處理組不予以測(cè)定。

由表3 可知，試驗(yàn)組干物質(zhì)（DM）和CP 含量均顯著高于CK 組（P＜0.05），F(xiàn)M 和FCM 組均顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；試驗(yàn)組NDF 含量均顯著低于CK 組（P＜0.05），且FCM 組顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；FM、FCM 和FC 組ADF 含量顯著低于CK 組（P＜0.05）；FA 組半纖維素（HC）含量顯著低于CK 組（P＜0.05）。

表3 不同處理青貯80 d 對(duì)筍殼飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of 80 days silage with different treatments on nutrient composition of bamboo shell feed（%）

2.3 不同添加劑青貯筍殼80 d 對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表4 可知，除EM 組pH 值與對(duì)照組差異不顯著外（P＞0.05），其他組pH 值均顯著低于CK 組（P＜0.05），且FA 和FCM 組顯著低于FM 和FC 組（P＜0.05）；試驗(yàn)組乳酸（LA）含量顯著高于CK 組（P＜0.05），且FCM 和FM 組顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；除EM 組氨態(tài)氮/總氮（AN/TN）值與對(duì)照組差異不顯著外（P＞0.05），其他組均顯著低于CK 組（P＜0.05）。

表4 不同處理青貯80 d 對(duì)筍殼pH 和青貯品質(zhì)的影響Table 4 Effects of different treatments on pH and silage quality of bamboo shell silage for 80 days

2.4 不同添加劑裹包混貯筍殼對(duì)湖羊瘤胃形態(tài)的影響

由圖1 和表5 可知，F(xiàn)CM 和FM 瘤胃乳頭長(zhǎng)度分別比CK 組顯著提高了39.84%、34.38%（P＜0.05）；FM 和CK 組肌層厚度顯著低于FCM 組（P＜0.05）。

圖1 不同添加劑青貯筍殼對(duì)湖羊瘤胃上皮組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of silage bamboo shoot shells with different additives on rumen epithelial tissue structure of Hu Sheep（×200）

表5 不同添加劑青貯筍殼對(duì)湖羊瘤胃形態(tài)的影響Table 5 Effects of different additives on rumen morphology of Hu Sheep （mm）

2.5 不同添加劑裹包混貯筍殼對(duì)湖羊瘤胃微生物的影響

2.5.1 OTU 分析 測(cè)序后，以97% 的一致性（identity）將序列聚類(lèi)成為OTUs，共得到15191 個(gè)OTUs。CK、FM 和FCM 組共有1174 個(gè)OTU，占總OTU 的7.73%（圖2）。

圖2 不同組別之間Venn 圖Fig.2 Venn diagram of different groups

2.5.2 瘤胃微生物Alpha 多樣性分析 由表6 可知，F(xiàn)CM 和FM 組Chao1 指數(shù)均顯著高于CK 組（P＜0.05）；各組Shannon 和Simpson 指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表6 Alpha 多樣性指數(shù)Table 6 Alpha diversity index

2.5.3 瘤胃微生物Beta 多樣性分析 由圖3 可知，第一主成分的貢獻(xiàn)率為52.2%、16.4%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為20.4%、13.8%，各組之間分布相距間隔較近，說(shuō)明不同組之間瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)差異不大。

圖3 基于Unweighted Unifrac （A）和Weighted Unifrac （B）距離的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析Fig. 3 Principal coordinate analysis of rumen microbial community structure based on Unweighted Unifrac （A） and Weighted Unifrac distance （B）

2.5.4 瘤胃微生物菌群門(mén)、科和屬水平相對(duì)豐度分析 如表7 所示，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）起主導(dǎo)作用，占細(xì)菌總豐富度的90%以上。厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度CK 組最高，為58.18%；FM組最低，為52.24%；擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度CK 組最低，為37.26%，最高為FM 組，為39.95%。

表7 門(mén)水平微生物相對(duì)豐度Table 7 Relative abundance of microorganisms at phylum level （%）

由表8 可知3 組中最豐富的科水平類(lèi)別，占主導(dǎo)作用的是未鑒定的擬桿菌科（unidentified_Bacteroidales），瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、未鑒定的梭菌科（unidentified_Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）。瘤胃球菌科相對(duì)豐度FM、FCM 組高于CK 組，其中FM 組最高，為20.98%，但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表8 科水平微生物相對(duì)豐度Table 8 Relative abundance of microorganisms at family level （%）

由表9 可知，各組中屬水平微生物相對(duì)豐度類(lèi)別，未鑒定的擬桿菌屬（unidentified_Bacteroidales）、未鑒定的瘤胃球菌屬（unidentified_Ruminococcaceae）、未鑒定的梭菌屬（unidentified_Clostridiales）、未鑒定的毛螺菌屬（unidentified_Lachnospiraceae）這4 個(gè)菌屬起主導(dǎo)作用，其中FM 組未鑒定的瘤胃球菌屬（unidentified_Ruminococcaceae）最高，CK 組最低，但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.5.5 組間差異物種分析 如圖4 所示，由LEfSe 分析（LDA score＞4）可知，F(xiàn)M 組生物標(biāo)志物是鞘脂菌屬（Sphingobium），CK 組是RF16 和細(xì)菌屬（Bacteria）。

圖4 CK 和FM 組，CK 和FCM 組基于LEfSe分析的組間差異物種Fig. 4 Different species of CK and FM group， CK and FCM group based on LEfSe analysis

3 討論

3.1 不同添加劑處理對(duì)筍殼營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響

筍殼含水量高達(dá)90%以上［29］，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，且粉碎后容易被氧化。因此，自然條件下筍殼的儲(chǔ)存和發(fā)酵易產(chǎn)生霉變，從而造成青貯失敗。然而，適當(dāng)使用青貯劑可有效改善發(fā)酵品質(zhì)，提升營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［30］。本研究發(fā)現(xiàn)添加纖維素酶組均腐敗嚴(yán)重，有強(qiáng)烈刺鼻性氣味，發(fā)黏結(jié)塊，可能是因?yàn)镋M 菌中的乳酸菌和纖維素酶在青貯發(fā)酵過(guò)程中無(wú)法產(chǎn)生協(xié)同作用，抑制了乳酸菌等有益菌活性，導(dǎo)致乳酸含量降低，從而導(dǎo)致青貯嚴(yán)重腐敗。黃小云等［31］在添加乳酸菌和纖維素酶對(duì)狼尾草（Pennisetumspp.）和圓葉決明（Chamaecrista rotundifolia）混合青貯效果的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其青貯品質(zhì)沒(méi)有得到明顯提升。楊烈等［32］在探究乳酸菌與纖維素酶對(duì)‘Tifton 85’狗牙根（Cynodonsp. cv.Tifton 85）青貯發(fā)酵品質(zhì)影響的結(jié)果表明，乳酸菌和纖維素酶之間可能存在拮抗作用，降低了青貯效果。

采用小罐青貯筍殼，層層壓實(shí)筍殼排出空氣，降低氧氣濃度，減緩筍殼自身氧化速率［33］。在本研究中，添加青貯劑后筍殼DM 含量顯著升高，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在一定程度上得到了有效保留。此外，在感官品質(zhì)鑒定、營(yíng)養(yǎng)成分方面，添加甲酸組均顯著優(yōu)于其他各單獨(dú)處理組，其pH 值明顯降低，CP 含量顯著增加，這主要是因?yàn)榧姿峥捎行б种聘瘮∥⑸锏幕钚?，降低pH 值，提高青貯成功率［34］。本研究中，與甲酸+EM 菌組相比，甲酸+EM 菌+纖維素酶組CP 含量更高，NDF 含量更低，可能是因?yàn)槔w維素酶能將筍殼中的纖維分解成可溶性多糖（water soluble carbohydrate， WSC），從而為EM 菌中厭氧菌的生長(zhǎng)繁殖提供更多可利用的底物，促進(jìn)了乳酸菌發(fā)酵，青貯中LA含量增加，有效改善了青貯品質(zhì)。這與趙小雪等［35］的研究結(jié)果基本一致。說(shuō)明適量添加甲酸、纖維素酶和EM 菌混合青貯筍殼能提升青貯品質(zhì)，降低ADF 和NDF 含量。

青貯發(fā)酵過(guò)程是眾多微生物復(fù)雜動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，添加甲酸、纖維素酶和EM 菌可為筍殼發(fā)酵營(yíng)造良好的環(huán)境，促進(jìn)乳酸菌和枯草芽孢桿菌等優(yōu)勢(shì)菌種生長(zhǎng)繁殖［36-37］。LA 含量越低，發(fā)酵物的pH 值越高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失越多，發(fā)酵效果越差［38］。AN/TN 是反映青貯飼料蛋白質(zhì)降解的重要指標(biāo)，AN/TN 值越低，說(shuō)明青貯品質(zhì)越好［39］。在本試驗(yàn)中，添加甲酸組能夠迅速酸化青貯筍殼，降低pH 值，從而抑制有害菌生長(zhǎng)繁殖。研究表明，pH 值與LA含量密切關(guān)聯(lián)，pH 值小于3.5 時(shí)，乳酸菌基本上停止生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致乳酸濃度降低［40］。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組pH 值顯著低于CK 組，LA 含量顯著高于CK 組，AN/TN 顯著低于CK 組，其中FM、FCM 組LA 含量較高，且FCM 組pH 值最低，AN/TN 最小，表明添加劑混合青貯發(fā)酵效果最佳，能夠明顯改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，這與周迪等［41］的研究結(jié)果一致。

3.2 不同添加劑處理對(duì)湖羊瘤胃發(fā)育的影響

瘤胃是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、存儲(chǔ)的主要場(chǎng)所，瘤胃組織形態(tài)學(xué)中瘤胃乳頭長(zhǎng)度、寬度和肌層厚度是衡量瘤胃發(fā)育的關(guān)鍵指標(biāo)［42-43］。瘤胃乳頭長(zhǎng)度是最重要的指標(biāo)，其次為瘤胃乳頭寬度及肌層厚度［44］。瘤胃乳頭長(zhǎng)度越長(zhǎng)，瘤胃上皮與瘤胃內(nèi)容物的接觸表面積越大，因而，瘤胃上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力增強(qiáng)，利于瘤胃的健康發(fā)育［45］。合理的精粗比可維持瘤胃乳頭正常形態(tài)，可增加瘤胃蠕動(dòng)，促進(jìn)肌層發(fā)育，促進(jìn)瘤胃乳頭發(fā)育［46］。本試驗(yàn)表明，F(xiàn)M 和FCM 組瘤胃乳頭長(zhǎng)度顯著大于CK 組，F(xiàn)CM 組肌層厚度顯著高于FM 和CK 組，表明不同添加劑處理青貯筍殼能促進(jìn)湖羊瘤胃形態(tài)發(fā)育。

3.3 不同添加劑裹包處理筍殼對(duì)湖羊瘤胃微生物多樣性的影響

瘤胃中分布著豐富的微生物，且微生物菌群處于一定的動(dòng)態(tài)平衡中。Alpha 多樣性分析主要反映瘤胃微生物菌群的豐富度和均勻度，Chao1 指數(shù)反映微生物豐度，數(shù)值越大，說(shuō)明群落的豐富度越高，Shannon 和Simpson指數(shù)反映物種多樣性，數(shù)值越高，說(shuō)明群落多樣性越高。瘤胃細(xì)菌多樣性和豐度是影響瘤胃功能的關(guān)鍵因素［47］。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)M 和FCM 組Chao1 指數(shù)均顯著高于CK 組，說(shuō)明不同添加劑青貯筍殼可在一定程度上改變?cè)囼?yàn)羊瘤胃菌群豐富度，其中FCM 組高于FM 組，這是由于添加纖維素酶青貯筍殼改善了試驗(yàn)羊瘤胃發(fā)酵功能，體內(nèi)建立了優(yōu)勢(shì)菌群，增加了瘤胃內(nèi)活菌總數(shù)，提升了微生物多樣性［48-49］。陳宇［50］研究表明添加木聚糖酶和纖維素酶可以提高培養(yǎng)液中細(xì)菌總濃度，促進(jìn)纖維降解菌繁殖，與賈鵬［51］研究結(jié)果相近。由Beta 多樣性分析可知，各組間瘤胃微生物菌落結(jié)構(gòu)差異不大，表明不同添加劑青貯筍殼增加瘤胃微生物群落多樣性的作用不明顯，與姜碧薇［52］采用酶菌青貯粗飼料提高了試驗(yàn)羊瘤胃內(nèi)微生物多樣性的研究結(jié)果不一致。

3.4 不同添加劑裹包處理筍殼對(duì)湖羊瘤胃微生物菌群的影響

反芻動(dòng)物瘤胃微生物由細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、古細(xì)菌和病毒組成，構(gòu)成了復(fù)雜的共生網(wǎng)絡(luò)，菌群受日齡、品種、精粗比、添加劑以及日常管理方式等因素影響，菌群的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于維持宿主反芻動(dòng)物的免疫功能和整體生產(chǎn)效率至關(guān)重要［53］。反芻動(dòng)物瘤胃微生物菌群豐富多樣，其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，且其豐度較高，厚壁菌門(mén)可以降解纖維生成揮發(fā)性脂肪酸，而擬桿菌門(mén)可以降解蛋白質(zhì)和非纖維素植物多糖［54］。在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組湖羊瘤胃內(nèi)主要為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，占比約90%，與陳麗娟等［55］采用體外發(fā)酵法研究不同比例構(gòu)樹(shù)（Broussonetia papyrifera）與苜蓿（Medicago sativa）混合對(duì)安格斯母牛瘤胃細(xì)菌多樣性影響的結(jié)果一致。瘤胃球菌科可水解纖維素、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)，轉(zhuǎn)化成糖類(lèi)物質(zhì)。本試驗(yàn)表明，試驗(yàn)組瘤胃球菌科相對(duì)豐度高于CK組，且FM 組相對(duì)豐度最大，這是由于EM 菌中的枯草芽孢桿菌等提高了筍殼在瘤胃內(nèi)粗纖維的降解速率。普雷沃氏菌也是反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群之一，主要參與淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解［56］。在本試驗(yàn)結(jié)果中，F(xiàn)CM 組普雷沃氏菌科、瘤胃球菌科相對(duì)豐度均與CK 和FM 組相比無(wú)顯著差異，表明添加劑處理筍殼增加瘤胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)及微生物多樣性的作用不太明顯。

4 結(jié)論

單一或復(fù)合添加青貯劑發(fā)酵筍殼可提高CP、乳酸含量，降低pH 值，提升發(fā)酵品質(zhì)，同時(shí)能降低ADF、NDF 以及HC 含量，其中甲酸+EM 菌組和甲酸+纖維素酶+EM 菌組青貯筍殼感官品質(zhì)、發(fā)酵特性和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較好，用于飼喂湖羊，但改善瘤胃微生物組成和結(jié)構(gòu)的作用不太明顯。