孕鼠肥胖對(duì)子代雄鼠早期肝臟脂肪代謝的影響和機(jī)制研究

祝峰 韓曙光 徐珂 滕懿群

母代肥胖會(huì)導(dǎo)致子代成年期肥胖、心血管疾病、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和脂肪性肝炎形成[1]。Baker[2]認(rèn)為早期生活環(huán)境的改變會(huì)增加子代的表型和代謝紊亂風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明母體孕期肥胖、哺乳期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠活動(dòng)和進(jìn)食節(jié)律改變，并會(huì)在小鼠成年后導(dǎo)致代謝異常，包括糖代謝異常、脂代謝異常、NAFLD等[3]。自噬是真核細(xì)胞特有的一種分解代謝過程，其在維持細(xì)胞能量代謝平衡、控制細(xì)胞器質(zhì)量、細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子 EB（transcription factor EB，TFEB）在肝臟中增加可以調(diào)節(jié)溶酶體和自噬相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟自噬表達(dá)的增加，從而有效改善肝臟脂肪變性[4]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)去乙?；?（sirtuin3，SIRT3）過表達(dá)可以導(dǎo)致錳超氧化物歧化酶的去乙?；突罨诤谋M細(xì)胞的超氧化物后實(shí)現(xiàn)自噬的抑制，促使肝臟脂滴的形成[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)母代肥胖和母乳喂養(yǎng)方式改變會(huì)導(dǎo)致后代17歲時(shí)更容易發(fā)生NAFLD[6]，具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。Devarajan等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，早期宮內(nèi)環(huán)境變化會(huì)使子代產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)敏感記憶，通過自噬調(diào)節(jié)在晚年對(duì)子代肝臟代謝產(chǎn)生保護(hù)作用。對(duì)此，本研究提出假設(shè)，肥胖母鼠子代在早期會(huì)發(fā)生肝臟改變，并且自噬可能在其中發(fā)揮作用。目前肝代謝的研究主要集中在成年期，但是關(guān)于母代肥胖的子代早期肝臟脂滴形成易感性，及其與自噬之間的關(guān)系研究較少。因此，本研究通過高脂喂養(yǎng)構(gòu)建肥胖母鼠模型，以探究母代肥胖及哺乳期高脂飲食對(duì)子代肝臟早期脂滴形成的易感性及可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)C57BL/6J雌鼠20只及雄鼠10只，購(gòu)自蘇州大學(xué)，被安置在嘉興學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為（24±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，12 h/12 h明暗循環(huán)照明，自由獲取水和食物。實(shí)驗(yàn)過程中，雄鼠均普通糧喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)嘉興市第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則指南（1996修訂版）的要求。

1.2 試劑和儀器 TC（A111-1-1）、TG（A110-2-1）、HDL（A112-1-1）、LDL（A113-1-1）試劑盒均購(gòu)自中國(guó)南京建成生物有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司；自噬相關(guān)基因Beclin-1、自噬相關(guān)基因3（autophagy associated gene 3，ATG3）、自噬相關(guān)基因5（autophagy associated gene 5，ATG5）、自噬相關(guān)基因 12（autophagy associated gene 12，ATG12）、p62 及輕鏈 3B（light chain 3B，LC3B）等mRNA引物由中國(guó)通用生物技術(shù)公司合成；Beclin-1（A10101）、ATG3（A5809）、ATG5（A0203）、ATG12（A19610）、p62（A7758）、LC3B（A5618）、生物素二抗（AS014）等蛋白抗體均購(gòu)自中國(guó)ABclonal公司；微管蛋白（Tubulin）（KM9003）購(gòu)自天津 Sungene Biotech公司；多功能酶標(biāo)儀（SPARK）購(gòu)自瑞士TECAN公司；普通PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Thermo Fisher-QS3實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Bio-Rad凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與喂養(yǎng) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只雌鼠分為肥胖母鼠（obese maternal，OM）組和普通母鼠（common maternal，CM）組，每組10只。OM組雌鼠接受高脂飼料（含60%脂肪，江蘇南通特洛菲生物有限公司）喂養(yǎng)；CM組雌鼠接受普通飼料（含4%脂肪，江蘇南通特洛菲生物有限公司）喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周后，兩組雌鼠出現(xiàn)明顯體重差異。將普通雄鼠與雌鼠按1∶2進(jìn)行交配，它們的后代被定義為OM子代鼠（OM offspring，OM-O）、CM子代鼠（CM offspring，CM-O）。兩組母鼠哺乳期間統(tǒng)一高脂飼料喂養(yǎng)，按照每只母鼠2 g/d進(jìn)行飼喂。兩組子代鼠均母乳喂養(yǎng)4周，并在4周時(shí)斷乳，同時(shí)每組隨機(jī)選取7只子代雄鼠，麻醉后分別收集眼球靜脈血和肝臟組織，并保存于-80℃冰箱備用。所有子代雄鼠均采用脫頸椎法處死。

1.3.2 肝臟病理切片檢測(cè) 采用油紅O染色法。取4周齡子代雄鼠的新鮮肝臟右葉小塊組織，迅速放入4%多聚甲醛中固定肝臟樣本，石蠟包塊，4 μm厚切片，常規(guī)油紅O染色（紅色代表脂滴沉積），顯微鏡下觀察肝臟組織變化。

1.3.3 血清脂代謝指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA法。取4周齡子代雄鼠眼球靜脈血，收集的全血4℃隔夜放置，在4℃低溫下3 500 r/min離心10 min，取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書檢測(cè)TC、TG、HDL、LDL水平。

1.3.4 自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RTPCR法。用Trizol試劑從肝臟組織中提取總RNA。在Thermo Fisher-QS3實(shí)時(shí)定量PCR儀上檢測(cè)Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG12、p62及 LC3B 等 mRNA 表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)步驟：變性程序（95℃10 min），擴(kuò)增定量程序重復(fù)40次（95℃ 15 s，60℃ 10 s，72℃和15 s，單熒光測(cè)量），熔融曲線程序（60～95℃，加熱速率0.1 C/s，連續(xù)熒光測(cè)量）。采用 2-ΔΔCt法測(cè)定相對(duì) mRNA的表達(dá)。相關(guān)基因引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因引物序列

1.3.5 自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。提取肝臟組織總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。將各樣本的蛋白濃度調(diào)整一致，再與1/4體積的蛋白上樣緩沖液混合后煮沸，變性；通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜；在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，按照 1:1 000 稀釋 Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG12、p62及LC3B等抗體原液，根據(jù)分子量大小分別以Tubulin作為內(nèi)參，于4℃過夜孵育；第2天洗膜，用5%脫脂奶粉稀釋HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）于搖床上孵育90 min，洗膜后，加發(fā)光液，用Bio-Rad成像系統(tǒng)曝光，采用Image J軟件測(cè)定灰度值，目標(biāo)蛋白分別與內(nèi)參灰度值相比為各自相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.6 肝臟組織LC3B含量檢測(cè) 采用免疫組化染色法。肝臟組織切片以新鮮配置體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2滅活細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶，然后用血清封閉，根據(jù)測(cè)試指標(biāo)分別滴加LC3B以及相應(yīng)生物素二抗AS014；DAB顯色，封片。采用Image J軟件對(duì)肝臟中LC3B的積分光密度（IOD）值進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，方差齊時(shí)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組子代雄鼠肝臟組織病理變化比較 與CM-O組比較，OM-O組肝臟切片中脂滴形成不明顯，肝臟脂滴沉積較輕，見圖1（插頁）。

圖1 兩組子代雄鼠肝臟組織病理變化[a：普通母鼠子代鼠（CM-O）組；b：肥胖母鼠子代鼠（OM-O）組；油紅O染色，×100]

2.2 兩組子代雄鼠血清脂代謝指標(biāo)比較 兩組子代雄鼠血清TC、TG、HDL、LDL水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見表 2。

表2 兩組子代雄鼠血清脂代謝指標(biāo)比較（mmol/L）

2.3 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 與CM-O組比較，OM-O組Beclin-1、LC3B mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，p62 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而兩組子代雄鼠ATG3、ATG5、ATG12 mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。與CM-O組比較，OM-O組 Beclin-1、ATG12、LC3B蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，p62蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而兩組子代雄鼠ATG3、ATG5蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2和表4。

圖2 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)的電泳圖（肥胖母鼠子代鼠為OM-O；普通母鼠子代鼠為CM-O；自噬相關(guān)基因3為ATG3；自噬相關(guān)基因5為ATG5；自噬相關(guān)基因12為ATG12；輕鏈3B為L(zhǎng)C3B；Tubulin為微管蛋白）

表3 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較

表4 兩組子代雄鼠肝臟自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平比較

2.4 兩組子代雄鼠肝臟組織中LC3B含量比較 兩組肝臟組織免疫組化染色結(jié)果見圖3（插頁）。OM-O組LC3B的 IOD值為 2.43±1.02，高于 CM-O組的0.70±0.20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.88，P＜0.05）。

圖3 兩組小鼠肝臟中輕鏈3B（LC3B）免疫組化染色結(jié)果[a：普通母鼠子代鼠（CM-O）組；b：肥胖母鼠子代鼠（OM-O）組；×100]

3 討論

母代肥胖或早期營(yíng)養(yǎng)過剩對(duì)子代代謝影響深遠(yuǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)孕前肥胖導(dǎo)致的宮內(nèi)環(huán)境改變或母代哺乳期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致子代肥胖、脂代謝異常[8-9]。目前代謝異常的研究都集中于成年期，很少有研究關(guān)注到幼年的代謝改變。兒童早期健康狀況往往是其成年后健康的重要基礎(chǔ)，例如臨床研究發(fā)現(xiàn)兒童早期肥胖或超重會(huì)導(dǎo)致成年后更容易出現(xiàn)NAFLD和ALT異常[10]，兒童青春期血壓變化將影響成年后的人體代謝[11]，因此關(guān)注早期子代代謝改變將對(duì)預(yù)防成年后的疾病有重要意義。本研究選擇4周齡子代雄鼠進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組子代雄鼠血清脂代謝指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在哺乳期高脂飲食的母乳喂養(yǎng)下，兩組子代雄鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)了脂質(zhì)沉積。這也與之前的臨床研究：哺乳期母代高脂飲食容易導(dǎo)致子代青年期NAFLD的形成[6]相一致。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，與CM-O組比較，OM-O組肝臟脂沉積等代謝異常表現(xiàn)較輕。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，OM-O組肝臟中自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3B mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，p62 mRNA表達(dá)水平下調(diào)；在蛋白層面的驗(yàn)證下，本研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，p62蛋白表達(dá)水平下調(diào)，結(jié)果表明與CM-O組相比，OM-O組子代雄鼠肝臟內(nèi)自噬表達(dá)增加。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的SD大鼠，肝臟脂肪變性前期自噬會(huì)增加，而晚期脂肪變性加重同時(shí)會(huì)導(dǎo)致自噬降低，這一結(jié)論與本研究結(jié)果一致。

自噬不僅能維持體內(nèi)細(xì)胞的平衡狀態(tài)及正常功能，還可以作為一種重要的脂質(zhì)代謝途徑[13]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬可以導(dǎo)致饑餓小鼠胚胎成纖維細(xì)胞里的脂滴數(shù)量和尺寸更大[14]，在使用氯喹（自噬抑制劑）后，自噬表達(dá)降低加重了脂肪變性。而當(dāng)使用雷帕霉素（自噬激活劑）時(shí)，激活后的自噬可顯著減輕肝細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積[12]。Devarajan等[7]通過對(duì)母代孕期限飼喂養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)子代小鼠肝臟自噬表達(dá)在成年期出現(xiàn)下降而形成脂代謝異常，但在老年期會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)敏感記憶出現(xiàn)肝臟的脂代謝改善，這表明母代的營(yíng)養(yǎng)狀況可以通過記憶的方式傳遞給子代，從而激發(fā)子代的自我保護(hù)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)母代肥胖的子代雄鼠在早期雖然沒有明顯出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)改變，但自噬出現(xiàn)增加，這可以認(rèn)為是一種保護(hù)機(jī)制，母代肥胖對(duì)子代雄鼠肝臟脂代謝穩(wěn)態(tài)的影響可能與肥胖母代早期的營(yíng)養(yǎng)記憶有關(guān)，這一記憶通過遺傳傳遞給后代，使子代早期激活了自噬調(diào)節(jié)，對(duì)自身肝臟脂代謝形成代償作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)母代肥胖對(duì)其子代肝脂代謝影響可能與自噬在其中發(fā)揮了一定的積極作用有關(guān)。當(dāng)然，本研究還存在一定的不足：（1）未通過調(diào)節(jié)自噬的表達(dá)來進(jìn)一步明確自噬與子代雄鼠肝臟脂質(zhì)改變之間的相關(guān)性；（2）未對(duì)這一變化的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入探究，今后將進(jìn)一步開展后續(xù)工作。