苧麻種質(zhì)基因型對體細(xì)胞植株再生的影響

何鵬亮，蔣美艷，邢虎成，揭雨成*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南 長沙 410128； 2 湖南省草類作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128)

苧麻(Boehmeria nivea)為蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Boehmeria)的多年生草本植物，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，在世界上享有“中國草”(China grass)之譽(yù)稱[1-3]。 其栽培歷史在4 000 年以上，是我國最先利用的天然纖維之一[4]。 苧麻組織培養(yǎng)技術(shù)在苧麻品種改良、種質(zhì)資源的繁殖和保存、雜種優(yōu)勢的固定和遺傳轉(zhuǎn)化等方面具有重要作用。 高再生率的體細(xì)胞再生體系對開展體細(xì)胞無性系變異規(guī)律研究及其種質(zhì)創(chuàng)新極為有利。 迄今為止，苧麻離體再生體系的研究已取得了一定的進(jìn)展，研究內(nèi)容涉及基因型[5-10]、激素[11-16]、外植體類型[17-19]、基本培養(yǎng)基[8，20-21]等，但仍存在基因型差異顯著、植株再生頻率低、可重復(fù)操作性差等問題。 本試驗(yàn)研究苧麻種質(zhì)基因型對體細(xì)胞植株再生的影響，以為苧麻的組織培養(yǎng)及植株再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用6 個(gè)苧麻種質(zhì)，分別是湘飼苧X4、湘飼苧X6、湘飼苧X7、A、B 和C，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

將6 個(gè)苧麻種質(zhì)種苗移栽于裝有營養(yǎng)土的盆中進(jìn)行培養(yǎng)，等植株長出新葉后，取嫩葉作為外植體，每個(gè)種質(zhì)各接種30 片，3 個(gè)重復(fù)共90 片，用毛筆輕輕刷去雜質(zhì)，用自來水沖洗，濾紙吸干，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸洗25 s 后，用無菌水沖洗3 遍，再用0.1%升汞消毒7 min，用無菌水沖洗5 遍后，在無菌濾紙上將葉片切成0.5 cm×0.5 cm 的方塊，并將其接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。 將葉塊的下表皮貼于培養(yǎng)基上，于暗室中誘導(dǎo)愈傷組織，一般5 d后愈傷基本形成。 10 d 后將愈傷轉(zhuǎn)接于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件:白天溫度26±2 ℃，夜間為20±2 ℃，每天光照11 h，光照強(qiáng)度為1 500 ～2 000 Lx。 愈傷組織通過多次繼代，分化出不定芽，再將不定芽轉(zhuǎn)接在壯苗培養(yǎng)基上壯苗，待不定芽長至2 ～3 cm 時(shí)，再將其轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中，10 d 后可以長出新根，即為完整的再生植株。 愈傷組織、不定芽和根的誘導(dǎo)均設(shè)3 次重復(fù)。

1.3 培養(yǎng)基配方

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基＋TDZ(噻苯隆，0.05 mg/L)＋2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，0.03 mg/L)＋I(xiàn)AA(吲哚乙酸，0.01 mg/L)。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/2 MS 培養(yǎng)基＋TDZ(0.5 mg/L)＋2，4-D(0.02 mg/L)＋I(xiàn)AA(0.03 mg/L)。

壯苗培養(yǎng)基:MS＋TDZ(0.05 mg/L)＋I(xiàn)AA(0.05 mg/L)。

生根培養(yǎng)基:MS＋TDZ(0.02 mg/L)＋NAA(0.05 mg/L)＋I(xiàn)AA(0.02 mg/L)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及方法

采用Excel 2010 對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用DPS 9.01 軟件進(jìn)行方差分析。 本研究根據(jù)以下公式計(jì)算組織培養(yǎng)處理的愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率和生根率[22]:

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)＝(產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)/接種的葉片數(shù))×100；

不定芽誘導(dǎo)率(%)＝(產(chǎn)生不定芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100；

生根率(%)＝(生根小苗數(shù)/接種的不定芽數(shù))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

6 個(gè)苧麻種質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果見表1 和圖1。 在時(shí)間上，種質(zhì)A、B 和C 在接種后第2 天葉片出現(xiàn)膨大，第3 天誘導(dǎo)出愈傷組織，湘飼苧X4 在第5 天出現(xiàn)愈傷組織，湘飼苧X6 和湘飼苧X7 脫分化的時(shí)間最長，第7 天才誘導(dǎo)出愈傷組織，且長出的愈傷組織不整齊。 顏色上，A、B 和C 分別出現(xiàn)了米白、淺黃和淡紅等顏色，其他3 個(gè)種質(zhì)的愈傷組織顏色較一致。 在愈傷組織的質(zhì)量上，A、B 和C 的愈傷組織長勢相對較強(qiáng)，質(zhì)地疏松，成小瘤、顆粒狀，且愈傷組織誘導(dǎo)率也較高，其中，C 的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)96.67%，A 和B 的愈傷誘導(dǎo)率均為90.00%；湘飼苧X6 和湘飼苧X7 的愈傷組織長勢較弱，尤其是湘飼苧X7，愈傷組織質(zhì)地呈蓬松狀，少量的愈傷還出現(xiàn)了變褐現(xiàn)象，其愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為30.00%，湘飼苧X6 為40.00%；湘飼苧X4 的愈傷組織誘導(dǎo)率為76.67%，處于中間位置，高于湘飼苧X6 和湘飼苧X7，但低于A、B 和C。

圖1 不同苧麻種質(zhì)培養(yǎng)15 d 的愈傷組織Fig.1 Callus of different ramie germplasm cultured for 15 days

表1 不同苧麻種質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果Table 1 Callus induction results of different ramie germplasm

2.2 不定芽誘導(dǎo)

將6 個(gè)種質(zhì)的愈傷組織轉(zhuǎn)接在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每隔3 d 觀察1 次，每隔3 個(gè)星期繼代1 次，觀察并記錄結(jié)果(表2，圖2)。 根據(jù)表2，第1 次繼代后，每個(gè)種質(zhì)都出現(xiàn)了不同程度的變褐現(xiàn)象，其中湘飼苧X4、湘飼苧X6 和湘飼苧X7 較嚴(yán)重，變褐的愈傷組織最后都出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了不定芽誘導(dǎo)率；湘飼苧X4、湘飼苧X6 和湘飼苧X7 的不定芽誘導(dǎo)率分別為11.62%、8.33%、5.88%；種質(zhì)A、B、C 的情況較好，特別是種質(zhì)C。 第2 次繼代后，愈傷組織分化出了少量的芽和簇芽，其中B 有15塊愈傷分化出了根，A 的愈傷轉(zhuǎn)綠，質(zhì)地致密。 第3次繼代后，A 和B 均分化出了芽，由于B 分化了根，不利于芽和苗的再生，A 的不定芽誘導(dǎo)率(24.52%)稍高于B(21.15%)，不定芽誘導(dǎo)率最高的是種質(zhì)C(31.57%)。

圖2 不同苧麻種質(zhì)愈傷組織9 周后誘導(dǎo)出的不定芽Fig.2 Adventitious buds induced from callus of different ramie germplasm after 9 weeks

圖3 不同苧麻種質(zhì)的不定芽生根情況(轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基后17 d)Fig.3 Rooting of adventitious buds in different ramie germplasm (17 days after transfer to rooting medium)

表2 不同苧麻種質(zhì)不定芽誘導(dǎo)結(jié)果Table 2 Induction of adventitious buds from different ramie germplasm

2.3 壯苗培養(yǎng)情況

由于愈傷組織上長出來的不定芽太小，生長能力弱，不能直接接種在生根培養(yǎng)基中生根，而需要在壯苗培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)壯苗。 即將誘導(dǎo)出不定芽的愈傷塊轉(zhuǎn)接在附加TDZ(0.05 mg/L)和IAA(0.05 mg/L)的MS 培養(yǎng)基中，每隔3 d 觀察1 次，15 d 后觀察發(fā)現(xiàn)，大部分不定芽生長較好，莖稈粗，葉子蔥綠，也有少許不定芽生長較慢，芽苗較矮，葉子較小。

2.4 根的誘導(dǎo)

待不定芽長至2 ～3 cm，將其轉(zhuǎn)接在附加TDZ(0.02 mg/L)、IAA(0.02 mg/L)和NAA(0.05 mg/L)的MS 培養(yǎng)基上，10 d 后，6 個(gè)種質(zhì)全部生根。 開始根少且短，植株矮小，1 周后，整個(gè)三角瓶的底部都布滿了根，植株也隨著長高長大，從而形成了完整的再生植株。

3 討論

潘昌立等[5]研究發(fā)現(xiàn)，基因型是苧麻外植體誘導(dǎo)愈傷組織和再生植株的決定因素，在相同培養(yǎng)條件下，不同基因型苧麻葉愈傷組織的綠芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)為:湘苧6 號(hào)(36.0%)＞湘苧2 號(hào)(34.0%)＞Q8(20.0%)＞蘆竹青(8.8%)＞湘苧3 號(hào)(3.3%)＞C5(2.9%)。 劉瑛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，基因型和培養(yǎng)基組分是影響苧麻體細(xì)胞植株再生的內(nèi)因和主要外因，不同基因型苧麻葉愈傷組織的綠芽誘導(dǎo)率表現(xiàn)為:細(xì)野麻(36.0%)＞贛苧3 號(hào)(33.4%)＞湘苧2 號(hào)(32.0%)＞89-12(20.0%)＞湘苧3 號(hào)(3.3%)。 馬雄風(fēng)[7]研究發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件下，不同基因型苧麻下胚軸愈傷的芽再生頻率表現(xiàn)為:中飼苧1 號(hào)(83.77%)＞中苧1 號(hào)(81.77%)＞NC01(80.59%)；子葉愈傷組織的芽再生頻率表現(xiàn)為:NC01(60.29%)＞中苧1 號(hào)(57.14%)＞中飼苧1 號(hào)(50.51%)。

王曉玲等[8]將湘苧6 號(hào)和湘苧2 號(hào)的葉片在附加2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2，4-D 的MS、MSB、LS、B5 和N6 等5 種培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)湘苧2號(hào)葉愈傷組織量均高于湘苧6 號(hào)。 王曉玲和彭定祥[9]研究發(fā)現(xiàn)，在附加0.5 ～2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA，0.5-2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2，4-D 的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，黃殼早、湘苧2 號(hào)、華苧3 號(hào)和巴西麻6 號(hào)適應(yīng)性強(qiáng)，脫分化和分化均較容易，但華苧1 號(hào)脫分化難。 Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，苧麻不定芽再生情況取決于基因型，將6 種苧麻基因型在附加2.27 μM TDZ 和0.057 μM IAA 或2.27 μM TDZ 和0.054 μM NAA 的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，5041-3 的不定芽誘導(dǎo)率最高，分別為86.2%和64.5%，黃皮棍的不定芽誘導(dǎo)率最低，分別為46.5%和33.4%。

4 結(jié)論

本研究中，6 個(gè)苧麻種質(zhì)的愈傷誘導(dǎo)率均較高，種質(zhì)C 的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)96.67%，湘飼苧X7的愈傷誘導(dǎo)率最低，為30.00%；而6 個(gè)種質(zhì)的不定芽誘導(dǎo)率卻相對較低，種質(zhì)C 的不定芽誘導(dǎo)率最高，為31.57%，湘飼苧X7 的不定芽誘導(dǎo)率最低，僅為5.88%。 綜合分析，基因型是影響苧麻外植體愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽形成的重要因素。