氨氮急性脅迫對(duì)許氏平鲉血液生化指標(biāo)影響

高云濤, 高云紅, 王嘉偉, 李明月, 曲江波, 賈玉東, 孟 振

氨氮急性脅迫對(duì)許氏平鲉血液生化指標(biāo)影響

高云濤1, 2, 高云紅1, 王嘉偉1, 2, 李明月1, 曲江波3, 賈玉東1, 孟 振1

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 3.煙臺(tái)開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司, 山東 煙臺(tái) 264006)

采用96 h半靜態(tài)毒性實(shí)驗(yàn), 研究了許氏平鲉幼魚的氨氮耐受性和氨氮脅迫下血液生化指標(biāo)的變化規(guī)律。結(jié)果表明, 在水溫 (18.6±0.5) ℃, pH 7.85, 鹽度30和溶氧 (8.6±0.5) mg/L的條件下, 平均體質(zhì)量(63.60±10.14) g、平均全長(zhǎng)(15.90±3.29) cm的許氏平鲉幼魚總氨(TAN)和非離子氨(NH3-N)96 h的半致死濃度(LC50)分別為18.01 mg/L和0.27 mg/L, 安全濃度(SC)分別為1.80 mg/L和0.03 mg/L。設(shè)定TAN為0、3.5、10和20 mg/L 4個(gè)濃度梯度, 對(duì)同等規(guī)格苗種進(jìn)行96 h急性脅迫實(shí)驗(yàn), 血液生化指標(biāo)的雙因素方差分析表明: 氨氮濃度、暴露時(shí)間及兩者交互作用對(duì)血漿血糖(GLU)、血氨(PA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、堿性磷酸酶(AKP)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量/活性存在顯著影響, 兩者交互作用對(duì)血漿皮質(zhì)醇(Cor)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量/活性無顯著影響, 暴露時(shí)間對(duì)血漿膽固醇(TCH)無顯著影響; 其中, 血漿GLU、GSH、AKP隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì), 隨氨氮濃度升高響應(yīng)時(shí)間提前; PA濃度與環(huán)境TAN濃度正相關(guān)。相關(guān)研究結(jié)果可為許氏平鲉幼魚的養(yǎng)殖管理和苗種運(yùn)輸提供指導(dǎo), 血漿GLU、GSH、PA和AKP可作為許氏平鲉氨氮脅迫的敏感指標(biāo)。

許氏平鲉; 氨氮急性脅迫; 血液生理指標(biāo)

氨氮(TAN)是養(yǎng)殖環(huán)境中對(duì)魚類造成生理應(yīng)激和損害的重要環(huán)境因子[1], 受pH、溫度等因素影響, 以非離子氨(NH3-N)和離子銨(NH4+)的形式在水體中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡[2]。兩者中, NH3由于不帶電荷和脂溶性的特點(diǎn), 能夠穿透生物膜系統(tǒng)進(jìn)入魚體血液循環(huán), 可快速引發(fā)毒性效應(yīng), 是引起水生生物毒害的主要因子, 而NH4+毒性較低[3]。

許氏平鲉()是中國(guó)北方沿海的主要養(yǎng)殖魚類品種, 養(yǎng)殖模式以“陸海接力”為主, 即在工廠化條件下完成育苗和大規(guī)格苗種培育, 再轉(zhuǎn)運(yùn)至網(wǎng)箱中養(yǎng)成至商品魚[4-5]。在苗種的工廠化養(yǎng)殖期間和陸海接力運(yùn)輸中, 因水體生物負(fù)載過高, 可能導(dǎo)致氨氮持續(xù)或瞬間升高, 影響魚體生長(zhǎng)和存活, 造成養(yǎng)殖損失。氨氮對(duì)許氏平鲉大規(guī)格幼魚毒性效應(yīng)的研究較少, 而在氨氮脅迫引起魚類應(yīng)激反應(yīng)中, 血液生理生化指標(biāo)可以作為應(yīng)激的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]。

本研究通過對(duì)許氏平鲉大規(guī)格幼魚進(jìn)行96 h急性毒性實(shí)驗(yàn), 獲得氨氮的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC), 研究氨氮濃度、脅迫時(shí)間及二者交互作用對(duì)血液生化指標(biāo)的影響, 查明氨氮脅迫的敏感指標(biāo)及其變化規(guī)律, 可為許氏平鲉大規(guī)格幼魚的養(yǎng)殖管理和海陸接力養(yǎng)殖的苗種轉(zhuǎn)運(yùn)提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為煙臺(tái)開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司, 實(shí)驗(yàn)苗種平均體質(zhì)量(63.60±10.14) g, 全長(zhǎng)(15.90±3.29) cm, 苗種體表無損傷、規(guī)格整齊、活力較好。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)48 h, 禁食。

實(shí)驗(yàn)采用體積為120 L的圓柱形玻璃鋼水槽, 海水經(jīng)砂濾、紫外消毒處理, 水溫(18.6±0.5) ℃, pH 7.85, 鹽度30, 溶氧 (8.6±0.5) mg/L, TAN<0.1 mg/L, 光照(610～630) lx 。

1.2 半致死劑量實(shí)驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn), 獲得氨氮濃度的上、下限, 按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置濃度梯度。本實(shí)驗(yàn)TAN質(zhì)量濃度為10.09、12.72、16.01、20.19、25.44、32.03和40.37 mg/L, 對(duì)應(yīng)非離子氨(NH3-N)濃度0.15、0.19、0.24、0.30、0.38、0.48和0.60 mg/L, 同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(不添加NH4Cl, 表1)。

TAN濃度以分析純NH4Cl(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)配制, 即加入相應(yīng)體積新鮮配制的NH4Cl母液(10 g/L)。每個(gè)處理濃度組設(shè)3個(gè)平行樣, 分別放入同規(guī)格苗種10尾, 保持正常通氣, 每24 h更換一次水體。每隔2 h觀察一次苗種行為表現(xiàn), 記錄水溫、溶氧、pH和魚體死亡量, 將死亡魚體及時(shí)撈出、處理。

1.3 急性氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)

根據(jù)半致死計(jì)量實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果, 設(shè)置TAN濃度0、3.5、10、20 mg/L, 對(duì)應(yīng)NH3-N濃度0、0.05、0.15、0.30 mg/L, 分析急性氨氮脅迫下許氏平鲉幼魚血液生化指標(biāo)的變化規(guī)律。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行樣, 分別放入許氏平鲉幼魚30尾, 規(guī)格同上。

1.3.1 血液樣品采取

血液樣品采集時(shí)間為脅迫后的0、6、12、24、48、72和96 h。采血時(shí), 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)由同一濃度組3個(gè)平行樣中各隨機(jī)抽取3尾魚(共9尾), 將魚體快速撈出, 采用MS-222(200 mg/L, Sigma)快速深度麻醉, 尾靜脈采血, 血液置于EDTAK2抗凝管中4 ℃保存, 5 000 r/min離心10 min制備血漿, 血漿保存于–80 ℃, 用于檢測(cè)血液生化指標(biāo)。

1.3.2 血液樣品檢測(cè)

血漿膽固醇(TCH, COD-PAP法)、甘油三酯(TG, GPO-PAP酶法)、血氨(PA, 無蛋白濾液法)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT, 賴氏法)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST, 賴氏法)、還原型谷胱甘肽(GSH, 比色法)、堿性磷酸酶(AKP, 微量酶標(biāo)法)、葡萄糖(GLU, 葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法)測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所, 采用上海酶聯(lián)生物研究所Elisa試劑盒(Cortisol, Fish Cortisol Elisa Kit ml003467)測(cè)定皮質(zhì)醇(Cor)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

NH3-N濃度由TAN濃度采用《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3097—1997)公式換算, 換算公式為:

=9.245+0.002 949S+0.032 4(298–), (3)

其中,為水樣中NH3-N濃度(mg/L),為TAN濃度(μmol/L),為氨的水溶液中非離子氨的摩爾百分比,為溫度(=273+)鹽度的海水中NH4+的解離平衡常數(shù)KaS·T的負(fù)對(duì)數(shù),為水體pH值。

TAN和NH3-N的96 h半致死濃度(LC50,)使用SPSS 17.0軟件以概率單位加權(quán)回歸(Probit)法計(jì)算, 安全濃度(SC,)計(jì)算公式為:

=0.1×. (4)

用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示血漿生化指標(biāo)數(shù)據(jù), 數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)(SPSS 17.0), 同一濃度不同時(shí)間和同一時(shí)間不同濃度處理組間的差異性(<0.05)使用Tukey’s多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 行為反應(yīng)

脅迫初期(0～6 h), 高濃度氨氮組(32.03和40.37 mg/L)幼魚即表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)頻繁、急速和無方向游泳等現(xiàn)象, 且幼魚的急性應(yīng)激反應(yīng)隨氨氮濃度的增加而劇烈, 脅迫2～24 h時(shí), 40.37 mg/L組幼魚受驚后會(huì)盲目沖擊池壁或沖出水面, 短暫、快速運(yùn)動(dòng)后魚體逐漸失去平衡, 沉于水底。低濃度處理組(A、B、C組)實(shí)驗(yàn)魚在實(shí)驗(yàn)開始24 h內(nèi)無明顯反應(yīng), 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 也表現(xiàn)出游泳頻繁等現(xiàn)象。此外, 所有處理組幼魚均出現(xiàn)體色變淡的現(xiàn)象, 高濃度處理組體色變化快于低濃度處理組。

2.2 半致死濃度和安全濃度

氨氮急性脅迫對(duì)許氏平鲉幼魚的毒性效應(yīng)見表1, 幼魚死亡率隨TAN濃度升高而增加, 隨處理時(shí)間延長(zhǎng), 死亡率逐漸上升, 氨氮對(duì)幼魚的毒性作用受氨氮濃度和脅迫時(shí)間的雙重影響。

SPSS 17.0軟件概率單位加權(quán)回歸(Probit)法分析結(jié)果表明, 總氨氮(TAN)和非離子氨(NH3-N)對(duì)許氏平鲉24、48、72和96 h的半致死濃度分別為26.33、22.71、21.05、18.01 mg/L和0.39、 0.34、 0.31、 0.27 mg/L。TAN質(zhì)量安全濃度為1.80 mg/L, NH3-N質(zhì)量安全濃度為0.03 mg/L。

表1 許氏平鲉急性氨氮脅迫下累計(jì)死亡數(shù)量

2.3 血液生化指標(biāo)

血漿皮質(zhì)醇(Cor)含量變化受氨氮濃度、處理時(shí)間的顯著影響(圖1)。同一濃度下, 各處理組血漿Cor含量隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì), 處理12 h起始升高, 至72 h達(dá)最高值, 此后呈下降趨勢(shì); 同一處理時(shí)間, 高濃度處理組(20 mg/L)Cor含量自12 h顯著高于對(duì)照組和低濃度組(0和3.5 mg/L,<0.05), 96 h與對(duì)照組無顯著差異(>0.05), 低濃度組(3.5 mg/L組)Cor含量在整個(gè)處理期間略高于對(duì)照組, 兩者僅在72 h存在顯著性差異(<0.05)。

圖1 許氏平鲉血漿皮質(zhì)醇含量受氨氮脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度和處理時(shí)間對(duì)皮質(zhì)醇含量具有顯著影響, 兩者間交互作用無顯著性影響; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用對(duì)血漿血糖(GLU)含量有顯著影響(圖2)。同一濃度下, 對(duì)照組和低濃度處理組(3.5 mg/L)GLU含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)無顯著性變化, 而高濃度處理組(10 mg/L和20 mg/L)則隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì), 起始上升時(shí)間與濃度正相關(guān)。同一處理時(shí)間下, 20 mg/L組GLU含量在處理的6～12 h即顯著高于其余3組(<0.05), 隨后快速下降, 96 h顯著低于對(duì)照組和3.5 mg/L組(<0.05); 10 mg/L組GLU含量則在處理后12 h起始升高, 在24 h達(dá)最高值, 顯著高于對(duì)照組和3.5 mg/L處理組, 96 h與對(duì)照組相當(dāng); 3.5 mg/L組血糖含量在處理后期顯著高于高濃度處理組, 與對(duì)照組間無顯著性差異。

圖2 許氏平鲉血漿血糖含量受氨氮急性脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用對(duì)血糖含量均具有顯著影響; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

氨氮濃度、濃度和時(shí)間交互作用對(duì)血漿膽固醇(TCH)含量影響顯著, 處理時(shí)間對(duì)其含量無顯著性影響(圖3)。同一濃度下, 對(duì)照組和3.5 mg/L處理組血漿TCH含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)無顯著性變化, 10 mg/L處理組TCH含量則在96 h顯著高于其余時(shí)間(<0.05), 20 mg/L處理組TCH含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì), 于處理后12 h達(dá)最高值(<0.05)。同一處理時(shí)間下, 20 mg/L處理組TCH含量在處理的12 h顯著高于其余3組, 72 h后顯著低于其余各種; 低濃度處理組(3.5 mg/L和10 mg/L)處理48 h內(nèi)與對(duì)照組均無顯著性差異(>0.05), 72 h稍高于對(duì)照組, 96 h顯著高于對(duì)照組(<0.05)。

圖3 許氏平鲉血漿膽固醇含量受氨氮急性脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度和交互作用對(duì)膽固醇含量具有顯著影響, 處理時(shí)間對(duì)其影響不顯著; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

血氨(PA)濃度受氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用的顯著影響(圖4)。同一濃度下, 10 mg/L和20 mg/L組血氨濃度自12 h后達(dá)最高值(<0.05), 此后處于平臺(tái)期, 對(duì)照組和3.5 mg/L處理組PA濃度隨處理時(shí)間無顯著性變化(>0.05)。同一處理時(shí)間, 20 mg/L組12 h后PA濃度即顯著高于其他組(<0.05), 且始終保持最高值, 48 h后10 mg/L組PA濃度顯著高于對(duì)照組和3.5 mg/L處理組, 各處理組12 h后PA濃度與氨氮處理濃度呈正相關(guān)。

血漿還原型谷胱甘肽(GSH)含量受氨氮濃度、處理時(shí)間及二者的交互作用的顯著影響(圖5)。同一濃度下, 10 mg/L和20 mg/L處理組GSH含量隨處理時(shí)間呈先升后降的趨勢(shì), 響應(yīng)時(shí)間與濃度正相關(guān); 同一處理時(shí)間, 20 mg/L處理組GSH含量在6 h處達(dá)到最大值, 顯著高于其他組(<0.05), 24 h后則顯著低于其他組(<0.05), 10 mg/L組24 h前與對(duì)照組無顯著性差異, 至96 h顯著低于對(duì)照組和3.5 mg/L組(<0.05)。

圖4 許氏平鲉血漿血氨含量受氨氮急性脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用對(duì)血氨含量均具有顯著影響; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

圖5 許氏平鲉血漿還原型谷胱甘肽含量受氨氮急性脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用對(duì)還原型谷胱甘肽含量均具有顯著影響; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

血漿堿性磷酸酶(AKP)活性受氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用的顯著影響(圖6), 同一濃度下, 對(duì)照組和3.5 mg/L處理組血漿AKP活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)無顯著性變化, 10 mg/L處理組呈逐漸上升的趨勢(shì), 20 mg/L處理組AKP活性則呈先升后降的趨勢(shì), 于處理后48 h達(dá)最高值。同一處理時(shí)間下, 20 mg/L處理組AKP活性在處理的6 h即顯著高于其余3組, 72 h后與10 mg/L處理組無顯著性差異; 10 mg/L處理組72 h后顯著高于對(duì)照組和3.5 mg/L組; 3.5 mg/L處理組和對(duì)照組在整個(gè)處理周期內(nèi)均無顯著性差異。

圖6 許氏平鲉血漿堿性磷酸酶活性受氨氮急性脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用對(duì)堿性磷酸酶活性均具有顯著影響; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

氨氮濃度、處理時(shí)間對(duì)許氏平鲉血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性有顯著影響(圖7), 同一濃度下, 隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)照組及3個(gè)處理組ALT活性顯著性增高(<0.05), 至48 h后處于平臺(tái)期。同一處理時(shí)間下, 3個(gè)處理組ALT活性在處理的6 h即顯著高于對(duì)照組, 在48 h處活性最高, 各處理組間無顯著性差異。

圖7 許氏平鲉血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性受氨氮急性脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度和處理時(shí)間對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性含量具有顯著影響, 兩者間交互作用無顯著性影響; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

氨氮濃度、處理時(shí)間及其交互作用對(duì)許氏平鲉血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性有顯著影響(圖8), 同一濃度下, 3個(gè)處理組血漿AST活性都在12 h達(dá)到最高水平, 顯著高于處理前(<0.05)此后, 處于平臺(tái)期。同一處理時(shí)間, 3個(gè)處理組6 h后AST活性即顯著高于對(duì)照組(<0.05), 各處理組間除96 h外無顯著性差異。

圖8 許氏平鲉血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶活性受氨氮急性脅迫的變化

注: 雙因素方差分析結(jié)果表明, 氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用對(duì)谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均具有顯著影響; 柱形上方小寫字母表示同一濃度不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組之間的差異性; 大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間的差異性

3 討論

氨氮對(duì)魚類的毒性作用一般認(rèn)為是非離子氨(NH3-N)可穿過細(xì)胞膜, 經(jīng)過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)后進(jìn)入血液, 造成血液和組織中氨的積累, 導(dǎo)致機(jī)體缺氧[7-8], 刺激魚體興奮, 使魚類表現(xiàn)昏迷、窒息、死亡等行為特征[9-10]。此外, 氨氮脅迫會(huì)引起體內(nèi)激素和神經(jīng)遞質(zhì)的變化, 進(jìn)而影響魚類體色[11-13]。本研究中, 高濃度氨氮急性脅迫的許氏平鲉表現(xiàn)出呼吸急促、游竄掙扎、碰撞池壁和喪失平衡等癥狀以及體色變淡的體表色素變化, 與已報(bào)道的大菱鲆()[14]、斜帶石斑魚()[15]、黃顙魚()[16]、中華鳑鲏()[17]等魚類表現(xiàn)出相似的氨氮脅迫行為反應(yīng)。

半致死劑量(LC50)和質(zhì)量安全濃度(SC)是反映魚類對(duì)環(huán)境耐受力的重要指標(biāo)[18]。本研究中, 平均體質(zhì)量為(63.60±10.14) g[平均全長(zhǎng)(15.90±3.29) cm]的大規(guī)格許氏平鲉幼魚, 96 h TAN和NH3-N的LC50分別為18.01和0.27 mg/L, SC分別為1.80和0.03 mg/L。氨氮對(duì)魚類的毒性效應(yīng)除受水體pH、溫度和鹽度等影響外, 還與魚類品種、健康水平[19]和水中溶解氧含量[16]等相關(guān)。與已有研究相比, 許氏平鲉大規(guī)格幼魚NH3-N的半致死濃度(LC50, 96h)低于大菱鲆[14]、圓斑星鰈()[20]、半滑舌鰨()[21]等底棲性海水養(yǎng)殖魚類, 與斜帶石斑魚[15]、黃顙魚[16]、青魚()[22]、草魚()[23]等游泳性魚類相似, 這可能意味著游泳性魚類比底棲性海水魚類對(duì)氨氮更為敏感, 也可能與許氏平鲉生態(tài)習(xí)性相關(guān)。

魚類通過下丘腦-垂體-腎間組織(hypothalamic- pituitary-interrenal, HPI)軸的神經(jīng)和內(nèi)分泌反應(yīng)調(diào)節(jié)或適應(yīng)外界環(huán)境刺激[22, 24-25]。其中, 皮質(zhì)醇是魚類應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的重要標(biāo)志物[26-28]。本研究中, 各處理組血漿皮質(zhì)醇含量隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì), 20 mg/L處理組12 h時(shí)Cor含量達(dá)最高值, 48～72 h維持最高水平, 至96 h呈下降趨勢(shì), 這與其他魚類氨氮脅迫結(jié)果相似。高濃度氨氮脅迫對(duì)云紋石斑魚()[29]、大鱗副泥鰍()[30]和大菱鲆[14]血漿皮質(zhì)醇含量影響顯著, 血漿Cor含量分別在脅迫后的6 h、12 h和24 h達(dá)最大值, 證實(shí)皮質(zhì)醇同樣是魚類氨氮應(yīng)激的重要標(biāo)志物。

血糖(GLU)[31-32]和膽固醇(TCH)[33-34]等是判斷動(dòng)物健康的常用血液生化指標(biāo), 其含量受生理狀態(tài)和外界環(huán)境因子刺激的影響。本研究中, 高濃度(20 mg/L)氨氮急性脅迫初期(6～12 h)即可引起許氏平鲉血糖含量顯著上升, 這一規(guī)律在團(tuán)頭魴()[35]、大西洋鮭()[36]和斑點(diǎn)叉尾鮰()[37]等多種魚類得到驗(yàn)證。魚類血糖濃度在氨氮脅迫初期的快速升高可能是由于急性脅迫引起魚體對(duì)能量的額外需求, 肝糖原快速分解成葡萄糖進(jìn)入血液, 同時(shí)糖異生關(guān)鍵酶被激活, 糖異生作用增強(qiáng), 維持魚體能量和代謝平衡[35], 隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng), 肝糖原被大量分解, 機(jī)體內(nèi)相關(guān)酶活性降低, 糖異生反應(yīng)受阻, 血糖被消耗以繼續(xù)供應(yīng)能量, 導(dǎo)致血糖含量呈下降趨勢(shì)[36]。本研究中, 膽固醇的緩慢上升與皮質(zhì)醇含量的增加有相同趨勢(shì), 推測(cè)膽固醇可能參與了神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制中類固醇激素的產(chǎn)生[38-39], 但膽固醇含量波動(dòng)與氨氮脅迫時(shí)間無顯著的相關(guān)性, 不宜作為許氏平鲉氨氮脅迫的標(biāo)志物。

血氨與環(huán)境中氨氮濃度密切相關(guān), 是魚類氨氮脅迫的重要標(biāo)志物[40-41]。本研究中高濃度氨氮脅迫組(20 mg/L組)血氨濃度在12 h處顯著上升, 之后維持高水平; 中間濃度處理組(10 mg/L組)血氨48 h后顯著高于對(duì)照組, 48 h后各處理組血氨濃度與環(huán)境中氨氮濃度正相關(guān), 表明血氨是許氏平鲉氨氮脅迫的重要標(biāo)志物, 與已有研究結(jié)論一致。

氨氮脅迫可誘導(dǎo)水生動(dòng)物產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS), 從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)[36]。GSH作為重要的抗氧化酶, 可以清除體內(nèi)累積的ROS, 同時(shí)也是GST和GSH-PX兩種抗氧化酶進(jìn)行酶促反應(yīng)的底物[42-44]。許氏平鲉血漿GSH含量在高濃度處理組(20 mg/L組)脅迫6 h后達(dá)到最大值, 顯著高于處理前, 之后則快速下降, 這可能與高濃度氨氮導(dǎo)致鰓、肝臟和腎臟等組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)性損傷, 大量?jī)?nèi)源性GSH釋放進(jìn)入血清有關(guān), 從而導(dǎo)致GSH短暫快速升高[45-46]。而低濃度氨氮(10 mg/L)脅迫初期并不能造成機(jī)體組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性變化, 僅導(dǎo)致ROS的逐漸積累, GSH濃度的升高相對(duì)延后(48 h)。氨氮急性脅迫對(duì)魚類血漿GSH含量的影響在其他多種魚類得到相似結(jié)論[47-49], 表明GSH可以作為許氏平鲉氨氮脅迫的標(biāo)志物。

魚體健康狀態(tài)下, 血漿中AST和ALT含量相對(duì)較低, 當(dāng)肝臟、心臟組織細(xì)胞發(fā)生病變時(shí), 細(xì)胞膜通透性增加, 胞漿內(nèi)的酶釋放進(jìn)入血液, 會(huì)導(dǎo)致其血漿濃度升高, 因此AST和ALT是反映魚體應(yīng)激造成肝臟、心臟等組織細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志[50-51]。王琨等[52]通過將鯉魚()幼魚暴露在氨氮脅迫環(huán)境下, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)42 d后, 血漿ALT、AST活性呈不同程度升高, 其中AST更容易受到氨氮脅迫的影響, 表明其相比于ALT受到氨氮脅迫更敏感[52]。許氏平鲉血漿AST和ALT活性在急性氨氮脅迫初期即呈升高趨勢(shì), 暗示氨氮脅迫導(dǎo)致許氏平鲉肝細(xì)胞或心肌細(xì)胞受損, 但其上升幅度與氨氮濃度無顯著相關(guān)性, 因此, AST和ALT不宜作為許氏平鲉氨氮脅迫的標(biāo)志物。

堿性磷酸酶(AKP)是重要的非特異性免疫標(biāo)志酶, 存在于多種魚類組織, 具有防御和消化的雙重作用[53]。史文競(jìng)等[54]在克氏原螯蝦()氨氮脅迫中證實(shí), 血漿AKP含量受氨氮濃度的顯著影響, 點(diǎn)籃子魚()和哲羅魚()血漿AKP含量同樣受外界環(huán)境的影響[55-56]。許氏平鲉血漿AKP含量在高濃度氨氮脅迫初期(6 h)即顯著升高, 48 h達(dá)到峰值, 之后逐漸下降, 而低濃度組響應(yīng)時(shí)間則相對(duì)滯后。研究表明, 短時(shí)間內(nèi)高濃度氨氮即可導(dǎo)致細(xì)胞損傷, 釋放胞內(nèi)AKP酶, 使血漿AKP酶短時(shí)間快速升高[57], 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符, 而之后其活性下降則與魚類維持基本生命體征而降低自身新陳代謝水平有關(guān)[58], AKP可以作為許氏平鲉氨氮脅迫的重要標(biāo)志物。

綜上所述, 在水溫18.6 ℃, pH 7.85, 鹽度30和溶氧(8.6±0.5) mg/L的環(huán)境下, 許氏平鲉大規(guī)格幼魚(63.60±10.14) g TAN和NH3-N的96 h 半致死濃度(LC50)分別為18.01和0.27 mg/L。血漿GLU、PA、GSH、AKP和AST含量/活性受氨氮濃度、暴露時(shí)間及兩者交互作用的顯著影響, GLU、GSH和AKP含量/活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì), 隨氨氮濃度升高響應(yīng)時(shí)間提前; PA濃度與環(huán)境TAN濃度正相關(guān); 血漿GLU、和GSH 可以作為氨氮脅迫早期(6～12 h)的敏感指標(biāo), AKP和PA可以作為氨氮脅迫后期(48～96 h)的敏感指標(biāo)。

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Effect of acute ammonia stress on the plasma biochemicalindexes of

GAO Yun-tao1, 2, GAO Yun-hong1, WANG Jia-wei1, 2, LI Ming-yue1, QU Jiang-bo3, JIA Yu-dong1, MENG Zhen1

(1. Marine Fish Breeding and Biotechnology Laboratory, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Tianyuan Aquaculture Co., Ltd of Yantai Economic Development Zone, Yantai 264006, China)

This study aimed to investigate the tolerance ofand the corresponding changes in the plasma biochemical indexes under acute ammonia stress. The juveniles of(averaged body weight 63.60±10.14 g) were exposed to different concentrations of ammonia in a 96 h half-static toxicity test. At a water temperature of 18.6±0.5 ℃, pH 7.85, salinity 30, and dissolved oxygen concentration of 8.6±0.5 mg/L, the 96 h semilethal and safe concentrations of total ammonia (TAN) and nonionic ammonia were 18.01 and 0.27 mg/L and 1.80 and 0.03 mg/L, respectively. The TAN was set to four concentrations of 0, 3.5, 10, and 20 mg/L, and the effect of acute ammonia stress on the plasma biochemical indexes was studied. Two-way analysis of variance showed that the content of plasma glucose (GLU), ammonia (PA) and reduced glutathione (GSH), and the activity of alkaline phosphatase (AKP) and aspartate aminotransferase were significantly affected by ammonia concentration, processing time, and the combination of these parameters (<0.05). Plasma cortisol content and alanine aminotransferase activity were unaffected by the combination of different ammonia concentrations and the processing time. Plasma cholesterol was unaffected by the processing time. Plasma levels of GLU and GSH, along with AKP activity, initially increased and subsequently decreased with increasing treatment time, and the effect time advanced with increasing ammonia concentration. The PA concentration positively correlated with that of TAN. These results show that the content of GLU, GSH, PA, and AKP activity can be used as sensitive indicators of acute stress in. Therefore, this study provides guidance for breeding management and larvae transportation of.

; acute ammonia stress; plasma biochemical indexes

Mar. 6, 2021

[The Key Research and Development Program of Shandong Province, Nos. 2018YFJH0703, 2021SFGC0701; Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Chinese Academy of Fishery Sciences, No. 2019ZD1103]

S949

A

1000-3096(2023)8-0049-11

10.11759/hykx20210306001

2021-03-06;

2021-05-02

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFJH0703, 2021SFGC0701); 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2019ZD1103)

高云濤(1996—), 男, 內(nèi)蒙古赤峰人, 碩士研究生, 主要從事海水魚類高效養(yǎng)殖方向研究, E-mail: gytnzbz41489@163.com; 孟振(1981—), 通信作者, 男, 山東曲阜人, 副研究員, 主要從事海水魚類繁育與健康養(yǎng)殖方向研究, E-mail: mengzhen@ysfri.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)