納米模擬酶的制備與活性

沈 楠,華紹烽

(河南理工大學(xué),河南 焦作 454000)

天然酶自身的脆弱性與操作不穩(wěn)定性限制了其在酶催化系統(tǒng)中的廣泛應(yīng)用,納米模擬酶性能穩(wěn)定,成本低,既有納米材料的優(yōu)良特性,又有生物催化性能。因此,納米模擬酶成為一種新型生物催化劑[1]。

還原態(tài)氧化石墨烯(rGO)性能穩(wěn)定,其較大的比表面積[2]能夠減少磁性納米材料的聚集,催化位點豐富[3-5],可被用于酶固定化載體。銅基納米模擬酶因其銅離子價態(tài)間的高效轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)出良好的類酶活性,可催化H2O2[6]、酚類[7]和胺類[8-9]等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。Kim K等[10]研究表明,還原氧化石墨烯的褶皺結(jié)構(gòu)能夠保護銅納米顆粒不受過度氧化的影響,從而能夠形成穩(wěn)定的Cu-rGO復(fù)合材料。

將磁性納米粒子與Cu-rGO復(fù)合材料結(jié)合,形成磁性催化劑,在外部磁場作用下,容易從反應(yīng)體系中分離,從而獲得循環(huán)使用的模擬酶催化劑。同時改善磁性納米粒子易團聚效應(yīng)[11],適合工業(yè)化應(yīng)用。

本文通過同步還原法制備一種具有類過氧化氫酶活性的納米模擬酶(Cu-rGO),并將其與磁性納米粒子結(jié)合,進行XRD表征,研究其催化活性以及優(yōu)化反應(yīng)條件,最后用于H2O2分解實驗。

1 實驗部分

1.1 儀 器

紫外分光光度計,Ultrospec 7000,通用電氣公司;高速離心機,TG1650-W,湖南滬康離心機有限公司;磁力攪拌器TWCL-G,水浴鍋TWLL-G,鄭州生元儀器有限公司;超聲波清洗器,KX-1740QT,北京科璽世紀科技有限公司;轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀,SmartLab(9 kW),日本株式會社理學(xué)公司。

1.2 試 劑

石墨粉,8 000目,99.95%,上海麥克林生化科技有限公司;無水硫酸銅,分析純,天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;氫氧化鈉,分析純,天津市大陸化學(xué)試劑廠;過氧化氫,30%,煙臺市雙雙化工有限公司;無水乙酸鈉,分析純,洛陽市化學(xué)試劑廠;冰乙酸,分析純,天津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司;3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB),≥99.9%,上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇,分析純,煙臺市雙雙化工有限公司;六水合三氯化鐵,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氯化亞鐵,分析純,天津歐博凱化工有限公司;氨水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉,分析純,洛陽市化學(xué)試劑廠。

1.3 氧化石墨烯(GO)制備

采用修飾的Hummers法制備了氧化石墨烯[12]。磁力攪拌下,將1.0 g的NaNO3和44 mL濃硫酸添加到250 mL圓底燒瓶中,接著添加1.5 g石墨粉,在冰浴下將反應(yīng)體系冷卻至4 ℃以下。緩慢加入6 g KMnO4(使溫度控制在約10 ℃),繼續(xù)反應(yīng)20 min后,升溫至40 ℃,反應(yīng)2 h。然后將100 mL 去離子水緩慢滴加到反應(yīng)體系,升溫至85 ℃,反應(yīng)10 min,再緩慢滴加4.7 mL的H2O2(30%)。冷卻,產(chǎn)物經(jīng)HCl溶液(0.5 mol·L-1)離心洗滌,至上清液與BaCl2溶液不產(chǎn)生沉淀,之后由去離子水離心洗滌至中性。最后,冰水浴中超聲(250 W,40 kHz)40 min,離心,干燥,備用。

1.4 Cu-rGO制備[10]

將30 mL的GO水溶液(2 mg·mL-1)與27 mg的CuSO4混合,攪拌(10～15) min,加入2.1 mL的0.5 mol·L-1的NaOH,加熱至70 ℃,反應(yīng)5 min,此時顏色瞬間變成深灰色。自然冷卻至室溫,快速加入1.8 mL水合肼溶液(80%),攪拌40 min,反應(yīng)瓶中出現(xiàn)深紫色物質(zhì)。將產(chǎn)物用過量的乙醇離心洗滌,50 ℃真空干燥。

1.5 Fe3O4制備[13]

將FeCl2·4H2O溶液與FeCl3·6H2O溶液按物質(zhì)的量比1∶2混合,40 ℃水浴機械攪拌10 min,然后在該條件下緩慢滴加1.28 mol·L-1的NaOH,至pH=10,在氮氣氣氛下繼續(xù)反應(yīng)30 min,得到黑色顆粒(Fe3O4MNPs)。靜置,在外部磁場的作用下用去離子水離心洗滌數(shù)次,干燥,充氮氣保存。

1.6 Cu-rGO-Fe3O4制備

通過共沉淀法制備Cu-rGO-Fe3O4,將Cu-rGO與Fe3O4按質(zhì)量比2∶1進行混合,常溫攪拌15 h,在外界磁場作用下洗滌干燥。

2 結(jié)果與討論

2.1 XRD

在25 ℃和掃描速率10°·min-1條件下,采用軟件OriginPro 9.0分析得到的數(shù)據(jù),分析其晶體結(jié)構(gòu)。圖1為Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4和Fe3O4的XRD圖。

圖1 Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4和Fe3O4的XRD圖Figure 1 XRD patterns of Cu-rGO,Cu-rGO-Fe3O4 and Fe3O4

由圖1可以看出,2θ=43.4°、50.5°和74.2°的特征衍射峰,可以歸屬于Cu的(111)、(200)和(220)晶面,表明Cu2+在氧化石墨烯上的還原。Fe3O4的衍射峰出現(xiàn)在2θ=30.2°、35.5°、43.2°、53.5°、57.1°、62.7°和74.1°,依次對應(yīng)于(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)和(533)晶面,表明Fe3O4納米粒子的成功制備[14]。Cu-rGO-Fe3O4的XRD圖中,在2θ=50.5°存在Cu的特征衍射峰,對應(yīng)(111)晶面,在2θ=43.2°和74.1°的衍射峰強度大于Fe3O4在該處的峰強,表明Cu-rGO與Fe3O4的成功結(jié)合,并且反應(yīng)前后晶體結(jié)構(gòu)保存完好。

2.2 類過氧化物酶活性

(1) 相對活性

H2O2為反應(yīng)底物,TMB為顯色劑,測定Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的相對酶活性。將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,在50 ℃條件下反應(yīng),藍色顯色后,用紫外-可見分光光度計在652 nm處記錄吸光度。吸收峰強度越高,類過氧化物酶活性越高。

相對活性(%)=A1/A2×100%

式中,A1為記錄的吸光度,A2為一組中最大的吸光度。A1和A2是在相同條件下測量的吸光度。

(2) 活 性

取5支試管做實驗組,1支試管做空白組?？瞻捉M加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5),1 mL硫酸(8%),1.5 mL蒸餾水。實驗組加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)、1 mL硫酸(8%)、不同體積的H2O2(5.402 6 mg·mL-1)和不同體積的蒸餾水,構(gòu)成總體積4 mL的反應(yīng)體系?？瞻捉M調(diào)零,使用紫外分光光度計記錄240 nm處的吸光度,繪制H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取2支試管,1支為對照組,按順序加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5),0.1 mL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)、0.2 mL蒸餾水、1 mL硫酸(8%)和0.2 mL的H2O2(5.402 6 mg·mL-1)。另1支為實驗組,按順序加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)、0.1 mL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)、1.2 mL蒸餾水和0.2 mL的H2O2(5.402 6 mg·mL-1),反應(yīng)4 min后立即加入1 mL硫酸(8%)終止反應(yīng)。在240 nm處以蒸餾水調(diào)零,分別記錄對照組與實驗組的吸光度。Cu-rGO-Fe3O4的活性測定同上。

類過氧化物酶活性用每毫克酶在1 min內(nèi)消耗的H2O2的毫克數(shù)來表示。

式中,a,b為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程常數(shù);Ak為對照組吸光度;As為實驗組吸光度;t為時間,min;ω為酶的質(zhì)量,mg。

H2O2在Cu離子催化下產(chǎn)生羥基自由基·OH-,可使顯色劑TMB變?yōu)樗{色。為了研究Cu-rGO的類過氧化物酶活性,在H2O2存在條件下,以TMB作為顯色基質(zhì),記錄不同體系在50 ℃條件下反應(yīng)的顏色變化,不同反應(yīng)體系的紫外-可見吸收光譜和不同納米模擬酶的活性如圖2所示。

圖2 不同反應(yīng)體系的紫外-可見吸收光譜(a)和不同納米模擬酶的活性(b)Figure 2 UV-Vis absorption spectra of different reaction systems(a) and cctivity comparison of different nano-mimetic enzymes(b)

由圖2(a)可以看出,TMB+H2O2+Cu-rGO體系在652 nm處具有較強的吸收峰,其他三個反應(yīng)體系沒有明顯的吸收峰,表明Cu-rGO能夠催化H2O2,使TMB發(fā)生顏色反應(yīng),同時證實Cu-rGO具有類過氧化物酶活性。由圖2(b)可以看出,Cu-rGO的類過氧化物酶活性低于Cu-rGO-Fe3O4,這可能因為Fe3O4在Cu-rGO表面的附著減小了粒子之間的團聚效應(yīng),增大與底物的接觸面積從而提高酶催化活性。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 反應(yīng)溫度

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,在不同溫度下進行反應(yīng),利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖3為反應(yīng)溫度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響。

圖3 反應(yīng)溫度對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 3 Effects of temperature on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

由圖3可見,在(25～50) ℃,Cu-rGO-Fe3O4和Cu-rGO納米復(fù)合材料的類過氧化物酶活性均隨著反應(yīng)溫度升高逐漸升高,在反應(yīng)溫度50 ℃時,催化活性最強,之后隨反應(yīng)溫度的升高而下降。故Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.3.2 pH值

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL不同pH值的醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1)混合,在50 ℃條件下反應(yīng),利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖4為pH值對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響。由圖4可以看出,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4在pH=3.0時,催化活性最高,故Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的最適pH=3.0。

圖4 pH值對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 4 Effects of pH value on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

2.3.3 反應(yīng)時間

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,在50 ℃下反應(yīng),利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖5為反應(yīng)時間對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響。

圖5 反應(yīng)時間對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 5 Effects of reaction time on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

由圖5可以看出,反應(yīng)時間500 s前,Cu-rGO的催化速率比Cu-rGO-Fe3O4快。反應(yīng)500 s后,Cu-rGO的催化活性顯著減小,而Cu-rGO-Fe3O4在反應(yīng)600 s時催化活性最高。故Cu-rGO的最佳反應(yīng)時間為500 s,Cu-rGO-Fe3O4的最佳反應(yīng)時間為600 s。

2.3.4 重復(fù)性

將30 μL的TMB、6 mg的Cu-rGO-Fe3O4、15 μL蒸餾水、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,50 ℃下反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后在外界磁場的作用下分離Cu-rGO-Fe3O4,用去離子水洗滌數(shù)次,進行下一次循環(huán)實驗。每次循環(huán)實驗使用紫外分光光度計在652 nm處記錄吸光度。圖6為Cu-rGO-Fe3O4反應(yīng)4個循環(huán)后的相對活性。

圖6 Cu-rGO-Fe3O4反應(yīng)4個循環(huán)后的相對活性Figure 6 Relative activity of Cu-rGO-Fe3O4 after four cycles

由圖6可以看出,Cu-rGO-Fe3O4循環(huán)反應(yīng)4次后仍具有80%的催化活性,并且在循環(huán)使用過程中酶活性下降緩慢。

2.3.5 TMB濃度

選擇30 μL不同濃度的TMB溶液(0.625 mmol·L-1、1.25 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、3.75 mmol·L-1、5 mmol·L-1、7.5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、15 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1)與15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、100 μL的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合反應(yīng),利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖7為TMB濃度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響。

圖7 TMB濃度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 7 Effects of TMB concentration on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

由圖7可見,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的催化活性都隨著TMB濃度的增大而升高,當(dāng)TMB濃度為20 mmol·L-1時達到最大催化活性。因此,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4的最適TMB濃度為20 mmol·L-1。

2.3.6 H2O2濃度

保持TMB濃度不變,選擇100 μL不同濃度的H2O2溶液(0.8 mmol·L-1、1 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、100 mmol·L-1、150 mmol·L-1、200 mmol·L-1、300 mmol·L-1)與15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)或15 μL的Cu-rGO-Fe3O4(2 mg·mL-1)、30 μL的TMB和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合反應(yīng),利用紫外分光光度計記錄吸光度。圖8為H2O2濃度對Cu-rGO、Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響。由圖8可見,當(dāng)H2O2濃度為(0.8～30) mmol·L-1,Cu-rGO的催化活性隨著H2O2濃度的增大而逐漸增強;當(dāng)H2O2濃度為30 mmol·L-1時達到最大催化活性,之后隨著H2O2濃度的增大而緩慢減小。Cu-rGO-Fe3O4在H2O2濃度為20 mmol·L-1時達到最大催化活性。因此,Cu-rGO的最適H2O2濃度為30 mmol·L-1,Cu-rGO-Fe3O4的最適H2O2濃度為20 mmol·L-1。

圖8 H2O2濃度對Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4納米復(fù)合材料類過氧化物酶活性的影響Figure 8 Effects of H2O2 concentration on peroxidase-like activity of Cu-rGO and Cu-rGO-Fe3O4 nanocomposites

2.4 底物H2O2濃度范圍

將30 μL的TMB、15 μL的Cu-rGO(2 mg·mL-1)、100 μL不同濃度的H2O2和2.855 mL醋酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1、pH=3.0)混合,50 ℃下反應(yīng)500 s,記錄紫外分光光度計在652 nm處的吸光度。Cu-rGO-Fe3O4檢測底物H2O2濃度范圍的方法同上。圖9為Cu-rGO-Fe3O4和Cu-rGO催化反應(yīng)的吸光度與H2O2濃度的線性關(guān)系。

圖9 Cu-rGO-Fe3O4和Cu-rGO催化反應(yīng)的吸光度與H2O2濃度的線性關(guān)系Figure 9 The linear relationship between the absorbance with concentrations of hydrogen peroxide using Cu-rGO-Fe3O4 and Cu-rGO catalyst

由圖9(a)可以看出,Cu-rGO-Fe3O4在(0.52～100) μmol·L-1,H2O2濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系,檢出限約0.38 μmol·L-1。由圖9(b)可以看出,Cu-rGO在(1.04～100) μmol·L-1,H2O2濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系,檢出限約1.0 μmol·L-1。因此,Cu-rGO-Fe3O4的靈敏度更高,檢測范圍更廣,具有更好的檢測性能。

3 結(jié) 論

采用同步還原法制備了納米模擬酶Cu-rGO,通過共沉淀法制備磁性納米模擬酶Cu-rGO-Fe3O4,二者具有類似的最適反應(yīng)溫度與最適pH值,Cu-rGO的最佳反應(yīng)時間為500 s,Cu-rGO-Fe3O4的最佳反應(yīng)時間為600 s,Cu-rGO的類過氧化物酶活性低于Cu-rGO-Fe3O4。Cu-rGO-Fe3O4循環(huán)使用4次后仍具有80%的相對活性,表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。Cu-rGO的最佳H2O2和TMB濃度分別為30 m mol·L-1和20 m mol·L-1,Cu-rGO-Fe3O4的最佳H2O2和TMB濃度分別為20 m mol·L-1和20 m mol·L-1。Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4對H2O2濃度的檢出限分別約為1.04 μmol·L-1和0.5 μmol·L-1,Cu-rGO-Fe3O4的靈敏度更高,對H2O2具有更好的檢測性能。其中,Cu-rGO和Cu-rGO-Fe3O4對H2O2的選擇性,需要進一步條件優(yōu)化。