我國甘薯E病毒全基因組序列特征及熒光定量檢測技術(shù)的建立

唐偉，張成玲，楊冬靜，馬居奎，陳晶偉，高方園，謝逸萍，孫厚俊

我國甘薯E病毒全基因組序列特征及熒光定量檢測技術(shù)的建立

唐偉，張成玲，楊冬靜，馬居奎，陳晶偉，高方園，謝逸萍，孫厚俊

江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所/甘薯育種農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點實驗室，江蘇徐州 221131

【目的】甘薯E病毒（sweet potato virus E，SPVE）是甘薯上新發(fā)現(xiàn)的一種病毒。本研究對我國甘薯E病毒江蘇徐州分離物（SPVE-XZ）的全基因組序列進行測定，分析該病毒基因組序列特征，并建立針對SPVE的熒光定量（quantitative PCR，qPCR）檢測技術(shù)，為監(jiān)測SPVE發(fā)生分布、檢測種薯種苗中SPVE帶毒情況并及時防控該病毒提供理論依據(jù)和技術(shù)支持?！痉椒ā坎捎胹mall RNA深度測序，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得SPVE-XZ的全基因組序列，利用MegAlign、Mega11等軟件對獲得的全基因組序列進行序列比對、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。設(shè)計SPVE熒光定量檢測引物，并通過對退火溫度及引物濃度的優(yōu)化，建立針對SPVE的qPCR檢測方法，測定其特異性和靈敏度，應(yīng)用于江蘇省和山東省田間甘薯樣品的檢測?！窘Y(jié)果】除ploy(A)外，所獲得的SPVE-XZ全基因組序列全長為10 919 nt，包含1個長為10 560 nt的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼3 519 aa的多聚蛋白。5′非翻譯區(qū)（5′ untranslated region，5′UTR）和3′非翻譯區(qū)（3′UTR）分別為129和230 nt。在P1和P3蛋白內(nèi)分別包含由移碼產(chǎn)生的PISPO和PIPO蛋白。全基因組序列分析表明，SPVE-XZ與韓國SPVE GS分離物（SPVE-GS）全基因組核苷酸一致率最高，為98.6%，多聚蛋白氨基酸一致率為98.5%。利用鄰接法基于基因核苷酸序列和多聚蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，SPVE-XZ與SPVE-GS均聚類在一起。建立的SPVE熒光定量檢測體系可檢測到SPVE，而甘薯病毒2（sweet potato virus 2，SPV2）、甘薯C病毒（sweet potato virus C，SPVC）、甘薯G病毒（sweet potato virus G，SPVG）、甘薯羽狀斑駁病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯褪綠矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯潛隱病毒（sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯褪綠斑病毒（sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）均未能檢測到；靈敏度可達3.12×102copies/μL，是常規(guī)PCR 100倍。應(yīng)用建立的qPCR檢測方法，在山東省采集的6個樣品和江蘇省采集的52個樣品中，分別在1個樣品和13個樣品中檢測到SPVE。【結(jié)論】SPVE-XZ的全基因組大小為10 919 nt，與韓國SPVE-GS基因組結(jié)構(gòu)一致；建立的qPCR檢測體系對SPVE靈敏度高、特異性強，可用于對SPVE的快速檢測。

甘薯；甘薯E病毒；全基因組；系統(tǒng)進化分析；qPCR檢測

0 引言

【研究意義】甘薯（）屬于旋花科（Convolvulaceae），是一種塊根植物。由于甘薯富含纖維素、維生素、碳水化合物等多種營養(yǎng)物質(zhì)，并且具有耐旱、高產(chǎn)等特點，目前作為一種重要的糧食作物及工業(yè)原料，在世界100多個國家及地區(qū)廣泛種植[1]。我國是世界上最大的甘薯種植國，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的一半以上[2]。甘薯E病毒（sweet potato virus E，SPVE）是近年來甘薯上新發(fā)現(xiàn)的一種馬鈴薯Y病毒屬病毒，可能對甘薯產(chǎn)量及品質(zhì)造成巨大威脅[3]。明確我國SPVE全基因組序列及其分子特征，建立快捷高效、準(zhǔn)確靈敏的檢測技術(shù)，實現(xiàn)對SPVE遺傳進化及分子變異等方面的深入研究以及我國SPVE發(fā)生與危害的監(jiān)控，對于科學(xué)指導(dǎo)病毒防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】病毒病是甘薯上的重要病害，可以造成甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)下降。至2012年全世界報道的侵染甘薯病毒有30多種[4]，我國目前已報道了20多種侵染甘薯的病毒[5-7]，其中甘薯羽狀斑駁病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）等馬鈴薯Y病毒屬病毒和甘薯褪綠矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）復(fù)合侵染甘薯會產(chǎn)生協(xié)生現(xiàn)象[8]，導(dǎo)致更加嚴重的癥狀，影響甘薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。其中，SPFMV、SPCSV、甘薯C病毒（sweet potato virus C，SPVC）、甘薯病毒2（sweet potato virus 2，SPV2）以及甘薯G病毒（sweet potato virus G，SPVG）等病毒的全基因序列已報道[9-14]。在檢測方法上，針對SPFMV、SPCSV、SPVC、SPVG和SPV2等病毒建立了RT-PCR、qPCR及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶聚合酶恒溫擴增（recombinase polymerase isothermal amplification，RPA）等一系列檢測技術(shù)[15-18]。但隨著近幾年檢測技術(shù)的發(fā)展和研究深入，在甘薯中發(fā)現(xiàn)了一些新的病毒，如四川甘薯卷葉病毒1（sweet potato leaf curl China Sichuan virus 1，SPLCSV-1）、河南甘薯卷葉病毒（sweet potato leaf curl Henan virus，SPLCHnV）等[19-20]，其中2020年Jo等在韓國發(fā)現(xiàn)并報道SPVE侵染甘薯[3]。目前對該病毒研究不多，Jo等獲得了SPVE GS分離物（SPVE-GS）的全基因組序列，其大小為10 890 nt，編碼3 219個氨基酸的多聚蛋白，并建立了SPVE RT-PCR檢測技術(shù)[3]。SPVE-GS編碼的多聚蛋白通過水解產(chǎn)生10個蛋白，并且在P1和P3蛋白里各包含1個由移碼產(chǎn)生的基因，分別為PISPO和PIPO[3,21-24]。【本研究切入點】由于SPVE發(fā)現(xiàn)時間晚，目前全球報道的該病毒全基因組序列較少，中國分離物尚未見報道。此外，對SPVE的分子檢測只有RT-PCR的方法，未見qPCR技術(shù)應(yīng)用于SPVE檢測的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過small RNA測序結(jié)合RT-PCR分段擴增及RACE技術(shù)，檢測徐州地區(qū)甘薯病毒樣品，擴增獲得SPVE徐州分離物全基因組序列并分析其基因組結(jié)構(gòu)，同時建立快捷、高效、準(zhǔn)確的分子檢測技術(shù)，為該病毒的早期預(yù)警及田間檢測提供技術(shù)支持，并為該病毒的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2022年在江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所完成。

1.1 材料

SPVE-XZ病樣采自江蘇省徐州市江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所甘薯田，甘薯檢測樣品采自山東省和江蘇省甘薯田。樣品采集后，及時置于-80℃超低溫冰箱保存。

FastPure Universal Plant Total RNA提取試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、末端轉(zhuǎn)移酶、Rnase H、dATP、pMD-18T載體等購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×T5 Taq PCR Mix、Taq PCR Mix、大腸桿菌感受態(tài)TOP10為北京擎科生物科技股份有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；TruSeqTMSmall RNA Sample Prep Kits為美國Illumina公司產(chǎn)品；pTOPO為北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 甘薯總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及small RNA測序

甘薯病樣0.1 g，用液氮迅速研磨成粉末，采用RNA提取試劑盒說明書所述方法提取甘薯病樣總RNA，并將RNA送浙江杭州聯(lián)川生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司?？俁NA按照TruSeqTMSmall RNA Sample Prep Kits試劑盒說明書所述方法制備小RNA測序文庫。經(jīng)質(zhì)量檢測合格后利用Illumine Hiseq 2500進行small RNA深度測序。測序所得序列去除接頭序列和低質(zhì)量序列，用Velvet 1.0.5軟件通過多重序列比對方法拼接成contigs，進行BLAST比對分析。

1.3 SPVE基因組序列擴增

根據(jù)拼接得到的序列及NCBI上SPVE序列，設(shè)計SPVE全基因組擴增特異性引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司（上海生工）進行合成。以甘薯病樣總RNA為模板，使用特異性R端引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以獲得的cDNA為模板進行RT-PCR擴增。擴增體系為2×T5 mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序為98 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，退火（溫度參考表1）20 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃終延伸2 min。3′RACE操作以提取的RNA為模板，以M4T為引物進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用引物SPVE-F6和M4T進行PCR擴增[25]；5′RACE采用Scotto-Lavino等經(jīng)典RACE（classic RACE）方法進行擴增[26]。

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段進行回收后連接至pTOPO載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，涂布含有氨芐青霉素的LB平板上，選取3個經(jīng)PCR驗證后的陽性單菌落送上海生工進行測序。

1.4 SPVE基因組序列分析

利用DNASTAR中的SeqMan對測得的各片段序列進行拼接，利用DNASTAR中EditSeq分析所獲得全基因組序列的ORF。從NCBI上下載SPFMV、SPVC、SPV2、SPVG、甘薯潛隱病毒（sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯輕斑駁病毒（sweet potato mild mottle virus，SPMMV）等病毒的全基因組序列利用ClustalX2進行序列比對，利用MEGA11軟件包中鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap值設(shè)為1 000[27]。

1.5 SPVE qPCR檢測體系的構(gòu)建與優(yōu)化

根據(jù)所獲得的SPVE全基因組序列及NCBI上SPVE全基因序列與SPFMV、SPVC、SPV2、SPVG等病毒全基因組序列進行比對，在和3′UTR中設(shè)計出擴增大小為236 bp片段的SPVE特異性檢測引物對（SPVE-qPCR-F：5′-CAATTCGACAACACCCGCT -3′，同SPVE-F6；SPVE-qPCR-R：5′-GACAACATAAG TAGATTTTAAAGGC-3′），并以SPVE-qPCR-R引物對病樣進行反轉(zhuǎn)錄，以特異性檢測引物進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳，所獲得的目的片段回收后連接到pMD18-T載體上，獲得陽性克隆，送上海生工進行序列測定。將測序正確的克隆提取質(zhì)粒，利用NanoDrop1000測定質(zhì)粒濃度。

表1 用于SPVE全基因序列擴增引物

以陽性質(zhì)粒為模板，對熒光定量擴增時的退火溫度進行優(yōu)化，設(shè)置5個退火溫度分別為55.0、56.5、58.0、59.5、61.0 ℃，按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8.2 μL，SPVE-qPCR-F/R各0.4 μL，質(zhì)粒模板1 μL的體系，在95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)40次的程序進行qPCR，試驗重復(fù)3次。在優(yōu)化后的反應(yīng)退火溫度條件下，以SPVE陽性質(zhì)粒為模板，分別在引物終濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 μmol·L-1的條件下進行qPCR反應(yīng)，試驗重復(fù)3次，選擇最優(yōu)的引物濃度。

1.6 SPVE qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過公式：拷貝數(shù)（copies/μL）=（6.02×1023copies/mol×質(zhì)粒濃度）/（質(zhì)粒核苷酸堿基數(shù)×660）計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，以3.12×102—3.12×106copies/μL的質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化的檢測體系進行qPCR?？截悢?shù)除以3.12后的lg值與其相應(yīng)質(zhì)粒的模板進行擴增得到的CT值，進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.7 SPVE qPCR檢測體系特異性、靈敏度及田間樣品檢測

以田間收集并檢測的SPFMV、SPV2、SPVC、SPCSV、SPVG、SPLV、甘薯褪綠斑病毒（sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）以及SPVE等RNA病毒病樣，以1.5的方法獲得cDNA為模板，參照優(yōu)化后的檢測體系進行qPCR檢測。

將SPVE陽性質(zhì)粒以10倍濃度梯度依次稀釋，最終稀釋成3.12×100—3.12×107copies/μL 8個不同濃度的質(zhì)粒。分別以上述不同濃度的質(zhì)粒為模板參照優(yōu)化后的qPCR檢測體系進行檢測。再以上述質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增體系為Taq PCR Mix預(yù)混液12.5 μL，模板1 μL，引物對SPVE-qPCR-F/SPVE-qPCR-R各1 μL，ddH2O補足至25 μL，在PCR擴增儀上進行擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，59.5 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。

在山東、江蘇省分別采集6、52株病毒侵染病樣，采用優(yōu)化的qPCR檢測體系進行檢測。

1.8 數(shù)據(jù)分析及圖像繪制

使用SPSS 25軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。使用Origin 2019b軟件繪制熒光定量擴增曲線圖，利用Excel 2019軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。熱圖繪制使用R 3.0.1軟件。

2 結(jié)果

2.1 small RNA深度測序結(jié)果

將病毒侵染的甘薯病葉樣品經(jīng)small RNA測序后，得到26 358 439個原始reads，去除接頭序列和低質(zhì)量序列獲得22 969 139 clean reads。經(jīng)Velet1.0.5軟件拼接后，獲得796個contigs，對獲得的序列進行分離注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病樣中包含SPFMV、SPLV、SPCSV、sweet potato badnaviruse A和sweet potato badnaviruse B等病毒。除此之外，有28個contigs與SPVE-GS全基因組核苷酸一致率在96.8%—100%。并依據(jù)SPVE基因組進行其small RNA片段拼接熱點圖的繪制（圖1），拼接獲得的序列占SPVE基因組的99.96%。

橫坐標(biāo)代表SPVE-GS基因組相對位置，縱坐標(biāo)代表small RNAs映射到基因組正義鏈（紅色）和負義鏈（藍色）的數(shù)量

2.2 SPVE全基因組測序及序列分析

通過RT-PCR擴增及片段拼接獲得SPVE-XZ全基因組序列，除Poly(A)外，SPVE-XZ全基因組序列長度為10 919 nt，較SPVE-GS全基因組10 890 nt多29 nt，上傳至GenBank，獲得序列號為OQ968082。SPVE-XZ全基因組序列中5′非翻譯區(qū)（5′ untranslated region，5′UTR）為129 nt，其中包含較多的CAA重復(fù)序列，相較于SPVE-GS 5′UTR少3 nt；3′非翻譯區(qū)（3′UTR）為230 nt，相較于SPVE-GS 3′UTR多32 nt。

SPVE-XZ全基因組中包含一個10 560 nt的開放閱讀框，編碼3 519個氨基酸的多聚蛋白，被病毒水解酶酶切形成10個成熟蛋白，分別為P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP，9個酶切位點分別為IEQF/S、YLVG/G、VEHQ/G、VYHQ/S、VLHQ/T、VTHQ/G、VSHE/S、VYAQ/A、VYHQ/S。在P1和P3中存在由G2A6移碼產(chǎn)生的PISPO和PIPO蛋白。利用MegAlign進行氨基酸和核苷酸的序列比對，發(fā)現(xiàn)SPVE-XZ與SPVE-GS全基因組核苷酸一致率為98.6%，多聚蛋白氨基酸一致率為98.5%。

2.3 SPVE系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確SPVE-XZ分類地位，以SPMMV為外組，基于SPVE以及SPFMV、SPV2、SPVC、SPVE、SPLV等病毒的外殼蛋白（coat protein，）基因核苷酸序列以及病毒基因組多聚蛋白氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果表明，無論是以核苷酸序列還是以病毒基因組多聚蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，SPVE-XZ與SPVE-GS均聚類在同一分支上（圖2）。

利用MEGA 11軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展值低于70%的數(shù)值不顯示

2.4 SPVE qPCR檢測體系優(yōu)化

以SPVE陽性質(zhì)粒為模板，在55.0、56.5、58.0、59.5、61.0 ℃退火溫度下進行qPCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，qPCR在不同退火溫度條件下均產(chǎn)生了擴增曲線，退火溫度在55.0—59.5 ℃時，CT值無顯著性差異，其中退火溫度為59.5 ℃時擴增CT值最低，為18.06（圖3），同時考慮到效率與節(jié)能，選用59.5 ℃的退火溫度進行后續(xù)試驗。

在優(yōu)化后的反應(yīng)退火溫度為59.5 ℃的條件下，以SPVE陽性質(zhì)粒為模板，分別加入終濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 μmol·L-1的引物條件下進行qPCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，在不同引物濃度條件下，各樣品均產(chǎn)生了擴增曲線，其中在引物終濃度為0.15 μmol·L-1時，擴增CT值最低，為16.22，且與其他濃度有顯著性差異，故最佳引物終濃度為0.15 μmol·L-1（圖4）。

圖3 不同溫度下的CT值

圖4 不同引物濃度下的擴增曲線和CT值

2.5 SPVE qPCR檢測特異性

對收集到的含有CMV、SPFMV、SPV2、SPVC、SPCSV、SPVG、SPLV、SPCFV和SPVE等RNA病毒的病樣，按照建立的qPCR檢測體系進行檢測。結(jié)果顯示，僅在SPVE病樣中出現(xiàn)擴增曲線，CT值為20.00，其余病毒樣本無擴增曲線出現(xiàn)，說明所建立的檢測方法對SPVE具有較好的特異性（圖5）。

2.6 SPVE qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

以濃度為3.12×102—3.12×106copies/μL的質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化的檢測體系進行qPCR。結(jié)果顯示，樣品模板濃度在3.12×102—3.12×106copies/μL范圍內(nèi)，與CT值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。所獲標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.4243，線性回歸方程為=-3.4243+39.785，各樣品均產(chǎn)生了擴增曲線，相關(guān)系數(shù)2=0.9975，擴增效率為95.9%（圖6）。

圖5 SPVE qPCR引物特異性檢測

以不同稀釋濃度梯度的質(zhì)粒為模板進行qPCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠擴增到濃度為3.12×102copies/μL的質(zhì)粒樣品，而常規(guī)PCR只能擴增到濃度為3.12×104copies/μL的質(zhì)粒樣品（圖7），qPCR檢測靈敏度是常規(guī)PCR檢測靈敏度的100倍。

圖6 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

B：1—8：濃度為3.12×107—3.12×100 copies/μL的質(zhì)粒模板the plasmid from 3.12×107 to 3.12×100 copies/μL；M：DL 1000 marker

2.7 SPVE樣品qPCR檢測

將采自山東省的6個樣品和采自江蘇省的52個樣品，利用建立的qPCR體系進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采自山東省的6個樣品中有1個樣品檢測到SPVE，采自江蘇省的52個樣品中有13個樣品檢測到SPVE，與采用常規(guī)PCR的檢測結(jié)果一致。

3 討論

3.1 Small RNA深度測序

Small RNA深度測序技術(shù)已是病毒檢測的常規(guī)方法之一，該方法具有精準(zhǔn)度高、檢測種類全的特點，已在番茄、辣椒等多種作物病毒病病原檢測上進行了應(yīng)用[28-29]。而在新病毒的發(fā)現(xiàn)上small RNA深度測序及RNA-seq等二代測序獨具優(yōu)勢，通過此類技術(shù)在柑橘上發(fā)現(xiàn)了citrusleprosis virus cytoplasmic type 2[30]，在牡丹上發(fā)現(xiàn)了peony yellowing-associated citrivirus（PYaCV）、peony betaflexivirus 1（PeV1）、peony leafroll-associated virus（PLAV）[31]，在甘薯上發(fā)現(xiàn)了SPVE、sweet potato badnaviruse A、sweet potato badnaviruse B和甘薯無癥病毒1（sweet potato symptomless virus 1，SPMSV-1）等病毒[3,32]。本研究同樣利用small RNA深度測序技術(shù)在甘薯病樣中檢測到SPFMV、SPLV、SPCSV、sweet potato badnaviruse A和sweet potato badnaviruse B等病毒，并檢測到SPVE，且SPVE也可以與其他病毒一起復(fù)合侵染甘薯。

3.2 SPVE全基因組序列分析

目前我國已經(jīng)報道了SPV2、SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC等病毒的全基因組序列[9-14]，但甘薯E病毒是新發(fā)現(xiàn)的甘薯病毒，在中國沒有全基因組序列的報道，本研究獲得的SPVE-XZ全長基因組為進一步研究SPVE遺傳結(jié)構(gòu)打下了基礎(chǔ)。SPVE-XZ全基因組序列為10 919 nt，較SPVE-GS分離物多29 nt。SPVE-XZ與SPVE-GS P1和HC-Pro之間的水解酶酶切位點均為IEQF/S，這與SPVC、SPV2中P1和HC-Pro之間水解酶酶切位點的F/S一致，與SPFMV、SPVG中P1和HC-Pro之間水解酶酶切位點的Y/S不一致。SPVE中5′UTR包含較多的CAA重復(fù)序列，這可能對病毒基因組的翻譯具有促進作用[33]，在其他馬鈴薯Y病毒屬病毒如甘蔗花葉病毒（sugarcane mosaic virus，SCMV）中也有發(fā)現(xiàn)[34]。從系統(tǒng)進化樹上看，SPVE和SPVC的親緣關(guān)系更近，這與韓國分離物的分析結(jié)果一致。SPVE有與SPFMV和SPVC等病毒相似的基因組結(jié)構(gòu)，在P1和P3中存在移碼產(chǎn)生的PISPO和PIPO，在與SPCSV復(fù)合侵染甘薯時，也可能發(fā)生協(xié)生作用，導(dǎo)致甘薯產(chǎn)生更加嚴重的癥狀[35]。但不同的是SPVE中為2 076 bp，較SPFMV（NC001841）的（1 980 bp）、SPVC（NC014742）的（1 962 bp）、SPVG（NC018093）的（1 809 bp）和SPV2（NC017970）的（1 854 bp）更長。是馬鈴薯Y病毒屬中變異最大的基因[36]，盡管已有研究發(fā)現(xiàn)P1蛋白具有結(jié)合ss-RNA和增強異源病毒致病力的能力[37-38]，但P1蛋白的功能目前仍了解不深，甘薯E病毒中P1蛋白的功能有待進一步研究。

3.3 SPVE qPCR檢測體系

目前常用的檢測甘薯病毒的方法有嫁接指示植物法、抗血清檢測法[39]，以及PCR、LAMP和RPA等分子檢測方法[15-18]，目前對于SPVE的檢測，僅有韓國報道的RT-PCR方法[3]。qPCR在甘薯及其他作物病毒檢測上也有應(yīng)用，如盧會翔等[16]建立了SPFMV和SPCSV的qPCR檢測技術(shù)；孫曉輝等[40]建立了甜瓜黃斑病毒（melon yellow spot virus）qPCR檢測體系。本研究建立的qPCR具有對SPVE的特異性，能夠?qū)PVE與CMV、SPFMV、SPVC、SPCFV等病毒進行區(qū)分，不僅能夠?qū)PVE進行定性檢測，也可以對SPVE進行定量檢測。qPCR檢測靈敏度是常規(guī)RT-PCR的100倍，提高了對SPVE的檢測極限。在采自山東省和江蘇省的樣品中均檢測到SPVE，說明SPVE在我國已經(jīng)較為普遍，因此可以加大對不同地區(qū)樣品的檢測，一方面了解SPVE在我國的分布發(fā)生情況，另一方面可以根據(jù)不同地區(qū)SPVE基因序列進行分析，明確SPVE在我國發(fā)生的群體遺傳結(jié)構(gòu)。由于甘薯無性繁殖的特性，種苗運輸在我國非常頻繁，因此病毒病的擴散流行威脅極大，生產(chǎn)上要加大對SPVE等病毒的監(jiān)測，特別是種苗種薯的監(jiān)測，及早發(fā)現(xiàn)，及時防控，避免SPVE對甘薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展造成的危害。

4 結(jié)論

SPVE-XZ的全基因組大小為10 919 nt，序列分析結(jié)果表明，SPVE-XZ和韓國SPVE-GS基因組結(jié)構(gòu)一致，核苷酸一致率為98.6%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPVE-XZ與SPVE-GS聚類在同一分支。建立了針對SPVE的快捷、高效、靈敏的qPCR檢測技術(shù)，其靈敏度是常規(guī)RT-PCR的100倍，可以用于SPVE的快速檢測。

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Complete Genomic Sequence Characteristics and Establishment of qPCR Detection Technique of Sweet Potato Virus E in China

TANG Wei, ZHANG ChengLing, YANG DongJing, MA JuKui, CHEN JingWei, GAO FangYuan, XIE YiPing, SUN HouJun

Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Xuhuai Area/Institute of Sweet potato, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweet potato, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Xuzhou 221131, Jiangsu

【Objective】Sweet potato virus E (SPVE) is a novel virus infecting. The objectives of this study are to determine the complete genomic sequence of SPVE Xuzhou isolate (SPVE-XZ) in China, analyze the genomic sequence characteristics of SPVE-XZ, and develop the quantitative PCR (qPCR) assay for the specific detection of SPVE. This study will provide theoretical basis and technical support for the detection, monitoring and controlling SPVE in China.【Method】The complete genomic sequence of SPVE-XZ was obtained by using small RNA deep sequencing, combined with RT-PCR and RACE technologies. The sequence alignment and phylogenetic relationship analysis of SPVE-XZ were performed by using software MegAlign and Mega11. The primers of qPCR for rapid detection of SPVE were designed, and the qPCR detection method for SPVE was established by optimizing the annealing temperature and primer concentration. The specificity and sensitivity of the qPCR were determined. The developed qPCR technology was used to detect sweet potato samples collected from Jiangsu Province and Shandong Province.【Result】The complete genomic sequence of SPVE-XZ was 10 919 nt, excluding the 3′-terminal poly (A) tail, containing the typical open reading frame of 10 560 nt in length and encoding a putative large polyprotein of 3 519 amino acids. The 5′UTR and 3′UTR of SPVE-XZ were 129 and 230 nt, respectively. PISPO and PIPO were produced with the frameshift in P1 and P3, respectively. Genomic sequence analysis showed that the genomic nucleotide sequence identity between SPVE-XZ and Korean SPVE-GS isolate was 98.6%, and the amino acid sequence identity of polyprotein between them was 98.5%. Phylogenetic trees were constructed based on the coat protein gene sequences and polyprotein amino acid sequence using the neighbor-joining method. The result showed that SPVE-XZ was clustered with SPVE-GS in these phylogenetic analyses. The established qPCR method could detect SPVEspecifically, however sweet potato virus 2(SPV2),sweet potato virus C (SPVC), sweet potato virus G (SPVG),sweet potato feathery mottle virus(SPFMV), sweet potato chlorotic stunt virus(SPCSV), sweet potato latent virus(SPLV), sweet potato chlorotic fleck virus (SPCFV),cucumber mosaic virus(CMV) could not be detected in this qPCR system. The lowest sensitivity of the qPCR was 3.12×102copies/μL and it was 100 times that of conventional RT-PCR. SPVE was detected in 1 sample of 6 samples collected from Shandong Province and 13 samples of 52 samples collected from Jiangsu Province by using the established qPCR detection method.【Conclusion】The complete genome sequence of SPVE-XZ is 10 919 nt. The genome structure of SPVE-XZ is consistent with SPVE-GS reported in Korean. The established qPCR detection system for SPVE is specific and highly sensitive, which can be used for the rapid detection of SPVE.

; sweet potato virus E (SPVE); complete genomic sequence; phylogenetic analysis; qPCR detection

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.20.007

2023-06-29；

2023-08-11

國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-10）、徐州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面上項目（KC21140）

唐偉，E-mail：tangv0001@163.com。通信作者孫厚俊，E-mail：sunhouj1980@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）