谷子苗期耐低氮相關(guān)性狀的QTL分析

秦娜，付森杰，朱燦燦，代書桃，宋迎輝，魏昕，王春義，葉珍言，李君霞

谷子苗期耐低氮相關(guān)性狀的QTL分析

秦娜，付森杰，朱燦燦，代書桃，宋迎輝，魏昕，王春義，葉珍言，李君霞

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，鄭州 450002

【目的】分析谷子（L.）耐低氮性狀相關(guān)的QTL，為耐低氮基因的精細(xì)定位、克隆及功能研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，也為揭示谷子耐低氮遺傳機(jī)理和培育耐低氮谷子品種提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳阅偷偷贩N豫谷28和低氮敏感品種七葉黃為親本構(gòu)建的包含120個家系的重組自交系（RIL）群體為試驗(yàn)材料，在谷子苗期進(jìn)行低氮和正常氮處理，并對處理21 d的水培幼苗的苗長、主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量、植株含氮量7個性狀進(jìn)行分析。同時(shí)，采用復(fù)合區(qū)間作圖法（composite interval mapping，CIM）對耐低氮相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位與分析，并對QTL置信區(qū)間內(nèi)的候選基因進(jìn)行預(yù)測?！窘Y(jié)果】在低氮和正常氮水平下，RIL群體的耐低氮相關(guān)性狀均表現(xiàn)為連續(xù)正態(tài)分布，且呈雙向超親分離現(xiàn)象，符合典型的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，適于QTL分析。相關(guān)分析表明，苗長與主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量呈極顯著正相關(guān)，主根長與植株含氮量呈顯著負(fù)相關(guān)。共定位到低氮和正常氮水平下與苗長、主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量及植株含氮量相關(guān)的34個QTL，分布于第1—9染色體，單個QTL表型貢獻(xiàn)率為5.15%—52.42%。其中，2種氮水平下共同定位到10個QTL，低氮和正常氮單一環(huán)境下分別定位到11和13個QTL。15個為主效QTL，、、、和5個主效QTL在2種氮水平下均被定位到。共檢測到5個QTL重疊區(qū)，聚集了2種氮水平下多個性狀的QTL，通過基因預(yù)測與功能注釋，篩選出5個QTL置信區(qū)間內(nèi)6個與氮代謝相關(guān)的候選基因，表明氮同化、吸收和利用相關(guān)基因極有可能控制了這些基因的表達(dá)。【結(jié)論】34個QTL分別聚集于9條染色體上的16個QTL簇，基于基因注釋，共篩選了6個與谷子氮代謝相關(guān)的候選基因，表明不同性狀參與到了共同遺傳機(jī)制，并可通過分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行耐低氮有利等位基因的聚合育種。

谷子；重組自交系（RIL）；耐低氮；QTL

0 引言

【研究意義】谷子（L.）作為我國的原產(chǎn)作物，且至今仍是旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)的主栽作物，在食物多樣性和種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中具有不可或缺的作用[1]。氮素是谷子生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素，同時(shí)，氮肥對促進(jìn)谷子高產(chǎn)和改良大田生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國27%以上耕地為瘠薄型低產(chǎn)田[2]，其中，北方旱區(qū)中低產(chǎn)田土地貧瘠，基礎(chǔ)地力差，氮素缺乏嚴(yán)重制約了谷子的增產(chǎn)潛力，張敏[3]研究表明，在低氮脅迫下，谷子苗期根長、側(cè)根數(shù)量、根表面積及根冠比增加；葉面積減小、葉片早衰發(fā)黃、苗高及含氮量降低。因此，氮肥施用量的增加成為提高谷子產(chǎn)量的重要途徑[4]。然而，氮肥施用過多容易造成谷子旺長、晚熟、抗病力下降、籽粒干癟，進(jìn)而加重谷瘟病、銹病、褐條病等多種病害的發(fā)生，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]，同時(shí)未被吸收的氮肥以N2和NH3等氣體的形式揮發(fā)，以及含氮化合物流入江河，造成了環(huán)境的嚴(yán)重污染[8-10]。由此“第二次綠色革命”應(yīng)運(yùn)而生，耐瘠、節(jié)水、抗逆等高效新品種的選育和應(yīng)用將推動我國綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展。以谷子為禾本科功能基因組模式植物的提出和耐逆基因的挖掘及營養(yǎng)高效谷子品種的培育可很大程度地解決了谷子生產(chǎn)中的主要矛盾[11-12]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，植物對氮脅迫的耐受性機(jī)制研究已取得較大的進(jìn)展。由于控制氮效率遺傳的性狀為數(shù)量性狀遺傳且受多基因與環(huán)境互作影響，遺傳機(jī)理非常復(fù)雜，因此，植物耐低氮的遺傳機(jī)理研究存在較大的難度。ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)了調(diào)控水稻根際微生物組成，促進(jìn)氮循環(huán)相關(guān)微生物在水稻根系的富集，構(gòu)建了硝酸鹽主信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路框架，闡釋了硝酸鹽信號驅(qū)動的水稻氮磷平衡的分子機(jī)制[14]，克隆了分蘗氮響應(yīng)基因，揭示了水稻適應(yīng)世界不同地區(qū)土壤肥力的遺傳[15]。在小麥[16]、馬鈴薯[17]、燕麥[18]方面的研究均表明產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳隨著施氮量的增加而降低。不同施氮條件下，玉米、水稻、小麥、擬南芥等氮生理與產(chǎn)量相關(guān)性狀均可以檢測到相同的QTL[19-20]，如與谷氨酸合成酶活性相關(guān)的QTL可與籽粒發(fā)芽效率及千粒重相關(guān)的QTL在同一染色體位置被檢測到[21]，氮利用效率相關(guān)的QTL與農(nóng)藝性狀相關(guān)的QTL被定位到同一染色體位置[22-25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究為谷子耐低氮相關(guān)性狀的遺傳變異奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，然而，由于作物耐低氮性狀為數(shù)量性狀且遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，在不同群體及地域間檢測到的許多QTL重復(fù)性差，并且前人對QTL區(qū)間內(nèi)的候選基因研究較少，不足以揭示其復(fù)雜的遺傳機(jī)制。目前克隆了一個谷子耐低氮饑餓關(guān)鍵基因，該基因是自噬基因家族中的一個新成員，與對應(yīng)的酵母ATG蛋白序列之間同源性不高，只有部分蛋白能完全互補(bǔ)酵母突變體表型，而自噬核心機(jī)制和酵母相似[26-27]。谷子及其野生種青狗尾草（L.）由于生育期短、基因組小及高效遺傳轉(zhuǎn)化，已發(fā)展成為禾本科功能基因組研究的模式植物[28-29]，且隨著谷子功能基因的挖掘使其研究進(jìn)入一個快速發(fā)展的階段[30-31]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究應(yīng)用重組自交系遺傳群體研究低氮和正常氮2個氮水平下的苗長、主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量及植株含氮量等7個相關(guān)性狀，進(jìn)行耐低氮QTL鑒定與分析，為谷子耐低氮基因的精細(xì)定位與候選及谷子耐低氮脅迫的分子機(jī)制提供遺傳基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以耐低氮品種豫谷28（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育）為母本，低氮敏感性早熟種質(zhì)資源七葉黃為父本雜交，后代經(jīng)過連續(xù)多代自交得到含有120個株系的重組自交系（recombinant inbred lines，RIL）群體（F7代）。

1.2 氮脅迫處理

試驗(yàn)于2022年7月10日至8月10日在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所智能化溫室內(nèi)進(jìn)行，取RIL群體各株系及親本色澤鮮亮、籽粒飽滿的種子100粒，放于含有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，采用5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗3—5次，加入適量無菌水后置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后選取發(fā)芽及長勢一致的種子30粒，移栽到96孔黑色避光水培盒中（體積為1 L），加入1 L適量谷子完全培養(yǎng)液于溫室中培養(yǎng)，完全培養(yǎng)液參照改良版Hogland配方（KH2PO40.2 mmol·L-1+CaCl2·2H2O 1.5 mmol·L-1+KCl 1.5 mmol·L-1+MgSO4·7H2O 1.0 mmol·L-1+NH4NO31.25 mmo·L-1）。培養(yǎng)條件為28 ℃光照14 h，26 ℃黑暗10 h，整個培養(yǎng)過程中，每隔2 d更換一次營養(yǎng)液。待幼苗長出第二片葉時(shí)，以谷子完全培養(yǎng)液中NH4NO3濃度為標(biāo)準(zhǔn)，正常氮水平的NH4NO3濃度為1.25 mmo·L-1，氮素濃度為2.5 mmo·L-1；低氮水平的NH4NO3濃度為0.25 mmo·L-1，氮素濃度為0.5 mmol·L-1。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 性狀調(diào)查

RIL群體在正常氮和低氮水平下處理21 d后停止培養(yǎng)，取每個株系的正常氮組和低氮組長勢一致的幼苗各3株，分別測定每個重復(fù)和2個氮水平下親本及重組自交系的苗長（seeding length，SL）、主根長（maximum root length，MRL）、葉綠素相對含量（chorophyll relative content，SPAD），然后將幼苗放入恒溫干燥箱中，115 ℃殺青20 min，80 ℃烘干至恒重后，分別稱取幼苗總干質(zhì)量（plant dry weight，PDW）、苗干質(zhì)量（seeding dry weight，SDW）和根干質(zhì)量（root dry weight，RDW）。采用杜馬斯rapid MAX N exceed定氮儀（德國，Elementar），參照谷類、豆類粗蛋白質(zhì)含量杜馬斯燃燒法（NY/T 2007- 2011）測定植株全氮含量[32]。以3次重復(fù)的平均值為統(tǒng)計(jì)依據(jù)進(jìn)行性狀值的數(shù)據(jù)分析和QTL檢測。

1.4 SSR基因型分析

用覆蓋谷子全基因組的親本間具有多態(tài)性的68對SSR標(biāo)記檢測RIL群體的基因型。68對SSR標(biāo)記分別位于第1—9染色體。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為40 ng模板、2 pmol·L-1引物、10 μl PCR mix，用水補(bǔ)至20 μl。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72 ℃ 10 min。用5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。與母本豫谷28相同帶型記為“0”，與父本七葉黃相同帶型記為“2”，雜合帶標(biāo)記為“1”，缺失或模糊帶標(biāo)記為“-1”。

1.5 QTL檢測與遺傳圖譜構(gòu)建

將表型值與RIL群體的基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入QTL ICI Mapping 4.1.0，運(yùn)用QTL mapping in RIL lines方法進(jìn)行QTL分析。根據(jù)排列測驗(yàn)permutations=1 000，=0.001，確定以LOD值≥2.0為檢測QTL的閾值，應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測QTL，并估算QTL的加性效應(yīng)和可解釋表型變異率。遵循McCouch等[33]原則命名QTL。最后利用Mapchart 2.3軟件進(jìn)行染色體遺傳圖譜構(gòu)建。

1.6 候選基因預(yù)測與分析

利用NCBI對目標(biāo)區(qū)間所有基因進(jìn)行同源比對，注釋各基因功能，參考其同源注釋，篩選出與谷子耐低氮性狀相關(guān)的候選基因。

2 結(jié)果

2.1 親本及RIL群體在2種氮肥水平下的表型分析

如圖1所示，低氮敏感重組自交系在正常氮水平下長勢良好，生長發(fā)育正常，而在低氮脅迫21 d后，則呈現(xiàn)葉片黃化、植株矮小等典型的氮缺少綜合癥。

由表1可知，親本和RIL群體的各性狀在正常氮（+N）與低氮（-N）2種氮水平下變異較大，且其變化趨勢和幅度不同，其中，在低氮（-N）水平下親本和RIL群體的苗長（SL）、根干質(zhì)量（RDW）、苗干質(zhì)量（SDW）、總干質(zhì)量（PDW）、葉綠素相對含量（SPAD）及植株氮含量（PNC）均較正常氮（+N）水平下不同程度地降低，而主根長顯著增加。表明低氮脅迫誘導(dǎo)了根系的伸長，抑制了地上部的生長，且豫谷28和七葉黃對低氮脅迫的反應(yīng)一致。豫谷28和七葉黃在低氮水平下較正常氮水平苗長分別降低了27.50%和28.30%，主根長分別增加了12.50%和17.86%，根干質(zhì)量分別降低了25.00%和33.30%，苗干質(zhì)量分別降低了40.00%和83.30%，總干質(zhì)量分別降低了46.67%和50.00%，葉綠素相對含量分別下降了10.10%和15.87%，植株氮含量分別降低了15.38%和27.27%。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，七葉黃的苗長、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、植株含氮量和葉綠素相對含量在低氮脅迫時(shí)較豫谷28降低幅度顯著增加，表明豫谷28對低氮脅迫的耐性強(qiáng)于七葉黃。類似地，RIL主根長在低氮水平下較正常氮水平增加了30.81%，變化差異大于兩親本。親本及RIL群體苗長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量及植株含氮量等性狀在2種氮水平下變化趨勢一致，但變異幅度不同。

圖1 低氮（左）和正常氮（右）水平下低氮敏感重組自交系水培21 d表型

表1 正常氮和低氮水平下RIL群體及親本性狀分析

SL：苗長；MRL：主根長；RDW：根干質(zhì)量；SDW：苗干質(zhì)量；PDW：總干質(zhì)量；SPAD：葉綠素相對含量；PNC：植株含氮量；ns：不顯著；**和*分別表示在＜0.01和＜0.05水平差異顯著。下同

SL: Seeding length; MRL: Maximum root length; RDW: Root dry weight; SDW: Seeding dry weight; PDW: Plant dry weight; SPAD: Chorophyll relative content; ns: no significance; **, * indicate significance at level＜0.01 and＜0.05, respectively. The same as below

以上結(jié)果表明，不同表型對低氮脅迫的反應(yīng)差異不盡相同。從RIL群體來看，各性狀值均呈現(xiàn)連續(xù)正態(tài)分布，且呈雙向超親分離現(xiàn)象，表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)（圖2），說明這些性狀適合用于QTL分析。

圖2 正常氮和低氮水平下重組自交系及親本性狀頻率分布圖

2.2 2種氮肥水平條件下性狀間的相關(guān)性分析

7個性狀間相關(guān)性分析表明（表2），在低氮和正常氮水平下均呈極顯著正相關(guān)的有13對性狀，即苗長與主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量，主根長與根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量，根干質(zhì)量與苗干質(zhì)量和總干質(zhì)量，苗干質(zhì)量與總干質(zhì)量和葉綠素相對含量，總干質(zhì)量與葉綠素相對含量，其中3對（苗長與苗干質(zhì)量、株高與總干質(zhì)量、苗干質(zhì)量與總干質(zhì)量）相關(guān)系數(shù)在2種氮水平下均較大（0.798—0.830）；呈極顯著負(fù)相關(guān)的有1對性狀，即主根長與植株含氮量，相關(guān)系數(shù)分別為-0.223和-0.348；低氮水平下株高與植株含氮量相關(guān)性不顯著。苗長、根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量和植株含氮量7個性狀在2種氮水平間均呈極顯著相關(guān)性（表2）。表明上述性狀值可反映谷子苗期耐低氮性。

表2 2種氮水平下苗期性狀的相關(guān)性

黑體數(shù)值表示各性狀在低氮和正常氮水平下的相關(guān)系數(shù)

The bold value in table indicates correlation coefficient of individual trait between -N and +N conditions

2.3 谷子苗期耐低氮相關(guān)性狀QTL分析

在低氮和正常氮水平下共檢測到34個控制谷子苗期苗長、主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量及植株含氮量的QTL（表3和圖3），分布于第1—9染色體上，單個QTL表型貢獻(xiàn)率為5.15%—52.42%。其中，10個QTL在低氮和正常氮水平下均被檢測到，且加性效應(yīng)方向保持不變；11和13個QTL分別僅在低氮和正常氮水平下檢測到顯著效應(yīng)。

2.3.1 苗長 共檢測到10個控制苗長的QTL，表型貢獻(xiàn)率為5.15%—20.39%，其中4個在低氮水平下檢測到，5個在正常氮水平下檢測到，1個在低氮和正常氮水平下均檢測到。的增效等位基因來自七葉黃，表型貢獻(xiàn)率最高為20.39%，僅在低氮水平下檢測到。的增效等位基因來自豫谷28，低氮和正常氮水平下貢獻(xiàn)率分別為10.37%和7.92%。、和均在正常氮水平下檢測到，其中、增效等位基因來自豫谷28，的增效等位基因來自七葉黃。

2.3.2 主根長 共檢測到11個控制主根長QTL，其中，和在2種氮水平下均被檢測到，其余9個僅在單個氮水平下被檢測到。和僅在低氮水平下被檢測到。和的增效等位基因來自七葉黃，低氮和正常氮水平下貢獻(xiàn)率分別為27.31%、13.76%和28.50%、26.56%，均為主效QTL。的增效等位基因來自豫谷28，僅在低氮環(huán)境下檢測到，表型貢獻(xiàn)率為11.07%。剩余8個QTL表型貢獻(xiàn)率均較低（5.19%— 9.82%），其中、、、和的增效等位基因均來自豫谷28，而其余3個均來自七葉黃。

圖中空心符號表示低氮；實(shí)心符號表示正常氮 Hollow symbols indicated that the N application was -N; Solid symbols indicated that the N application was +N

表3 谷子苗期耐低氮相關(guān)性狀的QTL定位

續(xù)表3 Continued table 3

2.3.3 根干質(zhì)量 共檢測到9個控制根干質(zhì)量的QTL，其中，僅有1個QTL在低氮和正常氮水平下均被檢測到，8個QTL僅在單一氮水平下被檢測到。的增效等位基因來自七葉黃，表型貢獻(xiàn)率最高，在低氮和正常氮水平下分別為28.54%和14.62%。和僅在低氮水平下檢測到，表型貢獻(xiàn)率分別為6.86%和9.06%，增效等位基因分別來自豫谷28和七葉黃。剩余6個僅在正常氮水平下檢測到，其中、和的增效等位基因均來自豫谷28，表型貢獻(xiàn)率分別9.04%、17.53%和7.89%，、和的增效等位基因均來自七葉黃。

2.3.4 苗干質(zhì)量 共檢測到7個控制苗干質(zhì)量的QTL，分別解釋5.39%—23.00%的表型變異。3個QTL僅在低氮水平下檢測到，其中的增效等位基因來自豫谷28，表型貢獻(xiàn)率為23.00%，為主效QTL，和的增效等位基因均來自七葉黃，表型貢獻(xiàn)率分別為8.71%和5.69%。4個QTL僅在正常氮水平下檢測到，其中和的增效等位基因均來自豫谷28，表型貢獻(xiàn)率分別為10.71%和5.39%，和的增效等位基因均來自七葉黃，表型貢獻(xiàn)率分別為6.86%和10.24%。

2.3.5 總干質(zhì)量 共檢測到7個控制總干質(zhì)量的QTL，其中僅在正常氮水平下檢測到，表型解釋率為10.25%，其增效等位基因來自豫谷28。其余6個僅在低氮水平下檢測到，、和為主效QTL，其貢獻(xiàn)率分別為17.74%、52.42%和15.01%，增效等位基因均來自豫谷28，剩余3個QTL，其增效等位基因均來自七葉黃，其中為主效QTL，貢獻(xiàn)率為15.67%。

2.3.6 葉綠素相對含量 共檢測到8個控制葉綠素含量的QTL，其中1個QTL在2種氮水平下均被檢測到，剩余7個QTL僅在單一氮水平下被檢測到。的增效等位基因來自豫谷28，在正常氮水平下檢測為主效QTL，表型貢獻(xiàn)率為13.47%，在低氮水平下檢測為微效QTL，表型貢獻(xiàn)率為9.41%。、、和的表型貢獻(xiàn)率分別為13.28%、8.27%、12.64%和13.47%，其增效等位基因均來自豫谷28，而其余3個QTL的表型率均較低，且增效等位基因均來自七葉黃。

2.3.7 植株含氮量 共檢測到10個控制植株含氮量的QTL，其中8個QTL僅在低氮水平下檢測到，2個QTL僅在正常氮水平下檢測到。和為主效QTL，表型貢獻(xiàn)率分別為16.92%和20.80%，其增效等位基因均來自豫谷28。剩余8個QTL表型貢獻(xiàn)率均較低（6.04%—9.62%），其中、、、和的增效等位基因均來自豫谷28，其余3個增效等位基因均來自七葉黃。

2.4 包含多個QTL的染色體重疊區(qū)

位于第1、3、5、6、7、8和9染色體上的15個區(qū)間包含多個QTL（圖2）。第1染色體有3個區(qū)域，短臂上SICAAS1034—SICAAS1039區(qū)間包含4個QTL，包括低氮水平下的1個和正常氮水平下的2個；長臂上SICAAS1060—SICAAS1057和SICAAS1057 —SICAAS1052 2個區(qū)間分別包含4個QTL。第3染色體有2個區(qū)域包含2個QTL，SICAAS3043— SICAAS3048區(qū)間包含7個QTL。第5染色體有4個區(qū)間SICAAS5085—SICAAS5049、SICAAS5083— SICAAS5034、SICAAS5034—SICAAS5035和SICAAS5035 —SICAAS5036，分別包含2、4、3和2個QTL。第6染色體SICAAS6019—SICAAS6005和SICAAS6055 —SICAAS6008分別包含2和4個QTL。第7和第8染色體SICAAS7005—SICAAS7028、SICAAS8014— SICAAS8019區(qū)間分別包含3和2個QTL。其中，第1染色體SICAAS1034—SICAAS1039、SICAAS1060— SICAAS1052、第3染色體SICAAS3043—SICAAS3048、第5染色體SICAAS5083—SICAAS5036和第6染色體SICAAS6055—SICAAS6008包含多個QTL，被稱為QTL重疊區(qū)。

2.5 候選基因的預(yù)測與分析

通過對QTL位點(diǎn)區(qū)間進(jìn)行候選基因挖掘，從數(shù)據(jù)庫中共篩選到147個功能注釋基因，根據(jù)谷子基因的功能注釋，共篩選出6個可能影響谷子氮同化與代謝相關(guān)的候選基因（表4）。其中，編碼D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，參與氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用。候選基因編碼氮利用調(diào)控家族蛋白P-Ⅱ（nitrogen regulatory protein，NRP），參與氮素利用與轉(zhuǎn)化過程。和編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1家族蛋白，與硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，共同促進(jìn)植株對氮素的吸收利用；編碼氨基酸透性酶第8亞家族蛋白，在植物器官氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用。候選基因編碼賴氨酸組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，為一類介導(dǎo)氨基酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的蛋白質(zhì)。

表4 候選基因注釋

3 討論

3.1 控制谷子耐低氮性狀QTL的一致性

不同基因型谷子品種在氮素吸收利用和耐低氮特性方面存在顯著差異[34-35]，這對研究谷子耐低氮分子機(jī)制及選育耐低氮谷子品種至關(guān)重要。由于傳統(tǒng)育種技術(shù)耗費(fèi)時(shí)間長且針對性差，因此，挖掘谷子耐低氮關(guān)鍵基因，開發(fā)新型分子標(biāo)記，采取分子標(biāo)記輔助育種將大大縮短耐低氮谷子新品種選育進(jìn)程，提高育種效率。

本研究采用水培液方式進(jìn)行培養(yǎng)，以苗長、主根長、葉綠素相對含量及干物質(zhì)重等7個性狀作為耐低氮特性檢測指標(biāo)，對親本及RIL群體在2種氮水平下進(jìn)行了表型分析。結(jié)果表明，苗期各性狀在低氮和正常氮水平下表現(xiàn)連續(xù)正態(tài)分布，且呈雙向超親分離現(xiàn)象，表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，因此，這些性狀適合于QTL分析。植物為適應(yīng)外界低氮、干旱等非生物脅迫，將會促使根部生長，而抑制地上部生長[36]，本研究結(jié)果表明，低氮水平條件下親本和RIL群體的苗長、苗干質(zhì)量、葉綠素相對含量、植株總干質(zhì)量及含氮量被抑制，而主根長被誘導(dǎo)，與上述研究結(jié)果一致。

本研究分別對低氮和正常氮水平下谷子苗期性狀進(jìn)行QTL分析發(fā)現(xiàn)，同一氮水平下的QTL呈聚集性分布，如第1染色體SICAAS1060—SICAAS1057區(qū)間共同定位了低氮水平下苗長、苗干質(zhì)量及植株含氮量3個性狀的QTL；第3染色體SICAAS3043— SICAAS3048區(qū)間包含了低氮水平下苗長、主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量及植株含氮量6個性狀的QTL；第5染色體SICAAS5083—SICAAS5034區(qū)間包含了正常氮水平下的苗長和苗干質(zhì)量2個性狀的QTL，表明控制植株多個性狀的QTL在同一氮水平條件下傾向于同時(shí)表達(dá)。這可能與植株地下和地上部協(xié)同作用維持植株正常生長相關(guān)，且各性狀之間的極顯著的相關(guān)性也證明了以上結(jié)果，這與前人對低氮脅迫下相關(guān)QTL的定位與分析結(jié)果相吻合[37-38]。

本研究在2種氮水平下共定位到了34個與谷子苗期氮效率利用相關(guān)的QTL，檢測到了5個QTL重疊區(qū)，分別位于第1、3、5和6染色體，5個重疊區(qū)同時(shí)聚集了2種氮水平下多個性狀的QTL。郭淑青等[39]亦在第1和第3染色體相同區(qū)域檢測到多個控制干物質(zhì)重及產(chǎn)量相關(guān)的QTL。

3.2 谷子氮代謝相關(guān)候選基因

根據(jù)候選基因預(yù)測分析，從目標(biāo)區(qū)間篩選到6個與氮同化和代謝及氨基酸合成相關(guān)的基因。編碼的NITROGEN REGULATORY PROTEINⅡ（NRPⅡ）是調(diào)控植物氮利用效率的關(guān)鍵組分。前人研究發(fā)現(xiàn)該基因與谷氨酸合成酶的活性顯著相關(guān)，可間接調(diào)控谷氨酸合成基因（）的表達(dá)[40]。本研究在耐低氮相關(guān)性狀的QTL位點(diǎn)、、、、和中均被篩選到，推測該基因可能是調(diào)控谷子氮素利用的重要基因。候選基因和編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1，該家族蛋白主要吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中的硝酸鹽、多肽、氨基酸和植物激素等。張瑞娟等[41]從谷子中鑒定了8個硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該基因家族表達(dá)具有組織特異性，其可能在不同組織和器官中吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽；大量研究表明擬南芥AtNRT1.1是雙親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，當(dāng)外界硝酸鹽濃度較高時(shí)，它可作為一個低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體促進(jìn)植物吸收硝態(tài)氮，當(dāng)外界硝酸鹽濃度較低時(shí)，其具有高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體功能可促進(jìn)植物吸收硝態(tài)氮[42]；Yang等[43]研究表明過表達(dá)水稻NRT1家族基因可增加植株的氮利用效率和生物量。編碼氨基酸透性酶第8亞家族蛋白，在植物器官氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用；Shi等[44]研究表明水稻氨基酸透性酶基因（）主要在根部表達(dá)，并參與土壤中絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸等氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，敲除后根部氮含量及籽粒蛋白質(zhì)含量顯著下降。編碼的賴氨酸組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（lysine-histidine transporters，LHTs），在植物中主要參與根部吸收氨基酸及向其他器官轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，對天冬氨酸和脯氨酸具有高親和力，能及時(shí)將吸收的氨基酸向孢子細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[45]。以上結(jié)果顯示，6個候選基因可作為谷子耐低氮性狀遺傳研究的重要目標(biāo)基因，以及用于谷子耐低氮新品種選育時(shí)進(jìn)行遺傳效應(yīng)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

共定位34個與苗長、主根長、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量、總干質(zhì)量、葉綠素相對含量及植株含氮量相關(guān)的QTL，分布于第1—9染色體，單個QTL表型貢獻(xiàn)率為5.15%—52.42%。其中，2種氮水平下共同定位10個QTL，低氮和正常氮單一環(huán)境下分別定位到11和13個QTL。共檢測到15個主效QTL位點(diǎn)，其中5個主效QTL在2種氮水平下被重復(fù)定位到。在QTL位點(diǎn)區(qū)間，共篩選6個與谷子氮代謝相關(guān)的候選基因。

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[45] LEE Y H, TEGEDER M. Selective expression of a novel high-affinity transport system for acidic and neutral amino acids in the tapetum cells offlowers. The Plant Journal, 2004, 40(1): 60-74.

QTL Analysis for Seeding Traits Related to Low Nitrogen Tolerance in Foxtail Millet

QIN Na, FU SenJie, ZHU CanCan, DAI ShuTao, SONG YingHui, WEI Xin, WANG ChunYi, YE ZhenYan, LI JunXia

Cereal Crops Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002

【Objective】The analysis of quantitative trait loci (QTL) related to low nitrogen tolerance traits of millet (L.) laid a foundation for fine mapping, cloning and functional research of low nitrogen tolerance genes. At the same time, it also provided technical support for revealing the genetic mechanism of low nitrogen tolerance of millet and breeding low nitrogen tolerance varieties. 【Method】The recombinant inbred line (RIL) population consisting of 120family lines was used as experimental materials, that was constructed from parents Yugu 28, a low nitrogen tolerant variety, and Qiyehuang, a low nitrogen sensitive variety. The RIL populations were treated with low nitrogen and normal nitrogen at seedling stage, and seven traits were analyzed of hydroponic for 21 days, which inculding seedling length,maximum root length, root dry weight, seedling dry weight, plant dry weight, relative chlorophyll content and plant nitrogen content.At the same time, we used composite interval mapping (CIM) to locate and analyze QTLs for traits related to low nitrogen tolerance, and predicted the candidate genes in the confidence intervals of QTLS. 【Result】The traits associated with low nitrogen tolerance of RIL populations exhibited continuous distribution with apparent transgressive segregation both under low nitrogen and normal nitrogen levels, which conformed to the typical genetic characteristics of quantitative traits and were suitable for QTL genetic analysis. Correlation analysis showed that seeding length was positively correlated with maximum root length, root dry weight, seeding dry weight, plant dry weight and relative chlorophyll content, and maximum root length was negatively correlated with plant nitrogen content. A total of thirty-four QTLs related to seeding length, maximum root length, root dry weight, seeding dry weight, plant dry weight, relative chlorophyll content and plant nitrogen content were located under low nitrogen and normal nitrogen levels, which distributed on chromosomes from 1 to 9. They explained individually 5.15%-52.42% phenotypic variation. Ten QTLs were simultaneously detected under both two nitrogen levels, eleven and thirteen QTLs were only identified under single low nitrogen and normal nitrogen conditions, respectively. A total of fifteen QTLs were major QTL, and five major QTLs were repeatedly detected under both two nitrogen levels, which including,,,andFive QTL overlaps were detected with gathering multiple QTLs under two nitrogen levels. Six candidate genes related to nitrogen metabolism were identified from the confidence interval of the five QTL overlaps, suggesting that genes related to nitrogen assimilation, absorption and utilization probably control the expression of these genes. 【Conclusion】Thirty-four QTLs were scattered on sixteen clusters of nine chromosomes. Based on gene annotation, a total of 6 candidate genes related to nitrogen metabolism were screened in foxtail millet, indicating the different traits involved in common genetic mechanisms, and the favorable alleles for low nitrogen tolerance can be polymerized by marker-assisted selection.

foxtail millet; recombinant inbred line (RIL); low nitrogen tolerance; QTL

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.20.002

2023-03-23；

2023-05-30

國家自然科學(xué)基金（32101758）、財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06）、河南省農(nóng)業(yè)良種攻關(guān)（2022010401）、河南省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金（Z20221341070）、河南省農(nóng)科院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2023TD036）

秦娜，E-mail：qinna2004@126.com。通信作者李君霞，E-mail：lijunxia@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）