不同再灌注時(shí)間對(duì)缺血后大鼠肝組織氧化應(yīng)激水平的影響

陳名陽(yáng) 胡亞榮 田新雁 陸麗 蘇娟 顧偉

肝缺血再灌注損傷（Hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是指肝臟組織缺血一段時(shí)間后再恢復(fù)血液灌注，不但沒(méi)有使肝臟功能、結(jié)構(gòu)恢復(fù)，反而加重其損傷程度的現(xiàn)象。HIRI 是肝移植、肝切除等外科操作中必經(jīng)的過(guò)程，這一過(guò)程不僅使肝細(xì)胞代謝、結(jié)構(gòu)紊亂和功能缺失，還影響肝功能恢復(fù)與預(yù)后，成為臨床肝臟疾病發(fā)展的重要因素[1～3]。

HIRI 發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝臟損傷的主要因素。機(jī)體存在著抗氧化系統(tǒng)，可減少氧化應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的損害。當(dāng)氧化應(yīng)激反應(yīng)加重時(shí)，抗氧化反應(yīng)也會(huì)有所增加，參與氧化應(yīng)激與抗氧化的化合物水平會(huì)發(fā)生改變，檢測(cè)其含量的變化能從側(cè)面反映機(jī)體氧化與抗氧化的程度[4～6]。本研究通過(guò)構(gòu)建HIRI 模型，著重研究不同時(shí)長(zhǎng)再灌注對(duì)機(jī)體氧化與抗氧化平衡的影響，為臨床防治HIRI 提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)SD 雄性大鼠42 只，8 周齡，體重180～220g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（滇）K2015-0002]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，建立大鼠HIRI 模型。

1.2 大鼠HIRI 模型制備實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前24h 禁食不禁水，使用1%戊巴比妥鈉（6mL/kg，ip）麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，下腹部正中切口，暴露肝臟，輕輕拉出肝左葉和肝中葉，采用無(wú)損傷血管夾夾閉肝左葉和肝中葉的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈，建立肝臟缺血模型，用生理鹽水浸潤(rùn)暴露的肝臟，在肝臟缺血90min 后撤掉血管夾建立再灌注模型，待肝臟顏色恢復(fù)后，縫合實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔，手術(shù)過(guò)程始終在鼠臺(tái)上進(jìn)行，并保持大鼠體溫在（37±0.5）℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將42 只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組（Sham 組）、缺血組（HI 組）和缺血再灌注組（HIR 組）。其中HIR 組設(shè)置5 個(gè)再灌注時(shí)間段，分別為再灌注3h（HIR3h 組）、再灌注6h（HIR6h組）、再灌注12h（HIR12h 組）、再灌注24h（HIR24h組）和再灌注72h（HIR72h 組），每組6 只大鼠。其中Sham 組不阻斷血流，僅進(jìn)行肝蒂部干擾，90min后直接取材。HI 組阻斷血流90min 后直接取材。HIR 組在進(jìn)行血流阻斷90min 后進(jìn)行再灌注，分別在肝臟再灌注3、6、12、24、72h 后進(jìn)行取材。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒、黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒、一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，透明質(zhì)酸（HA）試劑盒、層黏連蛋白（LN）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司。

1.5 標(biāo)本處理和指標(biāo)測(cè)定麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠后，用5mL 無(wú)菌注射器于下腔靜脈取血（3%肝素鈉抗凝），低溫靜置30min 后，4 ℃，3 000r/min 離心10min，分離獲得血漿，測(cè)量血漿中各指標(biāo)含量。采血結(jié)束后，遵循動(dòng)物倫理原則處死大鼠，取其肝臟，低溫生理鹽水沖洗干凈后，分離肝臟左外側(cè)葉，制作組織病理切片和10%肝勻漿液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 肝組織形態(tài)學(xué)觀察取肝左外側(cè)葉部分組織，4%多聚甲醛溶液中固定24h 后進(jìn)行石蠟包埋，再用切片機(jī)制作成4μm 切片，脫水透明后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理?yè)p傷變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異比較采用單因素方差分析（One -Way ANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化光學(xué)顯微鏡下Sham 組可見(jiàn)到假小葉結(jié)構(gòu)完整，肝組織匯管區(qū)及中央靜脈完整，肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，大小均勻，無(wú)壞死以及變性；HI 組肝細(xì)胞索狀排列整齊，分布不均勻，有少量變性和壞死，有紅細(xì)胞聚集和較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；HIR3h 組和HIR6h 組肝細(xì)胞排列不齊且不均勻，少量細(xì)胞出現(xiàn)壞死與變性，肝竇擠壓變形且有大量紅細(xì)胞淤積，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；HIR12h 組和HIR24h 組肝細(xì)胞排列不整齊且細(xì)胞基本形態(tài)消失，大小不一，有不同程度變性、水腫與壞死，肝竇擠壓變形甚至消失，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；HIR72h 組炎性細(xì)胞變少，肝細(xì)胞較24h 完整且排列整齊，壞死及變性明顯減少，紅細(xì)胞淤積減少，肝組織形態(tài)逐漸恢復(fù)。HIR 組的肝組織損傷以HIR24h 組最為嚴(yán)重，肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫和局灶壞死，且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠血漿中ALT、AST 水平變化與Sham組相比，HI 組、HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24 組大鼠血漿ALT、AST 水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HI 組相比，HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h 組大鼠血漿ALT、AST 水平均升高，HIR72h 組ALT、AST 水平均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化

表1 各組大鼠血漿中ALT 和AST 活力的變化（）

表1 各組大鼠血漿中ALT 和AST 活力的變化（）

注：與Sham 組比較，*P<0.05；與HI 組比較，#P<0.05

2.3 各組大鼠肝組織中MDA 和SOD 水平變化與Sham 組相比，HI 組、HIR24h 組、HIR72 組MDA水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），HI 組、HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組SOD水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HI組相比，HIR3h 組、HIR6h 組MDA 水平降低，HIR72h 組MDA 水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h 組、HIR72h組SOD 水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝組織中MDA 和SOD 水平變化（）

表2 各組大鼠肝組織中MDA 和SOD 水平變化（）

注：與Sham 組比較，*P<0.05；與HI 組比較，#P<0.05

2.4 各組大鼠肝組織中GSH 和GSH-Px 水平變化與Sham 組相比，HIR6h 組、HIR12h 組GSH 水平降低，HI 組、HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組GSH-Px 水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HI 組相比，HIR6h 組、HIR12h 組GSH 水平降低，HIR6h 組、HIR12h 組GSH-Px 水平降低，HIR24h 組、HIR72h 組GSH-Px水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肝組織中GSH 和GSH-Px 水平變化（）

表3 各組大鼠肝組織中GSH 和GSH-Px 水平變化（）

注：與Sham 組比較，*P<0.05；與HI 組比較，#P<0.05

2.5 各組大鼠肝組織中CAT 和XOD 水平變化與Sham 組相比，HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組CAT 水平降低，HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組XOD 水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HI 組相比，HIR3h 組、HIR6h 組CAT 水平降低，HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組XOD 水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肝組織中CAT 和XOD 水平變化（）

注：與Sham 組比較，*P<0.05；與HI 組比較，#P<0.05

2.6 各組大鼠肝組織中NOS 和NO 水平變化與Sham 組相比，HI 組、HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h組、HIR72h 組NOS 水平降低，HIR3h 組、HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組NO 水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HI 組相比，HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組NO水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠肝組織中NOS 和NO 水平變化（）

表5 各組大鼠肝組織中NOS 和NO 水平變化（）

注：與Sham 組比較，*P<0.05；與HI 組比較，#P<0.05

2.7 各組大鼠肝組織中LN 與HA 水平變化與Sham 組相比，HIR3h 組、HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組LN 水平升高，HI 組、HIR3h 組、HIR6h組、HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組HA 水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HI 組相比，HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組LN 水平升高，HIR6h 組、HIR12h 組、HIR24h 組、HIR72h 組HA 水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表6。

表6 各種大鼠肝組織中HA 和LN 水平變化（）

表6 各種大鼠肝組織中HA 和LN 水平變化（）

注：與Sham 組比較，*P<0.05；與HI 組比較，#P<0.05

3 討論

缺血再灌注損傷包括了缺血損傷和再灌注損傷兩個(gè)時(shí)期。在缺血損傷期，因氧供減少和耗竭，三磷酸腺苷（ATP）的生成銳減，鈉泵功能障礙，Na+潴留于細(xì)胞內(nèi)而使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，促使水大量進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)生細(xì)胞水腫變性，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生細(xì)胞壞死[7～9]。缺血也可導(dǎo)致線粒體功能障礙，呼吸鏈傳遞電子錯(cuò)誤，產(chǎn)生少量氧自由基，而出現(xiàn)輕度氧化損傷[10～12]。所以在本研究中可見(jiàn)肝組織在缺血期時(shí)出現(xiàn)了少量的細(xì)胞變性和壞死，以及SOD 和GSH-Px 活力的降低和MDA 水平的升高。

在再灌注損傷期，氧供雖然增加，但由于線粒體功能障礙、中性粒細(xì)胞激活、黃嘌呤氧化酶增多及兒茶酚胺自氧化等作用，可促使細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基、過(guò)氧化氫等活性氧（ROS）[13～15]。ROS 作用于細(xì)胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸，啟動(dòng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可破壞細(xì)胞的完整性；同時(shí)ROS 可使胞質(zhì)中的某些酶和膜蛋白交聯(lián)生成二聚體或更大的聚合物，從而使其失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常；ROS還可穿透核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，使堿基羥化、DNA 斷裂、染色體畸變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和死亡。過(guò)多ROS也可激活中性粒細(xì)胞，使其釋放大量的炎性因子而引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重組織細(xì)胞的損傷[16～18]。

缺血再灌注損傷的防治，首要是盡量縮短缺血時(shí)間。但是在臨床上因肝移植或肝臟切除術(shù)的復(fù)雜性，手術(shù)時(shí)間不可能較短，故HIRI 的治療重點(diǎn)是恢復(fù)血液灌流后減輕或消除再灌注損傷。氧自由基、ROS 產(chǎn)生過(guò)多是缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制[19，20]。而關(guān)于活性氧在再灌注后什么時(shí)候開(kāi)始產(chǎn)生并引發(fā)細(xì)胞和組織嚴(yán)重?fù)p傷，臨床和實(shí)驗(yàn)室的研究報(bào)道不一，缺乏系統(tǒng)性的研究。故本研究通過(guò)復(fù)制大鼠HIRI 模型，通過(guò)病理形態(tài)學(xué)觀察及檢測(cè)ALT、AST、氧化產(chǎn)物（MDA）含量、抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活力、NO 合酶系統(tǒng)及XOD 等含量來(lái)了解不同再灌注時(shí)間對(duì)缺血后肝組織的影響。本研究顯示，肝缺血后恢復(fù)血液再灌注，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)肝細(xì)胞損傷逐漸加深，在24h 時(shí)出現(xiàn)了明顯的水腫、變性和壞死。ALT、AST 的含量也隨再灌注時(shí)間有所增加并于12h 達(dá)到頂峰。SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶從再灌注3h 起逐漸降低，在12～24h 期間變化最明顯（P<0.01）。NO 和XOD 的含量從再灌注6h 起開(kāi)始升高，也是在12～24h 期間變化最明顯（P<0.01）。NOS 在肝臟缺血和恢復(fù)血流再灌注后均出現(xiàn)了降低（P<0.05）。MDA、LN、HA的含量隨再灌注時(shí)間逐漸升高，在72h 時(shí)達(dá)高峰（P<0.01）。

HIRI 是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，本研究觀察了不同再灌注時(shí)間對(duì)缺血后大鼠肝組織氧化應(yīng)激水平的影響，研究提示再灌注損傷在12～24h 期間變化最明顯，隨后肝組織損傷有所修復(fù)，但是肝纖維化程度卻有所增高，而HIRI 致肝纖維化的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。