青稞源ACE抑制糖肽結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性研究

胡香蓮, 酈 萍, 周柳莎, 俞瑜媛, 徐海星, 施永清

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,杭州 310018)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-I-converting enzyme,ACE)能夠在人體內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起作用,使得血壓升高[1]。而市面上治療高血壓的藥物如卡托普利等會引起頭痛、哮喘、可逆性腎功能障礙和冠狀動脈疾病等[2]。天然安全的ACE抑制劑受到廣泛關(guān)注,目前已經(jīng)從動植物、水生生物及乳源制備出ACE抑制肽[3]。

青稞(Highland Barley,HB)是一種耐寒、適應(yīng)性廣、產(chǎn)量穩(wěn)定的高原谷類作物。富含β-葡聚糖、多酚、蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.85%～14.51%)等,是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源[4]。

微生物分泌多種非特異性蛋白酶分解蛋白質(zhì)為小分子肽[5],常用來發(fā)酵食品蛋白質(zhì)。乳酸菌常被用來生產(chǎn)生物活性肽,嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳清蛋白濃縮物具有顯著的ACE抑制活性[[6,7];枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕使自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓3 h內(nèi)顯著降低[8];植物乳桿菌發(fā)酵HB蛋白具有降脂作用[9];HB白酒中鑒定出具有ACE抑制活性的短肽LPVGP、LLSPP同屬于釀酒酵母蛋白[10];毛霉、根霉、曲霉等霉菌分泌的淀粉酶和蛋白酶分解淀粉和蛋白質(zhì)為單糖、多肽、氨基酸等,如甜酒曲單菌發(fā)酵HB其葡萄糖、游離氨基酸增加[11,12];與單菌相比,混合發(fā)酵顯著降低發(fā)酵液的抗?fàn)I養(yǎng)因子并提高營養(yǎng)價值。乳酸菌和米根霉以及米根霉和酵母菌混合發(fā)酵HB比單菌發(fā)酵的游離氨基酸及抗氧化能力高[13,14,15]。

研究采用嗜熱鏈球菌和米根霉混合發(fā)酵青稞制備ACE抑制糖肽,單因素和響應(yīng)面優(yōu)化混菌發(fā)酵條件,分離純化青稞降壓糖肽并研究其結(jié)構(gòu)和體外穩(wěn)定性,為青稞蛋白的深度利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞(青海省西寧市);枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,CICC 10453)、嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophilus,CICC 6220、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,CICC 20283);釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,CICC 1423)、米根霉(Rhizopusoryzae,CICC 41214)、黑曲霉(Aspergillusniger,ATCC16404)、毛霉(Mucor,CICC 3109)。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(0.25 UN,ACE);馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL, HPLC級)、茚三酮(HPLC級);三氟乙酸、乙腈(色譜級)等,其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱,TGL-16gR型臺式高速冷凍離心機,Spectramax iD3型多功能酶標(biāo)儀,UV-2600型紫外-分光光度計,HD-5型電腦紫外檢測儀,Nicolet型傅里葉紅外光譜儀,BioBasic-18 RP-HPLC色譜柱,Waters 2695型高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 青稞發(fā)酵液制備

活化至對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌離心后保留菌體,加入等體積0.9%的無菌生理鹽水沖洗2次?；罨玫尼劸平湍?、毛霉、米根霉和黑曲霉用無菌生理鹽水沖洗孢子,分別用平板計數(shù)法和顯微鏡血細(xì)胞計數(shù)使菌懸液或孢子濃度為107CFU/mL。

青稞與水質(zhì)量比1∶15→打漿→糊化、冷卻→接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%菌懸液→細(xì)菌37 ℃、真菌28 ℃,發(fā)酵6 d→離心→上清液測多肽濃度、水解度、ACE抑制率

1.3.2 ACE抑制率、水解度及多肽得率測定

1.3.2.1 ACE抑制率測定

20 μL樣品與20 μL HHL(5 mmol/L,用0.1 mol/L的pH 8.3的硼酸鈉緩沖液,含0.3 mmol/L NaCl配制)混合,37 ℃保溫5 min,加5 μL ACE(0.1 U/mL),37 ℃反應(yīng)1 h;反應(yīng)結(jié)束后,加入100 μL HCl(1 mol/L)終止反應(yīng),加入1.5 mL的乙酸乙酯萃取馬尿酸,混合均勻,6 000 r/min下離心5 min,吸取1 mL乙酸乙酯層,經(jīng)80 ℃水浴烘干,加入3 mL蒸餾水,228 nm處測定吸光度[16]。

(1)

式中:A0為對照組,HHL+ACE的吸光度;A1為對照空白組,不加ACE的吸光度;A2為樣品組,樣品+HHL+ACE的吸光度;A3為樣品空白組,樣品+HHL的吸光度。

1.3.2.2 水解度測定

分別吸取0、20、40、60、80、100、120、140 μL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)補足至400 μL,加100 μL pH 8.0磷酸鹽緩沖液,100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%茚三酮溶液,沸水浴15 min后冷卻,570 nm處測量[17]?；貧w方程:y=1.849 1x+0.001 9,R2=0.993 5。

水解度測定:400 μL樣品加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氟乙酸溶液,離心,取100 μL上清液,補足至400 μL,其余操作步驟同上。

1.3.2.3 多肽得率測定

分別吸取0、60、120、180、240、300、360、420、480、540 μL Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)液(2 mg/mL)補足至600 μL,加入400 μL雙縮脲試劑,混合均勻后,離心,上清液于540 nm處測量[18]?；貧w方程:y=0.068 6x+0.059 3,R2=0.999 4。

多肽含量測定:400 μL樣品溶液加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氟乙酸溶液,離心,取600 μL上清液,加入400 μL的雙縮脲試劑,其余操作步驟相同。多肽得率按式(2)計算。

(2)

1.3.3 混菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

固定料液比1∶15、菌種比(嗜熱鏈球菌∶米根霉1∶1)、接菌量2%、溫度37 ℃、發(fā)酵時間6 d,探究料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、菌種比(3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3)、接菌量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%)、溫度(25、28、31、34、37 ℃)和發(fā)酵時間(2、3、4、5、6、7 d)5個因素進(jìn)行單因素實驗,分別測定ACE抑制率、多肽得率和水解度。

在單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇料液比(A)、菌種比(B)、接菌量(C)和發(fā)酵時間(D)4個主要因素,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗,以ACE抑制率為響應(yīng)值,實驗因素及水平設(shè)計見表1。

1.3.4 Sephadex G-15分離ACE抑制肽

一定濃度的發(fā)酵液上樣前經(jīng)濾膜(0.22 μm)過濾,Sephadex G-15(1.6 cm×60 cm)分離,以超純水1 mL/min的流速洗脫。采用苯酚硫酸法檢測每個試管的多糖含量,收集ACE活性最強的峰[19]。

1.3.5 RP-HPLC分離ACE抑制肽

RP-HPLC(BioBasic-18 250 mm×4.6 mm,300 ?,5 μm),流動相A為0.1%三氟乙酸-水溶液,流動相B為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序為:0～5 min,90% A;5～20 min,90%～70% A;21～30 min,50%～10% A;35～40 min,10%～90% A。進(jìn)樣50 μL,流速0.8 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長:220 nm。多次收集ACE抑制活性較強的峰并進(jìn)行純度鑒定[20]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜

取一定質(zhì)量的樣品與KBr混合,用研缽均勻研細(xì)、壓片,紅外光譜儀掃描4 000～400 cm-1。

1.3.7 β-消除反應(yīng)

純化樣品一份溶解在0.2 mol/L的NaOH溶液中,45 ℃反應(yīng)2 h;另一份溶解于蒸餾水中作為空白,紫外掃描200～400 nm的吸收值[21]。

1.3.8 青稞ACE抑制糖肽體外穩(wěn)定性

1.3.8.1 溫度、pH的影響

樣品分別在不同溫度(20、40、60、80、100 ℃)保溫2 h,以及不同pH(2、4、6、8、10),40 ℃下保溫2 h,冷卻,測定ACE抑制率[22]。

1.3.8.2 NaCl含量影響

樣品溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、2%、4%、6%、8%的NaCl溶液,100 ℃下保持15 min,冷卻,測定ACE抑制率[23]。

1.3.8.3 體外模擬胃腸消化影響

樣品溶解在pH為2的胃蛋白酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)溶液中,37 ℃水浴2 h,沸水浴5 min滅酶;經(jīng)胃蛋白酶酶解的樣品調(diào)節(jié)pH至7后加入胰酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%),37 ℃水浴2 h,沸水浴5 min滅酶[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞發(fā)酵液制備

由表2可見,單菌發(fā)酵中,綜合來看嗜熱鏈球菌和米根霉的ACE抑制率、多肽得率和水解度更高。選用兩者混合發(fā)酵的3個指標(biāo)也顯著高于單菌(P<0.05),可能是米根霉分泌的淀粉酶、蛋白酶分解青稞中的淀粉、蛋白質(zhì)為低聚糖、短肽等,供嗜熱鏈球菌利用[25],加快蛋白質(zhì)和肽水解使3個指標(biāo)上升。故后續(xù)實驗采用嗜熱鏈球菌和米根霉混合發(fā)酵青稞。

表2 菌株篩選結(jié)果

2.2 混菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

由圖1可知,料液比為1∶15時,ACE抑制率和水解度達(dá)到最高,可能原因是料液比低時,水分不足會降低營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度,從而限制微生物的生長;料液比高時會降低基質(zhì)孔隙率從而限制氧氣交換[26]。

圖1 料液比對ACE抑制活性、水解度和多肽得率的影響

由圖2可知,菌種比例為1∶1時,ACE抑制率、水解度和多肽得率達(dá)到最高,菌種比例3∶1～1∶1,3種指標(biāo)上升的可能原因是米根霉高產(chǎn)淀粉酶液化糖化HB淀粉,為嗜熱鏈球菌生長提供碳源環(huán)境[27];1∶1～3∶1時3種指標(biāo)下降可能是米根霉過多在HB基質(zhì)中成為優(yōu)勢菌種,抑制嗜熱鏈球菌的生長[28]。

圖2 菌種比對ACE抑制活性、水解度和多肽得率的影響

由圖3可知接菌量為2%時,ACE抑制率、水解度和多肽得率皆達(dá)到最大。可能是接菌量過低導(dǎo)致微生物分泌的酶不足,而接種量過高時,微生物分泌過多的蛋白酶分解了多肽導(dǎo)致3種指標(biāo)下降[29]。

圖3 接菌量對ACE抑制活性、水解度和多肽得率的影響

由圖4可知,37 ℃的ACE抑制率、水解度和多肽得率最高。可能溫度過低時微生物生長受到限制導(dǎo)致分泌蛋白酶很少,使得3種指標(biāo)效果差,與李景等[30]用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕情況類似。

圖4 溫度對ACE抑制活性、水解度和多肽得率的影響

由圖5可以看出,發(fā)酵1～6 d,微生物快速生長,產(chǎn)生大量淀粉酶、蛋白酶分解淀粉和蛋白質(zhì),因此3種指標(biāo)迅速上升,6 d后微生物繼續(xù)生長會利用發(fā)酵基質(zhì)中產(chǎn)生的多肽使其進(jìn)一步水解,因而多肽得率下降,水解度上升[31]。

圖5 時間對ACE抑制活性、水解度和多肽得率的影響

2.2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

確定發(fā)酵溫度37 ℃,以ACE抑制率為響應(yīng)值,選擇料液比(A)、菌種比(B)、接菌量(C)和發(fā)酵時間(D)4個主要因素的響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。青稞發(fā)酵液的ACE抑制率(Y)對料液比(A)、接菌量(B)、菌種比(C)、發(fā)酵時間(D)的多項回歸方程:Y=63.07+1.79A+5.37B-0.60C+7.13D+4.30AB+0.87AC+1.89AD-0.12BC+0.73BD-0.16CD-20.80A2-7.51B2-4.25C2-9.80D2和二次項A2、B2、C2、D2的影響極顯著,交互項AB影響極顯著,4個因素對青稞發(fā)酵液ACE抑制率的影響程度為D>B>A>C,即發(fā)酵時間>接菌量>料液比>菌種比。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

由圖6可知,料液比與接菌量交互作用形成的響應(yīng)曲面陡,說明交互項AB對ACE抑制率的影響極顯著,等高線呈橢圓形,交互作用很明顯,與方差分析結(jié)果一致。經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析得出最佳制備工藝為:料液比1∶15.505,接菌量2.405%,菌種比1.049,發(fā)酵6.389 d;模型預(yù)測的ACE抑制率為65.665%。根據(jù)實際實驗的可操作性,稍微調(diào)整最佳條件:料液比1.0∶15.5,接菌量2.4%,菌種比1.0,發(fā)酵6.4 d,重復(fù)3次實驗,ACE抑制率為65.79%,與模型預(yù)測值基本吻合,說明此模型可用來制備青稞發(fā)酵液。

圖6 料液比和接菌量對青稞發(fā)酵液ACE抑制率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.3 Sephadex G-15分離ACE抑制肽

青稞發(fā)酵液經(jīng)Sephadex G-15分離得到3個峰,分別命名為A1、A2、A3,3個峰在280、490 nm處均有吸收,表明純化組分同時含有多糖和蛋白質(zhì)(圖7)。3個峰IC50值分別為31.4、2.0、21.6 mg/mL,故對組分A2進(jìn)行下一步純化。

圖7 Sephadex G-15分離純化及其分離峰的ACE抑制活性圖

2.4 反相高效液相色譜分離ACE抑制肽

圖8a可知,A2組分經(jīng)RP-HPLC分離后得到9個峰,各個組分凍干后測定ACE抑制活性,結(jié)果見圖8b,F5組分的ACE抑制活性最高,收集F5組分,進(jìn)行純度分析。在保留時間11.678 min處出現(xiàn)信號較強的單一峰(圖8c),純度達(dá)95.17%,可進(jìn)行下一步的結(jié)構(gòu)分析。

注:a A2組分RP-HPLC分離圖;b A2組分RP-HPLC分離峰ACE抑制活性;c F5組分純度鑒定。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

由圖9可見,3 405 cm-1附近產(chǎn)生一個寬吸收峰,說明該吸收峰有O—H和N—H伸縮振動,2 933 cm-1左右處有C—H伸縮振動,與黑豆純糖蛋白的紅外譜圖類似[32],說明純化樣品有多糖存在;1 638 cm-1附近為肽鍵的特征吸收峰,說明純化樣品有蛋白存在;1 076、1 034 cm-1附近產(chǎn)生吸收峰,表明糖肽分子可能含有吡喃環(huán)[33]。

圖9 青稞降壓肽的紅外光譜圖

2.6 β-消除分析

糖肽連接鍵有O-糖肽鍵和N-糖肽鍵2種,前者在堿性條件下被水解,糖肽連接處的絲氨酸或蘇氨酸會形成在240 nm處有特征紫外吸收的不飽和氨基酸,而后者對堿穩(wěn)定。如圖10所示,堿處理樣品前后240 nm處吸光度值上升,說明發(fā)生了β-消去反應(yīng),樣品中存在O-糖肽鍵[34]。

圖10 青稞降壓糖肽的紫外掃描曲線

2.7 青稞ACE抑制糖肽的體外穩(wěn)定性研究

由圖11a可知,隨著溫度和NaCl含量增高,ACE抑制活性保留率呈下降趨勢;100 ℃時僅為53.24%,可能是高溫處理使得糖肽結(jié)構(gòu)改變,與ACE結(jié)合位點變少[35]。NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%～8%時ACE抑制活性保留率在65%左右,可能是鈉離子能抑制糖肽活性,濃度越高越容易抑制糖肽活性[36]。pH在4～8時,ACE抑制率較穩(wěn)定,增大至10時明顯下降,可能過堿導(dǎo)致ACE抑制糖肽發(fā)生消旋現(xiàn)象,肽鏈結(jié)構(gòu)改變影響ACE抑制活性[37]。由圖11b可知,青稞降壓糖肽經(jīng)體外胃腸模擬消化后,其ACE抑制活性保留率都下降的可能原因是胃蛋白酶和胰酶會繼續(xù)水解糖肽,使其活性降低[38]。

圖11 溫度、pH、NaCl含量和體外胃腸模擬消化對青稞ACE抑制糖肽活性的影響

3 結(jié)論

單因素和響應(yīng)面實驗優(yōu)化嗜熱鏈球菌和米根霉混合發(fā)酵青稞的最佳工藝參數(shù):料液比1∶15.5,接菌量2.4%,嗜熱鏈球菌∶米根霉為1∶1,發(fā)酵6.4 d,ACE抑制率65.79%,接近模型預(yù)測值。依次經(jīng)Sephadex G-15、RP-HPLC分離得到單一組分F5。紅外光譜和β消除反應(yīng)證明F5組分是糖肽,糖苷鍵為O—糖肽鍵。但還需通過分析單糖和氨基酸組成研究來進(jìn)一步了解ACE抑制活性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系。穩(wěn)定性研究表明青稞源ACE抑制糖肽存在高溫和強堿環(huán)境中不穩(wěn)定性、高NaCl含量中其活性易降低以及在胃腸道環(huán)境中易降解的弱點,故今后需進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性,為開發(fā)食品源ACE抑制糖肽創(chuàng)造條件。