磷酸鹽對(duì)高水分?jǐn)D壓組織化植物蛋白產(chǎn)品品質(zhì)的影響

安紅周, 黃 山, 郭益廷, 李盤欣, 黃亞男

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院1,鄭州 450001)(小麥和玉米深加工國(guó)家工程研究中心2,鄭州 450001)(河南省南街村(集團(tuán))有限公司3,臨潁 462600)

植物蛋白高水分?jǐn)D壓(物料水質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥40%)是一種植物蛋白質(zhì)構(gòu)重組技術(shù),通常是指大豆蛋白、谷朊粉等植物蛋白原料,在雙螺桿擠壓機(jī)內(nèi)部產(chǎn)生的高溫、高壓、高剪切作用下發(fā)生變性、展開(kāi),然后在冷卻模具處發(fā)生蛋白質(zhì)分子重排、聚集、成型的復(fù)合加工過(guò)程[1]。高水分?jǐn)D壓組織化蛋白產(chǎn)品具有類似肉類的纖維狀結(jié)構(gòu),并且組織化程度高、質(zhì)地均勻一致,此外,還具有氨基酸組成全面、零膽固醇、零反式脂肪酸等優(yōu)點(diǎn),擁有廣闊的市場(chǎng)前景[2]。

雖然高水分組織化蛋白具有與肉類相似的纖維結(jié)構(gòu),但相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)特性,如質(zhì)構(gòu)特性、持水持油特性等,與真實(shí)肉類相比仍有較大差距,目前對(duì)組織蛋白品質(zhì)調(diào)控的研究主要可以分為2個(gè)方面:通過(guò)改變工藝參數(shù),原輔料配比等對(duì)組織化蛋白品質(zhì)進(jìn)行調(diào)控,包括擠壓機(jī)螺桿轉(zhuǎn)速、各區(qū)溫度、水料比例等;通過(guò)添加不同的添加劑探究其對(duì)組織化蛋白品質(zhì)的影響,包括添加親水膠體、脂類物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽離子、藻類蛋白等。

磷酸鹽作為一種較為常用的食品添加劑常被加入到肉制品中,以改善肉制品的保水性,乳化性、調(diào)節(jié)pH等[6]。Gadekar等[7]研究發(fā)現(xiàn)磷酸鹽的加入可以改變pH,增加蛋白質(zhì)與水的結(jié)合,進(jìn)而顯著改善山羊肉的多汁性,風(fēng)味和整體適口性等感官特征。此外,一些研究結(jié)果表明,磷酸鹽對(duì)植物蛋白及組織化蛋白的理化特性和品質(zhì)有一定的影響和改善。Aidee等[8]發(fā)現(xiàn)三偏磷酸鈉能顯著改善大豆分離蛋白的乳化活性,增加其氮溶指數(shù),提高體外消化率,主要是因?yàn)榱姿峄蟮拇蠖狗蛛x蛋白中的疏水基團(tuán)暴露,有利于油水界面中蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和重排。Zhang等[9]通過(guò)研究不同條件下三聚磷酸鈉對(duì)大豆分離蛋白磷酸化程度的影響,當(dāng)使用磷酸化的最佳條件(pH=9,時(shí)間為3 h,三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%)時(shí),可顯著提高大豆分離蛋白的乳化性能。Peng等[10]研究發(fā)現(xiàn),添加三聚磷酸鈉能促進(jìn)二硫鍵的形成,同時(shí)促進(jìn)小麥蛋白聚合,從而較為顯著地改善低水分小麥組織化蛋白的纖維化程度。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)三偏磷酸鈉的加入能顯著提高低水分小麥組織化蛋白的持水性,降低氮溶指數(shù)和游離巰基含量。磷酸鹽的加入對(duì)植物蛋白原料和植物組織化蛋白的理化特性都有較為明顯的影響,然而這些研究多集中在低水分組織化蛋白領(lǐng)域,目前鮮有高水分?jǐn)D壓條件下磷酸鹽與植物蛋白的相互作用,以及這些作用對(duì)高水分組織化蛋白產(chǎn)品的功能與品質(zhì)影響的研究報(bào)道。

研究采用雙螺桿擠壓工藝生產(chǎn)高水分組織化植物蛋白,通過(guò)添加具有相同陽(yáng)離子和相似陰離子的3種磷酸鹽(NaH2PO4、Na2HPO4和Na3PO4)在,研究磷酸鹽的種類、濃度等對(duì)組織化蛋白質(zhì)構(gòu)特性、持水持油、水分分布等品質(zhì)的影響規(guī)律。通過(guò)微觀作用力測(cè)試、二級(jí)結(jié)構(gòu)變化等研究,研究磷酸鹽的加入對(duì)組織化蛋白理化性質(zhì)影響規(guī)律背后的作用機(jī)制,為高水分組織化植物蛋白產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中磷酸鹽這一類添加劑的加入提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.5%,干基);大豆蛋白粉(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)55.5%,干基)、谷朊粉(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)82.2%,干基)、小麥淀粉、DTNB、Tris、三氯乙酸、甘氨酸、EDTA、考馬斯亮藍(lán)G250、β-巰基乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

CLEXTRAL Ev025型雙螺桿擠壓,CenLee20K臺(tái)式高速離心機(jī),CR-400色彩色差儀,Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀,UV762紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),LGJ-10冷凍干燥機(jī),TA-XT PLUS物性測(cè)試儀,NICOLET 6700傅里葉紅外光譜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 擠壓組織化蛋白的制備

采用雙螺桿擠壓機(jī)[2]。原輔料按照大豆蛋白粉∶大豆分離蛋白∶谷朊粉∶小麥淀粉=4∶3∶3∶1質(zhì)量比例進(jìn)行混合,NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4分別按添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例加入后與原料混合均勻。

擠壓參數(shù):擠壓機(jī)溫度Ⅰ區(qū)30 ℃,Ⅱ區(qū)90 ℃,Ⅲ區(qū)120 ℃,Ⅳ區(qū)140 ℃,Ⅴ區(qū)150 ℃,Ⅵ區(qū)160 ℃;冷卻溫度60 ℃;實(shí)際喂料量2.6 kg/h;加水量3.0 L/h;螺桿轉(zhuǎn)速280 r/min。擠壓出的產(chǎn)品立即用真空包裝機(jī)真空密封包裝,低溫保存。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)特性

參考安紅周等[12]的方法并略作修改。選取較為平整的擠壓組織化蛋白,并用手術(shù)刀切制成2 cm×2 cm×0.5 cm的樣品,使用物性測(cè)試儀采用TPA程序,選用直徑為5 cm的探頭(P/50),樣品壓縮形變量為50%,測(cè)試的測(cè)前、測(cè)中和側(cè)后速度分別為2、1、2 mm/s,觸發(fā)力5 g。平行測(cè)定8次以上,去掉異常值后取平均值。

1.3.3 色澤特性

采用色差儀對(duì)組織化蛋白的3個(gè)不同部位測(cè)定色澤,每個(gè)部位平行測(cè)定3次,記錄L*、a*、b*、ΔE值,取平均值。L*表示明度系數(shù),數(shù)值的范圍為0～100,其能夠反應(yīng)樣品的亮白程度;a*和b*分別表示紅綠和黃藍(lán)的彩度系數(shù),數(shù)值處于60以內(nèi);ΔE表示各值與標(biāo)準(zhǔn)白板色調(diào)之間的差值程度。標(biāo)準(zhǔn)白板的色調(diào)值為L(zhǎng)*=95.22,a*=-0.6,b*=4.15。ΔE值計(jì)算公式為:

1.3.4 剪切特性

組織化度為最大橫向剪切力(垂直于組織蛋白纖維方向的力)與最大縱向剪切力(平行與組織蛋白纖維方向的力)的比值。參考Peng等[10]的方法并略作修改。實(shí)驗(yàn)選用擠壓后冷卻至室溫的高水分組織蛋白產(chǎn)品,將其切割成2 cm×2 cm×0.5 cm的塊狀樣品,進(jìn)行剪切特性的測(cè)定(A/ECB探頭),用組織化度來(lái)描述產(chǎn)品的剪切特性[12]。其測(cè)試條件為:將塊狀樣品置于平臺(tái)中央,測(cè)前速度和測(cè)后速度為2 mm/s,測(cè)試速度1 mm/s,剪切應(yīng)變?yōu)?5%,觸發(fā)力5 g。平行測(cè)定6次以上,去除掉異常值后取平均值。

1.3.5 持水性、持油性測(cè)定

參考安紅周等[13]的方法并略作修改。

持水性(WAC):準(zhǔn)確稱取3.00 g凍干樣品倒入25 mL離心管中,加入20.00 mL去離子水,使用渦旋振蕩器充分混勻,室溫水平靜置30 min。4 500 r/min下離心10 min,將離心管開(kāi)蓋后倒置于濾紙上進(jìn)一步瀝干多余水分,10 min后稱重,所有樣品均進(jìn)行3組平行測(cè)試,取平均值。持水性大小以每克樣品吸附水的質(zhì)量表示。

式中:m2為離心管與沉淀物的合質(zhì)量/g;m1為離心管與樣品的合質(zhì)量/g;m0為凍干樣品的質(zhì)量/g。

持油性(OAC):準(zhǔn)確稱取3.00 g凍干樣品倒入25 mL離心管中,加入20.00 mL大豆油,使用渦旋振蕩器充分混勻,室溫下水平靜置30 min。4 500 r/min下離心20 min,離心結(jié)束后需立即倒掉離心管中上層油脂,防止互溶,隨后稱質(zhì)量。所有樣品均進(jìn)行3組平行測(cè)試,取平均值。持油性大小以每克樣品吸附油的質(zhì)量表示。

式中:m2為離心管與沉淀物的合質(zhì)量/g;m1為離心管與樣品的合質(zhì)量/g;m0為凍干樣品的質(zhì)量/g。

1.3.6 蛋白質(zhì)溶解度測(cè)定

參考陳鋒亮等[14]的方法并略加修改,配置8種浸提溶液:pH=7.00的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(P):天然狀態(tài)蛋白;P+8 mol/L尿素(P+U):破壞氫鍵;P+1.5 g/100 mLSDS(P+S):破壞疏水相互作用;P+0.1 mol/Lβ-巰基乙醇(P+M):破壞二硫鍵;P+8 mol/L尿素+1.5 g/100 mLSDS(P+U+S);P+8 mol/L尿素+0.1 mol/Lβ-巰基乙醇(P+U+M);P+1.5 g/100 mLSDS+0.1mol/Lβ-巰基乙醇(P+S+M);P+8 mol/L尿素+1.5 g/100 mLSDS+0.1 mol/Lβ-巰基乙醇(P+U+S+M)。

稱取0.50 g凍干后樣品放于25 mL離心管中,分別加入10.00 mL 8種不同浸提液,混勻后于振蕩器水平振蕩2 h,4 500 r/min離心10 min,保留上清液。使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的可溶性蛋白含量,凱氏定氮法測(cè)定產(chǎn)品的總蛋白含量。蛋白溶解度以上清液中蛋白含量比上總蛋白含量表示。所有樣品均進(jìn)行3組平行測(cè)試,取平均值。

1.3.7 游離巰基和二硫鍵含量的測(cè)定

參考薛臘梅[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。

試劑A(Tris-Gly-EDTA緩沖液):準(zhǔn)確稱取10.4 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)、6.9 g甘氨酸(Gly)、1.2 g乙二胺四乙酸(EDTA)溶于1 L蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH=8.00;試劑B(Ellman溶液):稱取40 mg的2-硝基苯甲酸,用試劑A定容至10.00 mL;試劑C:β-巰基乙醇;試劑D:12%三氯乙酸游離巰基含量:準(zhǔn)確稱取3 mg蛋白樣品,加5 mL試劑A緩沖液20 ℃下反應(yīng)30 min,再加入40 μL試劑B,振蕩混勻,25 ℃下避光靜置30 min?？瞻诪闊o(wú)蛋白樣品,取反應(yīng)后的上清液在412 nm處測(cè)得吸光度值。所有樣品均進(jìn)行3組平行測(cè)試,取平均值。

總巰基含量:準(zhǔn)確稱取3 mg蛋白樣品,加入5 mL試劑A緩沖液,再加入0.05 mL試劑C,25 ℃下保溫1 h后加入10 mL試劑D,再在25 ℃保溫1 h,4 000 r/min離心10 min,倒掉上清液,保留沉淀,再加入5 mL試劑D洗滌沉淀,5 000 r/min離心10 min,再重復(fù)洗滌操作。測(cè)定沉淀中游離巰基含量即為總巰基含量。所有樣品均進(jìn)行3組平行測(cè)試,取平均值。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析(FT-IR)

參考Qiao等[16]的方法,準(zhǔn)確稱取1 mg蛋白樣品,及100 mg溴化鉀,研磨混勻后,使用液壓機(jī)將其制成1～2 mm厚薄片,分辨率為4 cm-1條件下共進(jìn)行64次掃描,掃描范圍400～4 000 cm-1,使用Omnic軟件分析光譜中的峰信號(hào),再使用pickfit軟件進(jìn)行擬合處理求出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。所有樣品均進(jìn)行3組平行測(cè)試,取平均值。

1.3.9 低場(chǎng)核磁共振測(cè)量

取70 g組織化蛋白樣品,切成3 cm長(zhǎng)條狀,用聚四氟乙烯膜將其包裹放入檢測(cè)管內(nèi),治愈核磁共振檢測(cè)槽室進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)參數(shù):采樣點(diǎn)數(shù)TD=2 048,重復(fù)掃描次NS=32,弛豫衰減時(shí)間T0=10 000 ms。利用CPMG脈沖序列測(cè)定樣品的自旋弛豫時(shí)間T2[17]。所有樣品均進(jìn)行3組平行測(cè)試,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)比較不同添加量磷酸鹽處理后的樣品發(fā)現(xiàn),NaH2PO4和Na2HPO4相較于空白都具有較為致密的纖維結(jié)構(gòu),其中纖維結(jié)構(gòu)隨著NaH2PO4添加量的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),在添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)為0.4%時(shí)纖維結(jié)構(gòu)最為致密。當(dāng)添加Na2HPO4時(shí),也可以觀察到較為明顯的纖維結(jié)構(gòu),其中,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)纖維結(jié)構(gòu)最為致密均勻,而隨著添加量的繼續(xù)增大,內(nèi)部纖維趨于片狀形態(tài),致密的絲狀纖維減少。當(dāng)添加Na3PO4時(shí),產(chǎn)品內(nèi)部纖維結(jié)構(gòu)相較于空白減少,內(nèi)部表面相較于空白更為光滑平整。

2.2 磷酸鹽對(duì)高水分植物蛋白產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表1分析可知,NaH2PO4和Na2HPO4對(duì)組織化蛋白的硬度無(wú)較為規(guī)律性影響,而Na3PO4的加入顯著地提高組織化蛋白的硬度,呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì):當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí),硬度、彈性均達(dá)到最大值;當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí),咀嚼性、黏性及內(nèi)聚性達(dá)到最大。這與安紅周等[18]研究相一致:在堿性條件下,組織化蛋白的硬度、彈性、咀嚼性均顯著增高,且隨著堿性的增大呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。這可能是由于在堿性條件下,會(huì)提高熔融狀態(tài)下蛋白的黏度,使物料在擠壓套筒內(nèi)受到更大的剪切作用,后經(jīng)冷卻壓縮階段蛋白重新交聯(lián)形成更為致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[19]。而隨著磷酸鈉添加量的繼續(xù)增加,在高濃度離子的作用下,蛋白質(zhì)分子與離子產(chǎn)生相互作用增強(qiáng),降低蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián),從而導(dǎo)致硬度、咀嚼性等顯著下降[20]。

表1 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.3 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白色澤的影響

由表2分析可知,隨著NaH2PO4和Na2HPO4的加入組織蛋白的明度系數(shù)L*顯著增加,色差值ΔE顯著降低,顏色較空白更為明亮。擠壓組織化蛋白的顏色產(chǎn)生過(guò)程可能是原料中的淀粉經(jīng)過(guò)水解生成還原糖,還原糖中的羰基與蛋白中的氨基在高溫高壓下發(fā)生美拉德褐變反應(yīng)。而加入弱酸性的NaH2PO4在一定程度上會(huì)抑制美拉德反應(yīng)的進(jìn)行,降低美拉德反應(yīng)速率,難以形成吡嗪類物質(zhì),從而導(dǎo)致產(chǎn)品明度系數(shù)L*顯著增大,色差值ΔE顯著降低。而當(dāng)加入弱堿性的Na3PO4有利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生,在堿性條件下,氨基會(huì)水解以陰離子形式存在,此時(shí)氨基反應(yīng)活性較強(qiáng),較高的pH也會(huì)使還原糖中的脫羧反應(yīng)增強(qiáng),從而有利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生,使擠出物的明度系數(shù)L*顯著降低,色差值ΔE顯著升高。

表2 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白色澤的影響

2.4 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白產(chǎn)品組織化度的影響

組織化度通?？梢杂脕?lái)描述產(chǎn)品的剪切特性,是評(píng)價(jià)組織化蛋白產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,多用來(lái)形容擠出產(chǎn)品的纖維化程度。蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有一定程度上的有序性和取向性,如果蛋白質(zhì)分子變性的速率比聚集的速率快,蛋白質(zhì)分子就更易發(fā)生有序結(jié)合,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子變性速率小于聚集速率時(shí),蛋白質(zhì)就易形成無(wú)序粗糙的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而金屬離子通常可以通過(guò)影響蛋白質(zhì)變性的速率,從而影響蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成,對(duì)組織蛋白纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響[21]。組織化蛋白產(chǎn)品的組織化度隨磷酸鹽的種類和添加量的變化如圖1所示。隨著NaH2PO4的和Na2HPO4的加入,組織化度均顯著增加,且呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì),分別在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于在較低濃度時(shí),磷酸鹽與蛋白質(zhì)分子間的相互作用,有助于蛋白質(zhì)變性、打開(kāi),在擠壓產(chǎn)生的高剪切作用下,形成致密有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),同時(shí)在冷卻分子重排時(shí),較低的離子濃度能夠促進(jìn)形成更為密集有序纖維分布,顯著增大擠出產(chǎn)品的組織化度。而隨著濃度繼續(xù)增大,離子強(qiáng)度過(guò)高時(shí),變性的蛋白質(zhì)趨向于形成隨機(jī)且粗糙的纖維結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入Na3PO4時(shí),產(chǎn)品的組織化度呈現(xiàn)波動(dòng)變化趨勢(shì),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)達(dá)到最大值,其原因可能是在堿性條件會(huì)增大熔融狀態(tài)下物料的黏度[19],影響其在擠壓套筒內(nèi)的停留時(shí)間,同時(shí)較高的離子濃度會(huì)促進(jìn)隨機(jī)、無(wú)序結(jié)構(gòu)的形成,在2種因素的共同作用下,產(chǎn)生了波動(dòng)性的變化趨勢(shì),這與Li等[5]觀察到的現(xiàn)象相似。

圖1 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白組織化度的影響

2.5 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白持水性、持油性的影響

磷酸鹽對(duì)組織化蛋白產(chǎn)品持水、持油特性的影響規(guī)律如圖2所示。3種磷酸鹽的加入,較為顯著地提升組織化蛋白的持水性。其中加入NaH2PO4提升較為明顯,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的時(shí)持水性最好,隨著濃度的繼續(xù)升高有緩慢降低的趨勢(shì)。Na3PO4的持水性,也是呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。而Na2HPO4這可能跟磷酸鹽可以通過(guò)在面筋蛋白和淀粉之間起到架橋結(jié)合的作用,形成穩(wěn)定的復(fù)合體,增強(qiáng)面筋蛋白的吸水能力,從而使組織蛋白的持水性能提高[22]。而當(dāng)離子濃度較高時(shí),會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞,從而影響蛋白質(zhì)與水的相互作用,使持水性降低[23]。

圖2 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白持水、持油性的影響

隨著NaH2PO4的加入,組織化蛋白的持油性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)達(dá)到最好的持油性。NaH2PO4和Na3PO4的加入都顯著降低了組織化蛋白的持油性?？赡茉蚴橇姿猁}的加入,促進(jìn)了引起蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化,減少了疏水位點(diǎn)與油結(jié)合,導(dǎo)致持油性下降[24]。總體來(lái)看,NaH2PO4和Na2HPO4的加入可以優(yōu)化組織化蛋白的微觀結(jié)構(gòu),提升產(chǎn)品整體的持水持油特性。

2.6 組織化蛋白溶解度分析

蛋白質(zhì)在不同浸提液中的溶解度可以反映蛋白質(zhì)分子的變性程度,以及維持蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的主要作用力,蛋白質(zhì)溶解度越高,表明該浸提液所破壞的化學(xué)鍵或者微觀作用力在維持蛋白結(jié)構(gòu)中起的作用越強(qiáng)[25]。組織化蛋白產(chǎn)品在浸提液中不同的溶解度表明了維持蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的微觀作用力具有多樣性。

磷酸鹽的添加對(duì)組織化蛋白溶解度的影響如圖3所示。單一作用破壞試劑(P+U、P+S、P+M)實(shí)驗(yàn)表明,氫鍵是維持組織蛋白微觀結(jié)構(gòu)的主要作用力,并且磷酸鹽的加入并未對(duì)氫鍵造成的溶解性變化產(chǎn)生顯著性影響;二硫鍵和疏水相互作用等化學(xué)鍵或微觀作用對(duì)蛋白質(zhì)溶解性幾乎沒(méi)有影響,這與Wei等[26]的研究結(jié)論相似。而在氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用共同作用下的蛋白質(zhì)溶解度變化為負(fù)值,這是因?yàn)槟蛩厝芤翰粌H會(huì)破壞氫鍵,還會(huì)對(duì)疏水相互作用有一定程度的干擾,導(dǎo)致重復(fù)計(jì)算氫鍵和疏水相互作用。此外當(dāng)氫鍵和二硫鍵的協(xié)同作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度顯著增大,可能是由于在構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)過(guò)程中,氫鍵是維持蛋白質(zhì)分子的基礎(chǔ)作用力,且氫鍵的排列更為有序緊密,保護(hù)了位于結(jié)構(gòu)內(nèi)部的二硫鍵交聯(lián)結(jié)構(gòu),當(dāng)浸提液中的尿素將氫鍵破壞后,內(nèi)部的二硫鍵也隨即被巰基乙醇破壞,導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度顯著增加。

圖3 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白溶解度的影響

2.7 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白產(chǎn)品中水分分布的影響

低場(chǎng)核磁廣泛的被用于表征食物中水的狀態(tài)和分布情況。T2是激發(fā)態(tài)的自旋-自旋質(zhì)子與相鄰質(zhì)子交換能量以達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡所花費(fèi)的時(shí)間,又稱弛豫時(shí)間。較長(zhǎng)的T2弛豫時(shí)間表示水分子具有更大的自由度,而較短的T2弛豫時(shí)間意味著較低的自由度。根據(jù)T2弛豫時(shí)間曲線出峰的位置,通常將水的狀態(tài)分為3種:T2b(0～10 ms)、T21(1～100 ms)和T22(100～300 ms),分別對(duì)應(yīng)著強(qiáng)結(jié)合水(強(qiáng)結(jié)合質(zhì)子),弱結(jié)合水(中結(jié)合質(zhì)子)和自由水(弱結(jié)合質(zhì)子)[33]。A2b、A21和A22為3種狀態(tài)水對(duì)應(yīng)的峰面積,峰面積的大小表示該狀態(tài)水含量的多少。

圖4為組織化蛋白產(chǎn)品中水分子的弛豫曲線(以0.6%為例),在0～10 ms內(nèi)出現(xiàn)了2個(gè)T2b峰,表明有2種結(jié)合程度不同的強(qiáng)結(jié)合水,這可能是因?yàn)樵现型瑫r(shí)含有蛋白質(zhì)和淀粉。強(qiáng)結(jié)合水通常通過(guò)氫鍵、靜電等強(qiáng)相互作用與食品大分子中的羧基、氨基或者羥基結(jié)合。10～100 ms出現(xiàn)的T21峰為主峰(含量比例超過(guò)80%),這部分水為弱結(jié)合水,與強(qiáng)結(jié)合水相比流動(dòng)性受限,通常是指被蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)包裹著的水[34]。樣品中水分主要是以弱結(jié)合水的形式存在的,表明了組織蛋白具有良好的持水性。100～300 ms出現(xiàn)的T22峰表示為自由水,表示可以在產(chǎn)品組織內(nèi)可以自由流動(dòng)的水。

圖4 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白水分分布的影響

由圖4和表3可知,組織化蛋白中自由水含量占比很低,說(shuō)明組織蛋白內(nèi)的自由水含量非常少,大部分都是以結(jié)合水的形式存在,不利于產(chǎn)品形成多汁的口感。同時(shí)由表3可知,添加3種磷酸鹽都增加強(qiáng)結(jié)合水含量,這可能是磷酸鹽中的無(wú)機(jī)鹽離子的離子作用和水合作用,吸附了部分水分子,導(dǎo)致強(qiáng)結(jié)合水含量增大[35]。

表3 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白水分分布的影響

2.8 組織化蛋白分子中游離巰基和二硫鍵含量分析

組織化蛋白分子中游離巰基和二硫鍵的變化如圖5所示,結(jié)果表明,磷酸鹽的加入能夠促使游離巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵,增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)。3種磷酸鹽的添加后,游離巰基含量較空白均顯著降低,二硫鍵含量顯著升高,但均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。這可能是金屬離子的靜電作用和酸堿特性共同影響下的結(jié)果。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)高濃度的鹽加入,水分子優(yōu)先跟金屬離子結(jié)合,使得蛋白質(zhì)周圍水分子重新排列,蛋白質(zhì)分子的疏水相互作用增強(qiáng)。金屬離子的加入影響蛋白之間的微觀相互作用,使物料黏性增大,在擠壓套筒內(nèi)停留時(shí)間增長(zhǎng),變性更為徹底,從而促進(jìn)了游離巰基向二硫鍵的轉(zhuǎn)換。而Na2HPO4和Na3PO4的添加導(dǎo)致的游離巰基和二硫鍵的波動(dòng)變化,原因可能是堿性條件會(huì)促進(jìn)巰基的氧化反應(yīng),誘導(dǎo)游離巰基向二硫鍵發(fā)生轉(zhuǎn)換[28],而隨著堿性的增加,游離巰基含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì),這可能是由于,在堿性條件下胱氨酸發(fā)生了β-消去反應(yīng),生成了脫氫丙氨酸和巰基,從而使游離巰基得到了補(bǔ)充[29]。

圖5 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白中游離巰基、二硫鍵的影響

2.9 傅里葉紅外變換光譜分析

酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)常用來(lái)描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),并廣泛用于定量分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),主要是由肽鏈上的C—O伸縮振動(dòng)引起的[30]。在酰胺Ⅰ帶1 650～1 660、1 610～1 640、1 660～1 700、1 640～1 650 cm-1這4個(gè)波長(zhǎng)處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲[31]。由表4可知,不同磷酸鹽的加入對(duì)組織化蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角均無(wú)顯著的規(guī)律性影響,而加入NaH2PO4能提升β-折疊結(jié)構(gòu)且降低無(wú)規(guī)則卷曲含量,說(shuō)明NaH2PO4的加入使部分無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu),產(chǎn)品結(jié)構(gòu)更加趨于有序。β-折疊結(jié)構(gòu)的增加是由于分子間反平行β-折疊的形成,而反平行β-折疊結(jié)構(gòu)常見(jiàn)于蛋白質(zhì)的熱變性聚集過(guò)程中,這也印證了NaH2PO4的加入有利于產(chǎn)品組織化度的增大[32]。而隨著Na2HPO4的加入,β-折疊含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),與之對(duì)應(yīng)的無(wú)規(guī)則卷曲呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。而隨著Na3PO4的加入,對(duì)組織化蛋白β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲無(wú)顯著規(guī)律性影響。這說(shuō)明在擠壓過(guò)程中存在β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的相互轉(zhuǎn)化,NaH2PO4和Na2HPO4的加入有利于產(chǎn)品β-折疊結(jié)構(gòu)含量的增加和無(wú)規(guī)則卷曲的減少,進(jìn)而對(duì)產(chǎn)品組織化度、質(zhì)構(gòu)特性等產(chǎn)生影響。

表4 磷酸鹽對(duì)組織化蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

3 結(jié)論

通過(guò)控制NaH2PO4、Na2HPO4和Na3PO4的添加量,研究3種磷酸鹽的加入對(duì)組織化蛋白理化性質(zhì)影響,發(fā)現(xiàn):添加NaH2PO4和Na2HPO4在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～1%內(nèi)都顯著提升產(chǎn)品的組織化度,Na3PO4的加入顯著增大了產(chǎn)品的硬度、彈性和咀嚼度。3種磷酸鹽的加入都顯著改善了組織化蛋白的持水性。磷酸鹽的加入降低了產(chǎn)品的游離巰基含量,增大了二硫鍵含量,說(shuō)明磷酸鹽有利于游離巰基向二硫鍵的轉(zhuǎn)化。傅里葉紅外光譜分析表明,NaH2PO4和Na2HPO4的加入有利于產(chǎn)品蛋白中的無(wú)規(guī)則卷曲向β-折疊轉(zhuǎn)換,形成更有序的結(jié)構(gòu),這也與組織化度變化相一致。蛋白質(zhì)溶解性測(cè)試結(jié)果表明氫鍵對(duì)維持組織化蛋白結(jié)構(gòu)起著重要作用,其次是二硫鍵,最后是疏水相互作用。低場(chǎng)核磁結(jié)果表明組織化蛋白中水的存在方式為弱結(jié)合水,水分與蛋白結(jié)合較為緊密,不易流失,磷酸鹽的加入能夠提升強(qiáng)結(jié)合水的含量,增加組織化蛋白產(chǎn)品的持水性能。磷酸鹽的加入顯著性的提升了組織化蛋白的持水性、剪切特性,并通過(guò)巰基二硫鍵、傅里葉紅外光譜、低場(chǎng)核磁等實(shí)驗(yàn)結(jié)果從微觀層面對(duì)其改善原因進(jìn)行進(jìn)一步的研究,初步揭示了磷酸鹽對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響機(jī)理。