免疫磁珠高通量自動(dòng)凈化-超高效液相色譜法快速測(cè)定飼料中玉米赤霉烯酮

王 蒙, 陳金男, 葉 金, 李 麗, 王松雪, 張 穎,吳 宇, 劉洪美

(上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院1,上海 200093)(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院糧油質(zhì)量安全研究所2,北京 102629)

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,分子式為C18H22O5,不溶于水,易溶于有機(jī)溶劑,具有熒光特性,在玉米和小麥等谷物類(lèi)飼料中廣泛存在[1]。玉米赤霉烯酮的毒性主要體現(xiàn)在免疫毒性、生殖毒性、細(xì)胞毒性、遺傳毒性和器官毒性等[2]。劉雙雙等[3]研究發(fā)現(xiàn)ZEN在終濃度10、20、30 mol/L下均可顯著或極顯著地降低脂多糖誘導(dǎo)的B細(xì)胞相對(duì)活性,并導(dǎo)致細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)分子CD69、CD71、CD138的表達(dá)量顯著下降。此外,ZEN還可抑制B細(xì)胞的增殖,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。玉米赤霉烯酮可直接通過(guò)抑制小鼠B淋巴細(xì)胞的活化、增殖、分化,影響體液免疫的進(jìn)程,從而對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制作用。趙虎等[4]在基礎(chǔ)日糧中分別添加1、2、3 mg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)的玉米赤霉烯酮飼喂仔豬,與飼喂基礎(chǔ)日糧的對(duì)照組相比仔豬脾臟、肝臟和腎臟重量顯著增加。Wu等[5]將48只青春期前母豬分為對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(分別在基礎(chǔ)日糧上添加200、800、1 600 μg/kg的ZEN),結(jié)果顯示ZEN添加量最大的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比母豬的血清總抗氧化能力和血清超氧化物歧化酶活性均顯著降低,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高,引起肝毒性。李樵峰等[6]將蛋雞分成對(duì)照組和2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(分別在全價(jià)基礎(chǔ)日糧上添加1和2 mg/kg的ZEN),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的肝臟病理組織切片中出現(xiàn)小泡性脂肪病變和肝組織壞死和纖維化。ZEN對(duì)飼料及其產(chǎn)品的污染不僅會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)遭受經(jīng)濟(jì)損失,而且ZEN 在可食用動(dòng)物組織或動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留對(duì)人類(lèi)健康具有很大的威脅。許多國(guó)家都對(duì)ZEN制定了限量標(biāo)準(zhǔn),目前其他國(guó)家對(duì)ZEN在谷物及飼料中的限量范圍在0.02～1 000 μg/kg[7]。我國(guó)規(guī)定谷物及其制品中ZEN的限量為60 μg/kg[8],飼料原料及其產(chǎn)品中的限量為0.1～1.5 mg/kg[9]。

飼料組分復(fù)雜,常摻有甜菜堿、抗菌肽、低粗蛋白、混合有機(jī)酸、霉菌毒素吸附劑等添加劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[10-14],給ZEN的準(zhǔn)確檢出造成阻礙。因此,樣品前處理方法就顯得尤為重要?，F(xiàn)有的前處理方法主要有免疫親和柱法(IAC)[15]、固相萃取法(SPE)[16]、QuEChERS[17]等。上述方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),成本高等問(wèn)題。免疫磁珠(IMB)是由載體微球和免疫配基相結(jié)合的一種磁性納米粒子,具有超順磁性、尺寸小等特點(diǎn)[18,19],在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、凈化時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[20-22]。玉米赤霉烯酮常用的分析測(cè)試方法有免疫檢測(cè)法、薄層色譜測(cè)定法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等(表1)。綜合比較各種檢測(cè)方法,超高效液相色譜法由于使用了粒徑更小的填料色譜柱,能夠縮短分析時(shí)間而且不需要質(zhì)譜儀這類(lèi)價(jià)格昂貴的儀器,非常適合準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)大量飼料樣品中的ZEN。

表1 玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法及特點(diǎn)

研究將免疫磁珠技術(shù)應(yīng)用于飼料原料及其產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮的凈化,結(jié)合超高效液相色譜分析方法,旨在實(shí)現(xiàn)飼料原料及其產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮準(zhǔn)確、快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

玉米赤霉烯酮單克隆抗體(純度>97.3%)、NHS基團(tuán)-磁珠[20%(體積分?jǐn)?shù)),10～30 μm]、玉米赤霉烯酮免疫親和柱;甲醇、乙腈(色譜純)、無(wú)水乙醇(分析純);甲醇中玉米赤霉烯酮溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)100301];定性濾紙(直徑為15 cm)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀,Waters Acquity FLD熒光檢測(cè)器,JJHZ10真菌毒素全自動(dòng)凈化儀,MTV-100多管漩渦混合儀,SQP電子天平,N-EVAP112快速溶劑吹干器。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Waters BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫 40 ℃,樣品溫度 10 ℃;進(jìn)樣量 10 μL。流動(dòng)相:水-乙腈,按體積比 45∶55 混合,等度洗脫,流速為 0.2 mL/min。熒光檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng) 303 nm,發(fā)射波長(zhǎng) 440 nm。

1.3.2 免疫磁珠的制備

將抗體恢復(fù)至室溫,吸取一定量加到離心管中,加入適量MES緩沖液制成抗體稀釋液,混勻備用。NHS基團(tuán)-磁珠充分混勻后,吸取一定量,用無(wú)水乙醇洗2遍后,快速加入抗體稀釋液混勻,孵育2 h。孵育結(jié)束后,磁分離棄去上層液。加入適量體積分?jǐn)?shù)為2%甘氨酸溶液封閉2 h。封閉結(jié)束后,磁分離棄去上層液。用0.1%(體積分?jǐn)?shù))PBST、PBS各清洗2次磁珠,4 ℃冷藏保存在PBS中。

1.3.3 樣品前處理方法

免疫磁珠自動(dòng)凈化前處理方法流程如下:將飼料恢復(fù)至室溫備用,稱質(zhì)量前充分混勻。準(zhǔn)確稱量(10.00±0.01)g樣品(基質(zhì)加標(biāo)樣品應(yīng)靜置過(guò)夜以揮發(fā)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的有機(jī)溶劑),加入40 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈水;充分震蕩20 min,使用定性濾紙過(guò)濾。準(zhǔn)確吸取2 mL濾液加到試劑盒1孔位,將試劑盒放到真菌毒素全自動(dòng)凈化儀中,啟動(dòng)程序自動(dòng)凈化。凈化結(jié)束后,準(zhǔn)確吸取洗脫溶液0.5 mL于10 mL離心管中,在55 ℃氮?dú)猸h(huán)境下緩慢吹至近干。吹干后用0.5 mL流動(dòng)相復(fù)溶。使用0.2 μm濾膜過(guò)濾復(fù)溶溶液,上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 分析方法驗(yàn)證

用逐級(jí)稀釋法,以信噪比(S/N=3)和(S/N=10)確定檢出限和定量限。對(duì)該方法進(jìn)行加標(biāo)回收率、重復(fù)性、穩(wěn)定性測(cè)試。對(duì)飼料樣品進(jìn)行3個(gè)不同濃度(低、中、高)基質(zhì)加標(biāo)回收率的測(cè)定。基質(zhì)加標(biāo)后在室溫下放置過(guò)夜,以蒸發(fā)加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液溶劑。在1個(gè)加標(biāo)水平(150 μg/kg)下測(cè)定重復(fù)性,重復(fù)測(cè)定4 d,測(cè)試該方法的穩(wěn)定性。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

配制ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液方法:根據(jù)需要準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相稀釋,配制成10、25、50、100、200、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,4 ℃避光保存。將標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻后使用超高效液相色譜檢測(cè),以目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo),目標(biāo)物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理軟件

采用Empower?3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、整理和導(dǎo)出。使用Microsoft Excel?2016和OriginPro8.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液的優(yōu)化

飼料組分豐富,成分復(fù)雜,容易對(duì)毒素的凈化及檢測(cè)過(guò)程造成不利影響,試劑盒樣品孔稀釋液作為抗原與抗體反應(yīng)的溶劑環(huán)境,對(duì)凈化效果有顯著影響。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選擇仔豬飼料進(jìn)行稀釋液的優(yōu)化。比較了6種稀釋液及二次離心的方式對(duì)樣品孔稀釋液進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果如圖1a所示。常用的PBS和0.1%(體積分?jǐn)?shù))PBST緩沖液回收率分別為107.0%和93.0%,但是凈化后樣品孔和第1個(gè)清洗孔出現(xiàn)大量絮狀物,磁珠有不同程度的殘留,因此平行性較差,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差偏大。在稀釋液中加入1%(體積分?jǐn)?shù))PEG作為分散劑,回收率降低且絮狀物殘留狀況沒(méi)有改善。在0.1%(體積分?jǐn)?shù))PBST中添加BSA和0.1%(體積分?jǐn)?shù))TBST 2種稀釋液的回收率分別為96.8%和108.1%滿足測(cè)試需求,但凈化后樣品孔仍有部分絮狀物。二次離心法和0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫20-水凈化效果最好,回收率約100%,且凈化后各孔位干凈清澈,無(wú)雜質(zhì)。圖1b液相色譜圖顯示豬飼料使用0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20水作為稀釋液,目標(biāo)峰后幾乎無(wú)雜峰,凈化效果優(yōu)于二次離心,同時(shí)二次離心法增加了前處理步驟和時(shí)間。之后用0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20水作為稀釋液凈化其他3種不同飼料,凈化效果液相色譜圖如圖1c所示,各色譜峰峰型一致。因此,樣品孔位稀釋液為水中加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))的吐溫20。

注:a 不同稀釋液及上清液處理方式凈化后回收率;b 不同稀釋液及上清液處理方式液相色譜圖;c 稀釋液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫20-水對(duì)不同飼料凈化效果。方法1表示稀釋液為PBS;方法2表示稀釋液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))PBST;方法3表示稀釋液為1%(體積分?jǐn)?shù))PEG/0.1%(體積分?jǐn)?shù))PBST;方法4表示稀釋液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫20-水;方法5表示稀釋液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))PBST+BSA;方法6表示稀釋液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))TBST;方法7表示樣品離心后上清液與0.1%(體積分?jǐn)?shù))PBST混勻后二次離心。

2.2 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限

在10～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)制備標(biāo)準(zhǔn)工作液。Y=225.57X+184.2,R2=0.999 93,線性關(guān)系良好。方法的檢出限為4.5 ng/mL,定量限為15.0 ng/mL,滿足飼料中玉米赤霉烯酮的日常檢測(cè)。

2.3 方法準(zhǔn)確性與精密度

選取雞飼料和豬飼料作為基質(zhì),參照GB/T 27404對(duì)方法及方法確認(rèn)的要求進(jìn)行方法準(zhǔn)確性和精密度的檢驗(yàn)。選擇加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為飼料限量標(biāo)準(zhǔn)的0.5、1.0、2.0倍。充分混勻靜置后,按照1.3.3樣品前處理方法處理樣品,計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),雞飼料3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的加標(biāo)回收率在96.0～99.8%,RSD在1.8%～3.7%,豬飼料3種濃度加標(biāo)回收率在92.6%～112.9%,RSD在1.0%～8.8%。結(jié)果表明,本法具有良好的準(zhǔn)確性。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 免疫磁珠法凈化后基質(zhì)加標(biāo)回收率

2.4 日間精密度

連續(xù)4 d采用免疫磁珠凈化法進(jìn)行同種飼料加標(biāo)回收測(cè)試,所得結(jié)果如表3。方法連續(xù)4 d的加標(biāo)回收率在97.0%～98.9%,日間精密度在5.7%～5.9%,具有良好的重現(xiàn)性。

表3 該方法的日間精密度

2.5 實(shí)際樣品測(cè)試及方法比對(duì)

表4表示的是采用國(guó)標(biāo)法中的免疫親和柱法和免疫磁珠法對(duì)豆粕、DDGS(4個(gè)不同廠家)及14種牛、羊、雞飼料分別進(jìn)行前處理后得到的檢測(cè)結(jié)果,采用t檢驗(yàn),評(píng)價(jià)2種凈化方法的測(cè)定結(jié)果是否一致。經(jīng)t檢驗(yàn)分析,2種凈化方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此,本方法可用于大批量飼料產(chǎn)品中ZEN含量的檢測(cè)。

表4 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了一種自動(dòng)、高通量免疫磁珠凈化-超高效液相色譜檢測(cè)方法,用于測(cè)定飼料原料及其產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮。在研究中發(fā)現(xiàn),樣品稀釋液組成對(duì)凈化后樣品檢測(cè)結(jié)果起重要作用,在水中加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20凈化效果最好。在雞飼料和豬飼料樣品中玉米赤霉烯酮的加標(biāo)回收率為92.6%～112.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～8.8%。連續(xù)4 d基質(zhì)加標(biāo)回收率在94.0%～106.3%,日間精密度在0.5%～3.0%。本方法簡(jiǎn)化了前處理步驟,實(shí)現(xiàn)凈化過(guò)程的自動(dòng)化,減少因?qū)嶒?yàn)人員操作造成的實(shí)驗(yàn)誤差,提高了檢測(cè)效率,采用超高效液相色譜進(jìn)行分析測(cè)試,具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。目前,使用免疫磁珠凈化飼料中的真菌毒素鮮有報(bào)道,多是對(duì)糧油產(chǎn)品的檢測(cè),其中大部分是對(duì)單一毒素的檢測(cè),未來(lái)需要研發(fā)能夠同時(shí)凈化多種真菌毒素的免疫磁珠,提高免疫磁珠的凈化效率,降低檢測(cè)成本,制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),使其得到廣泛的應(yīng)用。