水溶性維生素測(cè)定技術(shù)的研究進(jìn)展

李 甜，張 野

(九州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221000)

維生素是維持人和動(dòng)物身體健康所必需的一種有機(jī)化合物，人體自身不能合成，必須從外界環(huán)境攝取[1]。水溶性維生素作為維生素重要的一部分，對(duì)維持人體的正常生命活動(dòng)極為重要。維生素B族和維生素C是水溶性維生素的兩個(gè)主要組成部分。維生素B族包括維生素B1、維生素B2、維生素B6等，各種維生素都有各自不同的功效與作用。維生素B1能夠調(diào)理神經(jīng)；維生素B2用于治療口角炎舌炎，口腔潰瘍；維生素B6能夠用于治療妊娠期嘔吐放療化療引起的嘔吐；維生素B12能夠起到營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和神經(jīng)炎的作用。維生素C又稱抗壞血酸或者抗壞血病維生素，適用于各種貧血能夠促進(jìn)鐵的吸收，能夠提高身體免疫力，增強(qiáng)抗病能力，抗過(guò)敏，也能夠促進(jìn)傷口愈合[2-3]。

由于水溶性維生素的不穩(wěn)定性，其在不同條件下(如酸、堿、光、熱等)可能會(huì)發(fā)生分解，因此對(duì)其進(jìn)行分析和測(cè)定具有一定的難度。隨著現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)的迅猛發(fā)展，傳統(tǒng)的微生物法、分光光度法等分析方法已不再能滿足實(shí)驗(yàn)的需求，水溶性維生素的檢測(cè)方法也變得更加多樣化，包括高效液相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、超臨界色譜法等多種方法，這些方法已被廣泛應(yīng)用于水溶性維生素的檢測(cè)中。本文簡(jiǎn)要綜述了近十年來(lái)現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)在水溶性維生素測(cè)定方法中的應(yīng)用情況[4]。

1 水溶性維生素的來(lái)源與代謝

水溶性維生素(Water-soluble vitamins)是一類能溶于水而不溶于非極性有機(jī)溶劑的維生素，包括維生素B族和維生素C族。與脂溶性維生素不同，水溶性維生素在人體內(nèi)的儲(chǔ)存較為有限，經(jīng)腸道吸收后多余的水溶性維生素通常通過(guò)尿液排出體外[5]。水溶性維生素毒性較低，高攝入量通常并不會(huì)導(dǎo)致中毒現(xiàn)象的發(fā)生，但如果攝入量太少，缺乏癥狀就會(huì)更快發(fā)生，如食欲減退、疲勞乏力；關(guān)節(jié)和肌肉疼痛；出血(牙齦出血、皮下片狀淤青、內(nèi)出血)、傷口愈合緩慢；嚴(yán)重缺乏可導(dǎo)致壞血病等。因此，可在日常生活通過(guò)飲食改善，特別是吃些維生素豐富的水果和蔬菜。

2 水溶性維生素的測(cè)定方法

隨著現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，水溶性維生素的檢測(cè)手段日趨多樣?，F(xiàn)階段，水溶性維生素的檢測(cè)手段主要包括微生物法、光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用以及超臨界色譜法等。這些方法在實(shí)際應(yīng)用中都存在各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，且每種方法均有其適用范圍和局限性。在本文中，我們將綜合相關(guān)研究成果，對(duì)各種方法的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理和總結(jié)。

2.1 微生物法

微生物法測(cè)定水溶性維生素含量是目前國(guó)際上廣泛使用的水溶性維生素檢測(cè)法，該方法的基本原理是利用微生物與維生素存在的特定關(guān)系，通過(guò)改變微生物的生存環(huán)境，促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖和代謝來(lái)完成對(duì)特定維生素成分的測(cè)定。由于微生物自身對(duì)生存環(huán)境異常敏感，并具有特異性，因此該種檢測(cè)方法具有靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也因其具有的易污染、繁殖繁瑣等特性，造成其培養(yǎng)周期長(zhǎng)、測(cè)定結(jié)果局限單一等缺點(diǎn)。劉冬虹等[6]優(yōu)化并建立了一種快速測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的維生素B12、葉酸、生物素、肌醇四種水溶性維生素的微生物測(cè)定法。該方法利用甘油對(duì)菌種進(jìn)行保護(hù)，使菌種活力更穩(wěn)定，既保證了試驗(yàn)的有效性，也節(jié)省了大量時(shí)間，解決了傳統(tǒng)微生物法試驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜的問(wèn)題。微生物法是檢測(cè)維生素含量最簡(jiǎn)單、最普遍的一種方法，在未來(lái)的發(fā)展中應(yīng)該著力于其較差的重現(xiàn)性及不能同時(shí)檢測(cè)多種維生素等缺點(diǎn)，建立更完善的方法體系。

2.2 光度法

光度法也是檢測(cè)水溶性維生素的常用方法，主要包括分光光度法和熒光光度法兩種。 利用水溶性維生素強(qiáng)吸收紫外光的特性，分光光度法可在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)或特定波長(zhǎng)處測(cè)定被測(cè)物質(zhì)的光吸收度。相對(duì)于微生物法而言，分光光度法在測(cè)定維生素B1、維生素B6、煙酰胺方面具有更高的靈敏度、更短的操作時(shí)間和更低的成本。在對(duì)奶粉中維生素B1進(jìn)行溴甲酚綠探針?lè)止夤舛确y(cè)定的試驗(yàn)中，王鳳怡等[7]發(fā)現(xiàn)，在弱酸性條件下，溴甲酚綠與維生素B1發(fā)生反應(yīng)，形成了具有正負(fù)峰的離子締合物，且在最大正、負(fù)吸收波長(zhǎng)處，維生素B1與體系的吸光度呈現(xiàn)出線性關(guān)系。然而，該方法在實(shí)際操作中存在著繁瑣的過(guò)程和較長(zhǎng)的耗時(shí)，同時(shí)還容易受到共存物質(zhì)的干擾，穩(wěn)定性也較差。

熒光光度法通常用于檢測(cè)自身含有熒光基團(tuán)或能衍生出熒光特性的維生素。熒光光度法表現(xiàn)出更強(qiáng)的檢測(cè)能力和更高的靈敏度，相較于分光光度法，其檢測(cè)效果更佳。研究者還發(fā)現(xiàn)并建立將三維熒光光譜應(yīng)用于定量測(cè)定維生素復(fù)合片中的維生素B1、B2和B6的檢測(cè)方法，該方法回收率高，穩(wěn)定性好，可得到預(yù)期結(jié)果。值得注意的是，熒光光度法并不具備高效快速的優(yōu)點(diǎn)，其前處理過(guò)程繁瑣復(fù)雜，需要進(jìn)行提取、皂化衍生化等步驟，而且不同種類的維生素在前處理方式上也存在差異。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是一種液相分離方法，它利用毛細(xì)管作為分離通道，以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品中各組分的濃度，實(shí)現(xiàn)高效的分離分析。毛細(xì)管電泳法因其高效、快速、廣泛的分析對(duì)象而備受推崇，近年來(lái)，許多學(xué)者已將其應(yīng)用于水溶性維生素的檢測(cè)。崔悅等[8]聯(lián)合毛細(xì)管電泳和電化學(xué)技術(shù)，同時(shí)分離并檢測(cè)了復(fù)合維生素中維生素B1和B6的含量，定量測(cè)定結(jié)果表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，該方法具有操作簡(jiǎn)單、儀器成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。此項(xiàng)技術(shù)可應(yīng)用于分析成分豐富、含量較低的保健藥品和保健食品。由于毛細(xì)血管直徑較小，該方法在檢測(cè)時(shí)存在敏感度低；電極容易被腐蝕和損壞；樣品成分也會(huì)對(duì)電滲產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其可重復(fù)性等問(wèn)題。

2.4 高效液相色譜(HPLC)

色譜分析法是一種基于物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離和分析的高級(jí)技術(shù)。近年來(lái)，色譜技術(shù)的飛速發(fā)展使得用高效液相色譜(HPLC)直接測(cè)定維生素的方法成為可能。這一項(xiàng)技術(shù)能夠以高效、敏銳、精準(zhǔn)的方式對(duì)維生素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)具有出色的分離性能。研究者等將乙醇作為電解質(zhì)的改性劑，利用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜分離和測(cè)定10種水溶性維生素，僅用了18 min，為維生素的測(cè)定提供了一種便捷的的分析方法，且已成功地用于生物醫(yī)藥分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)及化工產(chǎn)品與食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域。盡管HPLC法在維生素測(cè)定方面已經(jīng)取得了相當(dāng)成熟的進(jìn)展，其操作簡(jiǎn)便、測(cè)定準(zhǔn)確、重復(fù)性好，但其應(yīng)用仍受到一些限制，例如某些維生素的同分異構(gòu)體較多，難以實(shí)現(xiàn)完全分離，同時(shí)分離效果也受到樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾[9]。

2.5 液相-質(zhì)譜聯(lián)用

液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS)的方法融合了色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，集兩者強(qiáng)大的分離能力、高專一性、高靈敏度、高選擇性于一體。利用HPLC-MS/MS技術(shù)，梁瑞強(qiáng)等[10]成功實(shí)現(xiàn)了保健食品中10種水溶性維生素的同時(shí)分離和鑒定，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了有力支持。韓豪等[11]提出了超高效的液相-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，可用于快速、高選擇性地檢測(cè)谷類作物中維生素B1、B2和B6的含量，為谷類作物、食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)提供了一種可靠的檢測(cè)手段。值得注意的是，目前液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用面臨諸多限制，包括高昂的檢測(cè)設(shè)備、復(fù)雜的儀器操作和高昂的維護(hù)成本等問(wèn)題，這些限制了其在工廠和實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)應(yīng)用，相比之下，HPLC法則更具廣泛適用性和實(shí)用性。

2.6 超臨界色譜法

超臨界流體色譜法是以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜檢測(cè)方法，主要利用流體在高于臨界溫度和臨界壓力時(shí)低黏度、高密度及高擴(kuò)散系數(shù)的一種物質(zhì)狀態(tài)，對(duì)不同類型的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分離與鑒定，尤其適用于單組分或多組分混合物中微量含量比較大的成分的檢測(cè)。目前已應(yīng)用于食物、藥品及化妝行業(yè)。多個(gè)研究者已發(fā)現(xiàn)，基于超臨界流體色譜法能同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素中維生素B2、B3、B5、B6等多種維生素的含量，試驗(yàn)結(jié)果線性關(guān)系良好，平均回收率高，穩(wěn)定性好，這些研究為進(jìn)一步利用超臨界流體色譜測(cè)定水溶性維生素提供了可行性[12]。盡管超臨界色譜應(yīng)用于維生素檢測(cè)，檢測(cè)效率更高，檢測(cè)時(shí)間更短，但依然存在有些水溶性維生素具有極性限制等問(wèn)題，難以使用該種方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，隨著新型分析化學(xué)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，水溶性維生素的檢測(cè)手段和方法也不斷創(chuàng)新和升級(jí)。未來(lái)隨著基因?qū)哟渭夹g(shù)和納米級(jí)材料的應(yīng)用，維生素的提取更加精細(xì)化，必然水溶性維生素檢測(cè)朝著更加微量，工藝更加高效和結(jié)果更加精密等方向邁進(jìn)，同時(shí)使得檢測(cè)應(yīng)用更加廣闊。