半夏組織培養(yǎng)一步成苗技術(shù)初步研究

程搏幸, 羅夫來(lái), 李冀青, 王洪亮, 李開陽(yáng), 周 丹

(1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550018; 2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025;3.貴州省農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心, 貴陽(yáng) 550001;4.赫章縣山地高效農(nóng)業(yè)科技有限公司, 貴州 畢節(jié) 553200)

半夏[Pinelliaternate(Thunb.)Breit.]是天南星科草本植物,以干燥塊莖入藥,被歷版《中華人民共和國(guó)藥典》收載[1],具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)等功效[2],是常用的化痰止咳平喘藥材[3]。隨著半夏藥材需求量逐步增加,野生資源大幅衰減,市場(chǎng)上半夏藥材主要依靠人工種植[4]。目前,主要以塊莖作為種莖,用無(wú)性繁殖方式進(jìn)行種植,繁殖系數(shù)小、種莖成本高、種植效益低,嚴(yán)重影響半夏產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[5-6]。利用組織培養(yǎng)技術(shù),實(shí)行半夏工廠化育苗是提高繁殖系數(shù)、降低種莖成本、提升種植效益的有效途徑,但是傳統(tǒng)組培技術(shù)需經(jīng)過(guò)多次接種和培養(yǎng),才能完成誘導(dǎo)、分化、生根、壯苗的過(guò)程,育苗環(huán)節(jié)多、步驟繁瑣、周期長(zhǎng)[7]。一步成苗組織培養(yǎng)育苗法是在同一培養(yǎng)基上完成脫分化、再分化等過(guò)程,減少人工操作環(huán)節(jié),降低污染風(fēng)險(xiǎn),有效提高了育苗效率、縮短了育苗周期,為進(jìn)一步提高種苗大規(guī)模生產(chǎn)提供有力保障。近年來(lái),石斛[8]、丹參[9]、白芨[10]、栝樓[11]等藥用植物均已初步完成了一步成苗的相關(guān)研究,從理論上簡(jiǎn)化了種苗生產(chǎn)操作流程,縮短育苗周期。然而關(guān)于半夏一步成苗的研究相對(duì)較少,目前主要以三葉半夏[12]、荊半夏[13]等作為研究對(duì)象,對(duì)其培養(yǎng)基成分優(yōu)化。本研究以半夏為材料,研究其一步成苗的適宜外植體、培養(yǎng)基配方、煉苗方法、移栽煉苗基質(zhì),以期簡(jiǎn)化半夏組織培養(yǎng)種苗生產(chǎn)流程,縮短培育周期,初步建立半夏一步成苗技術(shù),為半夏種苗組培快繁提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)用半夏塊莖來(lái)源于貴陽(yáng)市花溪區(qū)大將山半夏種植基地,經(jīng)貴州大學(xué)趙才副教授鑒定為天南星科植物半夏(Pinelliaternata)。

1.2 方 法

1.2.1半夏無(wú)菌葉柄、葉片的培養(yǎng)

選取健康半夏塊莖通過(guò)組織培養(yǎng)得到半夏組培幼苗,將組培幼苗作為外植體來(lái)源,其葉柄和葉片作為外植體,葉柄切成1 cm小段、葉片切成0.5～1.0 cm見方小塊。

1.2.2外植體及培養(yǎng)基配方篩選

以MS培養(yǎng)基(含0.1%活性炭)為基本培養(yǎng)基,采用二因素三水平完全隨機(jī)設(shè)計(jì)(表1),考察生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)半夏組培苗生長(zhǎng)的影響,將外植體接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25 ℃、2 000～2 500 lx,每天光照12 h,培養(yǎng)周期為60 d。記錄愈傷數(shù)、芽分化數(shù)、根分化數(shù)以及每顆外植體長(zhǎng)出的幼苗數(shù),并計(jì)算愈傷誘導(dǎo)率、芽分化率、根分化率等。

表1 半夏一步成苗的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑因素及水平

愈傷誘導(dǎo)率/%=(分化愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;

芽分化率/%=(具芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;

根分化率/%=(具根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;

平均每個(gè)外植體分化的幼苗數(shù)=分化出的幼苗總數(shù)/分化出幼苗的外植體數(shù);

增殖系數(shù)=分化出的幼苗總數(shù)/接種株數(shù)。

1.2.3煉苗方法篩選

將生長(zhǎng)健壯,長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗與培養(yǎng)瓶一起轉(zhuǎn)移至煉苗室,進(jìn)行閉瓶煉苗(0 d、2 d、5 d)和開瓶煉苗(3 d)處理,考察煉苗方式和時(shí)間對(duì)半夏幼苗成活率及幼苗長(zhǎng)勢(shì)的影響,各處理200瓶。煉苗環(huán)境:溫度25 ℃、濕度40%～50%、光照2 000～2 500 lx,適當(dāng)澆水。

移栽成活率/%=(成活株數(shù)/移栽株數(shù))×100%。

1.2.4移栽煉苗基質(zhì)篩選

以表2中河沙、腐殖土、蛭石三種物質(zhì)比例配制移栽基質(zhì),經(jīng)高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min后,取出,置于烘箱中105 ℃烘干10 h以上,至恒重。在煉苗盤中裝入厚約5 cm的基質(zhì),在基質(zhì)上按5 cm × 5 cm距離用木棍打孔。將上述通過(guò)煉苗且長(zhǎng)勢(shì)良好的幼苗取出,分割成一芽三根的單棵植株(芽高3 cm以上,根平均長(zhǎng)2 cm)栽入小孔內(nèi),每個(gè)處理移栽40顆小苗,3次重復(fù)。移栽煉苗環(huán)境:溫度25 ℃、濕度40%～50%、光照2 000～2 500 lx,每天光照12 h,適量補(bǔ)水,20 d后觀察組培苗移栽成活率及幼苗生長(zhǎng)情況。

表2 移栽基質(zhì)的配比設(shè)計(jì)

1.2.5移栽基質(zhì)含水量篩選

以腐殖土+河砂作為移栽基質(zhì),根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法配制移栽基質(zhì)及移栽半夏組培苗,20 d后觀察成活率及幼苗生長(zhǎng)情況。

計(jì)算最大持水量:用環(huán)刀取基質(zhì),在環(huán)刀下墊一張濾紙,用皮筋固定在環(huán)刀上,防止基質(zhì)散出。之后將環(huán)刀放在盤子里,盤中倒水,沒過(guò)濾紙即可,隔天將環(huán)刀中的基質(zhì)取出,放在已知重量的鋁盒中稱重,得到最大持水量時(shí)的土壤質(zhì)量(W1);之后將鋁盒放在烘箱中105 ℃烘至恒重(約10 h以上),稱重得到干土質(zhì)量(W2)。

最大持水量(質(zhì)量含水量)=(W1-W2)/W2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件進(jìn)行,方差分析采用IBM SPSS Statistics24軟件進(jìn)行,利用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)半夏葉柄一步成苗的影響

由表3可知,以半夏無(wú)菌苗葉柄為外植體時(shí),處理8愈傷組織誘導(dǎo)率最高,達(dá)100%,但愈傷組織能分化為幼苗的比例僅達(dá)到一半。處理7愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)81.48%,愈傷組織的成苗率也接近100%,但該處理中根系相對(duì)較少,每棵具苗外植體產(chǎn)出幼苗數(shù)為4.88株。處理2和處理5愈傷組織誘導(dǎo)率分別為77.78%和86.42%,愈傷組織的成苗率接近100%,且根系發(fā)達(dá),每顆具苗外植體能產(chǎn)出8株幼苗,為本組實(shí)驗(yàn)中的最高值,且處理5的增殖系數(shù)顯著高于其他處理(表4)。因此,處理5最適宜作為半夏無(wú)菌苗葉柄作為外植體時(shí)一步成苗的培養(yǎng)基。

表3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)半夏一步成苗的影響

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)無(wú)菌葉片一步成苗的影響

如表3所示,以半夏無(wú)菌苗葉片為外植體時(shí),處理4愈傷組織誘導(dǎo)率為86.42%,為該組實(shí)驗(yàn)最高值,愈傷組織分化成苗率接近100%,根系發(fā)達(dá),每顆具苗外植體能分化幼苗數(shù)為8.07株。處理7和處理8的愈傷組織分化成苗率也接近100%,根系發(fā)達(dá),每顆具苗外植體能分化幼苗數(shù)分別為13.58株和15.19株,然而處理7的愈傷組織誘導(dǎo)率為53.09%,低于處理8(79.01%),且處理8的增殖系數(shù)顯著高于處理7(表4)。因此,處理8最適宜作為半夏無(wú)菌苗葉片為外植體時(shí)一步成苗的培養(yǎng)基。

綜合上述兩組試驗(yàn)數(shù)據(jù),半夏無(wú)菌苗葉片作為外植體時(shí)處理8的愈傷組織誘導(dǎo)率、芽分化率、根分化率等數(shù)據(jù)與葉柄作為外植體時(shí)處理2和處理5的相似,葉片作為外植體時(shí)處理8的成苗率、增殖系數(shù)均高于葉柄為外植體的。因此,半夏無(wú)菌苗一步成苗體系中應(yīng)以葉片作為外植體,并以處理8的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比作為培養(yǎng)基配方。

2.3 煉苗時(shí)間對(duì)半夏組培苗生長(zhǎng)的影響

如表5所示,閉瓶煉苗時(shí)間對(duì)半夏組培苗成活率影響顯著且苗情差異較大。在煉苗階段,直接開瓶煉苗時(shí)半夏組培苗成活率為56%,成活的幼苗長(zhǎng)勢(shì)不佳,不宜移栽。當(dāng)閉瓶煉苗2 d、5 d再開瓶煉苗時(shí),成活率均達(dá)到100%,且幼苗長(zhǎng)勢(shì)均良好。

表5 煉苗時(shí)間對(duì)半夏組培苗成活率及苗情的影響

2.4 移栽煉苗基質(zhì)對(duì)半夏組培苗生長(zhǎng)的影響

移栽基質(zhì)的選擇影響半夏組培苗移栽成活率和苗情(表6)。3種移栽基質(zhì)對(duì)幼苗成活率和葉寬的影響無(wú)顯著差異,腐殖土+河砂作為移栽基質(zhì)時(shí)幼苗葉綠素相對(duì)含量和葉長(zhǎng)顯著低于其他處理,株高顯著低于腐殖土+蛭石處理組。腐殖土+蛭石處理組與腐殖土處理組的成活率、葉長(zhǎng)、葉寬、葉綠素相對(duì)含量等指標(biāo)差異不顯著,腐殖土+蛭石處理組的株高顯著高于腐殖土處理組。因此,腐殖土+蛭石處理組較適合作為半夏組培苗移栽基質(zhì)。

表6 移栽基質(zhì)對(duì)半夏組培苗成活率及苗情的影響

2.5 移栽煉苗基質(zhì)含水量對(duì)半夏組培苗生長(zhǎng)的影響

隨著移栽基質(zhì)含水量增加,半夏組培苗移栽成活率呈升高趨勢(shì),幼苗長(zhǎng)勢(shì)逐漸強(qiáng)壯(表7)。移栽基質(zhì)含水量為80%時(shí),成活率顯著高于其他處理,雖然該處理中半夏組培苗株高顯著低于含水量為70%的處理,但葉長(zhǎng)、葉寬、葉綠素相對(duì)含量等指標(biāo)均高于其他處理。因此,移栽基質(zhì)含水量為80%有利于半夏組培苗的生長(zhǎng)。

表7 基質(zhì)含水量對(duì)半夏組培苗成活率及苗情的影響

3 討 論

激素是植物組織培養(yǎng)基的核心組成部分,作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽分化、苗的生長(zhǎng)、生根等組培苗生長(zhǎng)各階段均起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞分裂素6-BA促進(jìn)芽的分化和生長(zhǎng),并對(duì)愈傷組織的形成具有促進(jìn)作用,生長(zhǎng)素NAA以促進(jìn)苗的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)不定根的形成為主[14],在一步苗體系中細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素共同影響組培苗的生長(zhǎng)與分化[15-16]。本研究中,綜合考慮愈傷組織誘導(dǎo)率、芽分化率、根分化率、每個(gè)外植體形成的幼苗數(shù)及增殖系數(shù)等指標(biāo),以葉片作為外植體并在培養(yǎng)基中加入1.5 mg/L NAA和1 mg/L 6-BA時(shí)半夏組培一步成苗的效率優(yōu)于其他處理。在該培養(yǎng)基處理下,愈傷組織誘導(dǎo)率雖然僅有79.01%,而芽分化率和根分化率均近100%,增殖系數(shù)達(dá)44.22。由此可見,本處理提高了半夏一步成苗的繁殖效率[12]。在該激素濃度配比中1 mg/L 6-BA的濃度相對(duì)較低,與楊璐等[17]、劉福平等[18]的研究結(jié)果一致,原因是過(guò)高濃度的細(xì)胞分裂素會(huì)抑制植物正常的生長(zhǎng)、發(fā)育。本研究中,高濃度NAA促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)不定根形成,NAA濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)不定根的誘導(dǎo)率接近100%,與李娟娟等[19]的研究結(jié)果一致。

MS培養(yǎng)基具有植物生長(zhǎng)所需的豐富營(yíng)養(yǎng),能加快愈傷組織的形成和幼苗的生長(zhǎng),是植物組織培養(yǎng)最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一。半夏組織培養(yǎng)各階段或一步成苗的大多數(shù)研究均以MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,均能達(dá)到較為理想效果,本研究也使用MS作為半夏一步成苗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基?；钚蕴家褟V泛應(yīng)用于石斛、蝴蝶蘭、藍(lán)莓等植物組織培養(yǎng),作為培養(yǎng)基添加劑可有效防止外植體的褐化、吸附植物代謝的有害物質(zhì)、促進(jìn)幼苗根系的生長(zhǎng)[20]。喻娜[21]研究認(rèn)為,添加適量活性炭有利于組織培養(yǎng)中半夏幼苗根系的生長(zhǎng),同時(shí)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),本研究在MS中添加了0.1%活性炭作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

煉苗和移栽是植物組培幼苗一步成苗體系中最后一個(gè)環(huán)節(jié)[22],煉苗時(shí)間、移栽基質(zhì)和移栽基質(zhì)含水量對(duì)半夏組培幼苗移栽的成活率及長(zhǎng)勢(shì)具有顯著影響。在本研究中,未經(jīng)開瓶煉苗的半夏組培幼苗成活率及長(zhǎng)勢(shì)顯著低于經(jīng)開瓶煉苗處理的,這可能是組培苗長(zhǎng)期在無(wú)菌環(huán)境中長(zhǎng)大,如直接移栽適應(yīng)性較差,無(wú)法適應(yīng)自然環(huán)境[23]。此外,組培苗的移栽基質(zhì)應(yīng)具備豐富營(yíng)養(yǎng)、疏松透氣、水分充足等特點(diǎn)[24],在本研究中,具有上述特征的腐殖土+蛭石(含水量為80%)更有利于半夏組培苗的移栽。