茄子自噬相關(guān)基因ATG8家族鑒定及表達(dá)分析

張靜嫻,劉 軍,周曉慧,劉松瑜,莊 勇,,楊 艷,*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,南京 210095;2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,南京 210014)

自噬(Autophagy)是真核生物中一種保守的細(xì)胞內(nèi)成分降解過程。在這個過程中,受損蛋白和細(xì)胞器等大分子可被轉(zhuǎn)運至植物細(xì)胞的液泡中,隨后被水解酶降解并回收利用[1-2]。植物自噬通常被分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和超級自噬(mega-autophagy)3類[3]。其中,巨自噬作為更為普遍更主要的形式存在,常被簡稱為自噬。它的發(fā)生主要包括雙層膜的自噬小泡(autophagosome)包裹目標(biāo)物,然后轉(zhuǎn)移至液泡中,與液泡膜融合形成單層膜的自噬小體(autophagic body),后經(jīng)液泡中水解酶降解。已有大量研究報道表明,自噬在植物生長發(fā)育和響應(yīng)各種脅迫過程中發(fā)揮重要的作用[4]。參與自噬過程的基因被統(tǒng)一命名為自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,ATG)[5]。自噬全過程由多個ATG共同參與發(fā)生,目前已在真核生物中鑒定出40多種ATG基因[6],這些ATG基因在自噬過程中發(fā)揮各自的功能。其中,ATG8基因編碼泛素類蛋白,可與磷脂乙醇胺結(jié)合,參與自噬體的延伸和成熟,在自噬體形成過程中起到重要作用,因此也通常被用作為自噬體的標(biāo)記蛋白[7]。ATG8蛋白還可作為對接平臺,通過與自噬受體的互作來促使自噬小泡進(jìn)行貨物選擇,從而使細(xì)胞選擇性地對一些受損的細(xì)胞器和蛋白聚集體等特異性降解[8]。例如,ATG8分別與自噬選擇性受體DSK2(dominant suppressor of KAR2)和RPN10(RP nonATPase subunit)互作介導(dǎo)擬南芥油菜素內(nèi)酯下游轉(zhuǎn)錄因子BES1和26s蛋白酶體的選擇性自噬降解,從而平衡干旱和缺氮脅迫下植物的生長[9-10],因其在自噬中的重要作用,目前ATG8基因已陸續(xù)在擬南芥、水稻、小麥等物種中被鑒定出來[11-13]。

茄子(SolanummelongenaL.)是中國重要的茄果類蔬菜作物。隨著茄子基因組的不斷完善,從基因組水平對茄子中重要的基因家族進(jìn)行鑒定和功能分析已成為可能。鑒于ATG8基因?qū)χ参锷L發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)的重要性,本研究從基因組水平對茄子的ATG8基因家族進(jìn)行鑒定,利用生物信息學(xué)分析其進(jìn)化關(guān)系和啟動子元件等,并對其在不同器官、冷脅迫及激素下的表達(dá)量進(jìn)行分析,為后期深入研究茄子ATG8基因的功能提供基本信息,為進(jìn)一步探究ATG8家族在茄子逆境響應(yīng)及生長發(fā)育中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時為遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試材及取樣

以‘三月茄’為試驗材料,種植于光照16 h,28 ℃,黑暗8 h,24 °C的生長室中。待植株生長至四葉一心期,將一部分植株轉(zhuǎn)移至4 ℃的生長箱中進(jìn)行冷脅迫處理,同時將另一部分植株的葉片離體浸泡在100 μmol/L ABA、2 mmol/L SA和100 μmol/L MeJA中進(jìn)行外源激素處理。對冷脅迫和激素處理按照0,3,6,12,24 h取樣,以正常條件下培養(yǎng)的茄子作為對照,不同組織器官材料取于同一發(fā)育時期的根、莖、葉、花瓣、花萼、花藥、柱頭、子房、果肉。上述所有取樣進(jìn)行3次重復(fù),取樣后立即置于液氮中,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茄子ATG8基因家族鑒定和理化分析

從茄子基因組數(shù)據(jù)庫(http://eggplant-hq.cn/Eggplant/home/index)獲得茄子所有蛋白序列。以已報道的擬南芥和番茄的ATG8蛋白序列為查詢序列,通過本地Blast比對獲得茄子ATG8家族成員,對由這2個物種BLAST獲得的蛋白序列進(jìn)行整理合并,去除重復(fù)序列,得到候選序列。將候選序列在Conserved Domains Database(CDD:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)中進(jìn)一步鑒定,去掉ATG8結(jié)構(gòu)域不完整的蛋白序列,最終獲得茄子ATG8家族成員[14]。運用在線軟件Protparam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析茄子ATG8成員分子量、等電點等理化性質(zhì)。

1.3 茄子ATG8亞家族成員生物信息學(xué)分析

利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)搜索茄子ATG8基因編碼蛋白的保守基序。根據(jù)全基因組的GFF格式的注釋文件,提取茄子ATG8基因家族成員序列中的非翻譯區(qū)、編碼序列和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)信息,通過TBtools軟件對ATG8基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖形可視化。使用MEGA11軟件中的MUSCLE方法對茄子、擬南芥和番茄ATG8家族成員進(jìn)行多序列比對,采用最大似然法生成進(jìn)化樹,設(shè)置校驗參數(shù)Bootstrap的重復(fù)次數(shù)為1 000。為了進(jìn)一步研究ATG8基因在物種間的進(jìn)化關(guān)系,利用TBtools對茄子、擬南芥和番茄之間的共線性關(guān)系進(jìn)行分析。從茄子的基因組中獲取ATG8翻譯起始位點ATG上游分析2 000 bp的序列為啟動子區(qū)域,在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站進(jìn)行啟動子順式作用元件分析,并利用TBtools繪制茄子ATG8基因啟動子順式作用元件分布圖。

1.4 茄子ATG8基因家族表達(dá)分析

采用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]對不同處理和組織的樣本RNA進(jìn)行提取。參照全式金公司的TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)進(jìn)行第一鏈的合成。根據(jù)茄子ATG8基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物(表1),采用實時熒光定量PCR儀(羅氏,瑞士)進(jìn)行qRT-PCR檢測,利用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù),確定基因的相對表達(dá)量。每個反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)。

表1 茄子ATG8基因熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 茄子ATG8基因亞家族成員鑒定

將擬南芥和番茄ATG8蛋白序列分別在茄子蛋白數(shù)據(jù)庫中比對、整理后得到7個茄子ATG8基因,根據(jù)與擬南芥和番茄ATG8基因的序列相似度分別對應(yīng)命名ATG8a～ATG8f和ATG8i。茄子ATG8基因編碼的氨基酸數(shù)在118～166 aa之間(圖1、表2),蛋白分子量介于13.56～19.11 kD之間,等電點為6.29～9.16,整體偏堿性;根據(jù)不穩(wěn)定蛋白判定標(biāo)準(zhǔn),ATG8e和ATG8f不穩(wěn)定系數(shù)小于40,為穩(wěn)定蛋白,其余均為不穩(wěn)定蛋白(表2)。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對顯示,茄子ATG8基因編碼的蛋白氨基酸序列一致性達(dá)到62.39%(圖1)。

圖1 茄子ATG8基因家族多序列比對

表2 茄子ATG8基因的基本信息

2.2 茄子ATG8 基因結(jié)構(gòu)及蛋白基序分析

ATG8基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,除了ATG8b之外,其余6個ATG8基因均具有包含5個外顯子的結(jié)構(gòu),而ATG8b有6個外顯子(圖2,A),說明茄子ATG8基因結(jié)構(gòu)較為保守。對ATG8家族蛋白序列進(jìn)行保守基序分析,共獲得3個motif,分別命名為motif 1～motif 3(圖2,B)。motif 1和motif 2高度保守,7個茄子ATG成員都含有這2個基序。motif 3也較為保守,只有ATG8i不含有motif 3,可能是ATG8i蛋白在進(jìn)化中氨基酸改變所致。將motif序列提交至線上網(wǎng)站(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對motif進(jìn)行注釋,發(fā)現(xiàn)motif 1和motif 2均為自噬蛋白ATG8類泛素(autophagy protein ATG8 ubiquitin-like),這表明了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。Motif 3是1個未知功能的基序,說明與ATG8i不同,ATG8a～ATG8f蛋白可能存在其他的功能。

圖2 茄子ATG8基因家族的基因結(jié)構(gòu)(A)和保守基序(B)分布

2.3 茄子ATG8基因進(jìn)化分析及染色體定位

為了探究ATG8基因的進(jìn)化,將7個茄子ATG8蛋白序列、7個番茄ATG8蛋白序列和9個擬南芥ATG8蛋白序列進(jìn)行多重序列比對,構(gòu)建發(fā)育樹。如圖3,A顯示,根據(jù)進(jìn)化關(guān)系,這23個ATG8基因可被分為Ⅰ類和Ⅱ類。3個物種的ATG8i和ATG8h聚類在一起,屬于第Ⅱ類。ATG8a～ATG8g聚類在1個分支,且ATG8a～ATG8d和ATG8e～ATG8f序列相似性分別更高。此外,從圖3,A可以看出SmATG8基因與SlATG8基因聚類在一起,說明番茄與茄子基因進(jìn)化關(guān)系更為保守。

圖3 茄子、番茄和擬南芥ATG8家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(A)和共線性(B)

為了進(jìn)一步研究ATG8基因在物種間的進(jìn)化關(guān)系,繪制茄子、番茄和擬南芥ATG8基因的物種間共線性圖。茄子中有7個ATG8與番茄的5個ATG8基因存在11對共線性關(guān)系。茄子中有4個ATG8與擬南芥6個ATG基因成員間存在10對共線關(guān)系,說明茄子與番茄的共線性多于擬南芥。如圖3,B所示,茄子的7個ATG8基因分布于6條染色體上,其中ATG8a分布在第4號染色體上,ATG8b分布在第2號染色體上,ATG8c分布在第3號染色體上,ATG8d分布在第7號染色體上,ATG8e和ATG8f同時分布在第8號染色體上,ATG8i則分布在第1號染色體上。因此,ATG8a和ATG8d,ATG8b和ATG8c這2對屬于片段復(fù)制基因,而ATG8e和ATG8f屬于串聯(lián)復(fù)制基因。

2.4 茄子ATG8家族順式作用元件分析

對茄子ATG8基因啟動子區(qū)進(jìn)行順式作用元件分析,結(jié)果(圖4)顯示,茄子ATG8基因家族成員啟動子區(qū)域有大量激素響應(yīng)元件。例如,除ATG8i,其他ATG8基因都含有生長素響應(yīng)元件(TGA-element或者AuxRR-core)。ATG8a、ATG8b、ATG8e、ATG8f和ATG8i均含有脫落酸響應(yīng)元件(ABRE),ATG8a、ATG8b、ATG8d、ATG8f和ATG8i均含有乙烯響應(yīng)元件(ERE),ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8f和ATG8i均含有MeJA響應(yīng)元件(CGTCA-motif或者TGACG-motif),ATG8b、ATG8d、ATG8f這3個基因均含有赤霉素響應(yīng)元件(TATC-box或者P-box),而水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)只存在于ATG8d。此外,茄子ATG8成員啟動子區(qū)也存在與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件,如參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點,厭氧脅迫響應(yīng)元件(ARE)和低溫脅迫元件(LTR)等。每個ATG8成員都至少含有1個激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件,這表明ATG8基因能夠在茄子逆境和激素響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

圖4 茄子ATG8基因啟動子順式作用元件

2.5 茄子ATG8基因家族的組織表達(dá)分析

自噬在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析了7個ATG8基因在茄子不同的組織器官中的表達(dá),以探究ATG8是否與茄子生長發(fā)育相關(guān)。以根中的表達(dá)量為對照,如圖5所示,ATG8a和ATG8e都是在花瓣、花藥、花萼和果肉中存在高表達(dá),ATG8b在花藥、花萼、柱頭和子房中表達(dá)。ATG8c在葉片、花藥和果肉中高表達(dá),在子房中低表達(dá)。ATG8d只在花瓣和花藥中高表達(dá),在其他組織中無差異表達(dá)。ATG8f在花瓣、花藥、柱頭和果肉中高表達(dá),在莖和子房中低表達(dá)。ATG8i在莖、花瓣、花藥、花萼、柱頭和果肉中高表達(dá),可見所有的茄子ATG8能夠在不同的花器官中差異表達(dá),表明其可能與茄子花發(fā)育有關(guān)。

Ro.根;St.莖;Le.葉;Pe.花瓣;An.花藥;Se.花萼;St.柱頭;Ov.子房;Fl.果肉。柱狀圖上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.6 茄子ATG8基因家族對冷脅迫和外源激素的響應(yīng)分析

茄子ATG8基因啟動子區(qū)富集了多種激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,表明茄子ATG8基因可能參與激素響應(yīng)。因此,利用qRT-PCR對ATG8基因響應(yīng)ABA、MeJA和SA進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個ATG8家族基因在不同激素處理下表達(dá)水平出現(xiàn)了波動(圖6)。其中ATG8d的表達(dá)受到這3種激素處理的抑制,其他6個ATG8基因的表達(dá)均在ABA處理后的12 h達(dá)到峰值,其中ATG8f響應(yīng)最迅速,ABA處理后3 h就受到誘導(dǎo)(圖6)。MeJA處理后除了ATG8c和ATG8d的表達(dá)受到了抑制,ATG8a和ATG8e的表達(dá)都是先降后升,ATG8f和ATG8i都是在處理后12 h有誘導(dǎo)響應(yīng),而ATG8b在處理后3 h即被誘導(dǎo)(圖6)。SA處理后,ATG8c和ATG8d的表達(dá)也受到了抑制,ATG8a、ATG8b、ATG8e、ATG8f和ATG8i的表達(dá)均受到誘導(dǎo),其中ATG8b的響應(yīng)最為劇烈,相對表達(dá)量達(dá)到了30倍,ATG8f響應(yīng)最晚,在處理后24 h才開始被誘導(dǎo),而ATG8i的表達(dá)則是先降后升,在12 h達(dá)到峰值(圖6)。

圖6 外源ABA、MeJA和SA處理后茄子ATG8基因的表達(dá)量熱圖

茄子是主要的設(shè)施栽培蔬菜作物,其生長過程中經(jīng)常遭遇冷害影響。自噬能夠調(diào)控植物耐冷性,因此,為了探究ATG8基因是否參與茄子耐冷過程,本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析ATG8基因?qū)涿{迫的響應(yīng)。如圖7示,除了ATG8b的表達(dá)受到冷脅迫抑制,其他6個ATG8基因的表達(dá)在不同的程度上均受到了冷脅迫的誘導(dǎo),且對冷脅迫的響應(yīng)迅速,在冷處理后3 h的表達(dá)量產(chǎn)生顯著變化。其中ATG8a的表達(dá)在冷處理3 h即達(dá)到峰值,隨后下降。ATG8c、ATG8d、ATG8e、ATG8f和ATG8i這5個ATG8基因在冷處理的表達(dá)模式為先升后降再升。7個ATG8基因呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,表明茄子ATG8在冷處理的不同階段表達(dá),對冷處理響應(yīng)的分工不同。

圖7 冷處理后茄子ATG8基因的表達(dá)量熱圖

3 討 論

由于ATG8功能的重要性,植物中已陸續(xù)有對ATG8基因鑒定的報道。雖然最早發(fā)現(xiàn)自噬存在的釀酒酵母中ATG8成員數(shù)量只有1個,但為了適應(yīng)不利和復(fù)雜的環(huán)境,ATG8基因家族已通過全基因組復(fù)制在植物中經(jīng)歷了大規(guī)模的擴(kuò)張[15]。因此,植物ATG8蛋白家族已從單個成員擴(kuò)張到多個,例如玉米ATG8家族成員數(shù)量為5個[16],水稻ATG8家族成員數(shù)量有7個[12],擬南芥ATG8家族成員數(shù)量有9個[11],香蕉有10個ATG8家族成員[17],而小麥有比較多的家族成員,數(shù)量為13個[13]。本研究從茄子基因組中鑒定出7個ATG8基因,說明茄子為適應(yīng)不利環(huán)境也進(jìn)行了ATG8基因家族的擴(kuò)張。由于ATG8蛋白能選擇各種目標(biāo)物,因此茄子ATG8的擴(kuò)張可能也導(dǎo)致了茄子選擇性自噬的多樣性。

本研究鑒定到的茄子ATG8基因結(jié)構(gòu)相對簡單一致,除ATG8b含有6個外顯子,其余6個ATG8基因都只含有5個外顯子。茄子7個ATG8基因編碼的蛋白含有的保守基序也基本一致。其中注釋為自噬蛋白ATG8類泛素的motif 1和motif 2存在于所有ATG8蛋白中,且排列順序也高度一致。這2個高度保守的motif 是鑒定ATG8家族成員的重要依據(jù)。僅ATG8i不含有未知功能的motif 3,因而ATG8i發(fā)揮的功能可能沒有其他ATG8蛋白的多樣化。研究表明,基因復(fù)制有助于基因家族的形成和成員數(shù)量擴(kuò)增[18],而根據(jù)基因在染色體上的位置可以對旁系同源基因?qū)M(jìn)行基因復(fù)制事件的分類[19]。本研究從7個ATG8基因共鑒定出3對旁系同源基因ATG8a和ATG8d,ATG8b和ATG8c以及ATG8e和ATG8f,其中1對串聯(lián)復(fù)制2對基因片段復(fù)制。與這3對復(fù)制基因不同的是,存在1個單獨的非復(fù)制基因ATG8i。茄子ATG8i與擬南芥的ATG8i和ATG8h及番茄的ATG8h進(jìn)化關(guān)系較近,同屬于第二類,這個結(jié)果與Seo等[20]對18種植物的ATG8和ATG4進(jìn)化分析結(jié)果一致,即植物ATG8i和ATG8h聚類在一起,而ATG8a-ATG8d,ATG8e-ATG8g分別聚在一起。蛋白基序分析結(jié)果、進(jìn)化樹和共線性的結(jié)果高度一致,這表明茄子ATG8i可能經(jīng)歷了快速的進(jìn)化。

茄子、番茄和擬南芥3種作物ATG8蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以初步揭示茄子ATG8蛋白的功能。聚類分析顯示,茄子ATG8基因與番茄中相應(yīng)的家族成員位于同一分支,進(jìn)化關(guān)系很近。一般情況下,同一分支上的家族蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域和功能域,因此功能也趨于保守[21]。番茄BAG8和BAG9沉默植株對冷的敏感性增強(qiáng),ATG8a表達(dá)受到抑制,泛素化蛋白積累增多,說明番茄ATG8a參與調(diào)控番茄耐冷性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)與番茄ATG8a高度同源的茄子ATG8a能對冷脅迫做出及時的響應(yīng)。ATG8a啟動子區(qū)雖然不含有低溫響應(yīng)元件,但包含2個WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的W-box。Yang等[23]利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默證實WRKY26正調(diào)控茄子耐冷性。因此,茄子ATG8a極有可能受到WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控參與茄子耐冷。此外,番茄中已報道ATG8a、ATG8b、ATG8c、ATG8e和ATG8f能依賴于油菜素內(nèi)酯BR的含量被冷脅迫顯著誘導(dǎo)[24]。同屬于茄科作物,茄子ATG8基因在植株遭受冷脅迫后確實都能有顯著表達(dá),說明茄子ATG8可能在茄子響應(yīng)冷脅迫中存在生物學(xué)功能。茄子屬于喜溫作物[25],因此研究ATG8對冷脅迫的響應(yīng),可為茄子耐冷遺傳改良提供基因資源?；虻慕M織表達(dá)特征與其在植物生長發(fā)育中的功能緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)茄子所有的ATG8基因在花藥中都特異性高表達(dá)。Takamitsu等[26]研究發(fā)現(xiàn),自噬是水稻花藥代謝調(diào)節(jié)和營養(yǎng)供應(yīng)所必需的。因此,ATG8基因也可能參與了茄子花藥發(fā)育過程。7個ATG8基因分別在不同的花器官中都存在較高水平的表達(dá),說明茄子ATG8在不同部位的花器官發(fā)育中具有生物學(xué)功能。